本发明涉及生物检测技术领域,尤其涉及一种诊断试剂盒及其在制备帕金森病临床诊断产品上的应用。
背景技术:
帕金森病(pd)是一种中枢神经系统变性疾病,临床表现主要包括静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍。pd病理学的关键特征包括中枢神经系统(cns)黑质纹状体的多巴胺能神经元(da)的丢失、小胶质细胞异常激活和神经元的α-突触核蛋白(α-synuclein)的沉积。
目前,帕金森病诊断的金标准需依靠脑活检,而传统临床诊断主要依靠病史、症状、体征和影像学的综合评估。传统的临床诊断评估方式存在着许多不足之处。
首先,依靠传统pd的临床诊断系统,在患者表现出症状、体征时,黑质纹状体区的da神经元已经大部分丢失,已错过早期干预和保护神经元的时机。其次,传统临床诊断系统存在误诊率高,确诊需要时间长等缺点。
为了克服传统诊断方式的缺陷,可以选择使用合适的生物学标记物来实现pd的早期诊断、提高pd诊断的准确度和敏感度。
其中,α-突触核蛋白是当前候选pd诊断标记物的热门分子。α-突触核蛋白可在pd患者肠道、消化腺体和皮肤中异常沉积。但在pd早期诊断中,脑脊液α-突触核蛋白作为诊断标记物的准确度和敏感度不理想,且个体差异范围大。
另外,α-突触核蛋白存在多种形式,包括存在单体,不同程度聚合的寡聚体如二聚体、三聚体、四聚体等。太多的存在形式加大了α-突触核蛋白临床应用的难度。
因此,人们迫切需要提供理想的生物标志物来辅助完成pd的早期临床诊断。
技术实现要素:
鉴于上述现有技术的不足之处,本发明的目的在于提供一种诊断试剂盒及其在帕金森病诊断产品上的应用,旨在解决现有技术中pd早期诊断效果不佳的问题。
为了达到上述目的,本发明实施例第一方面提供一种诊断试剂盒。该诊断试剂盒包括:特异性抗体以及一种或者多种检测试剂;所述特异性抗体具有与trem2蛋白特异性结合的能力,所述检测试剂用于与所述特异性抗体配合,检测样品的trem2基因表达水平。
可选地,所述特异性抗体选自单克隆抗体和/或多克隆抗体。
可选地,所述样品选自人的脑脊液和血液。
可选地,所述诊断试剂盒为免疫检测试剂盒;由所述检测试剂和所述特异性抗体,通过免疫检测的方法,定量检测所述样品中的水溶性trem2蛋白。
可选地,所述trem2蛋白为trem2基因的表达产物,包括可溶性的人trem2蛋白以及人trem2蛋白的功能等同物。
可选地,所述trem2蛋白选自如下蛋白质中的一种或者多种:
(1)如seqidno.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(2)由seqidno.1所示的氨基酸序列衍生的,并且具有与seqidno.1所示的氨基酸序列具有相同的功能的蛋白质;
(3)与seqidno.1所示的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。
可选地,所述由seqidno.1所示的氨基酸序列衍生的,并且具有与seqidno.1所示的氨基酸序列具有相同的功能的蛋白质,具体包括:
将seqidno.1所示的氨基酸序列通过一个或者多个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加而衍生的蛋白质。
可选地,所述取代和/或缺失和/或添加的氨基酸数量为1-50个。
可选地,与seqidno.1所示的氨基酸序列具有90%-95%以上同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。
本发明实施例第二方面提供一种如上所述的诊断试剂盒在制备帕金森病临床诊断产品上的应用。
本发明实施例提供的检测试剂盒以trem2蛋白作为pd早期诊断的生物标志物。其与传统的帕金森病的诊断方法相比,具有及时性、特异性和灵敏性的优点,可以在疾病早期及时知晓疾病风险,并针对风险高低,采取相应的预防和治疗措施,有利于提高病人的治疗效果。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明,这些示例性说明并不构成对实施例的限定,附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件,除非有特别申明,附图中的图不构成比例限制
图1为本发明实施例1的对照组的血浆可溶性trem2蛋白与突触核蛋白的相关关系示意图;
图2为本发明实施例1的对照组的脑脊液可溶性trem2蛋白与突触核蛋白的相关关系示意图;
图3为本发明实施例1的脑脊液可溶性trem2蛋白与突触核蛋白水平的相关关系示意图;
图4为本发明实施例1的血浆可溶性trem2蛋白与突触核蛋白水平的相关关系示意图;
图5为本发明实施例1的脑脊液可溶性trem2水平鉴别pd与正常老年人的roc曲线;
图6为本发明实施例1的脑脊液可溶性trem2水平鉴别pd与正常老年人的灵敏度和准确度示意图。
人trem2蛋白的氨基酸序列为:meplrllillfvtelsgahnttvfqgvagqslqvscpydsmkhwgrrkawcrqlgekgpcqrvvsthnlwllsflrrwngstaitddtlggtltitlrnlqphdaglyqcqslhgseadtlrkvlvevladpldhrdagdlwfpgesesfedahvehsisrsllegeipfpptsillllaciflikilaasalwaaawhgqkpgthppseldcghdpgyqlqtlpglrdt(seqidno.1)
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确,以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
除非另有说明,否则本说明书中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。
本发明实施例中揭露的数值及其数值范围是近似值,而并非确定值。在误差或者实验条件允许的情况下,可以包括在误差范围内的所有值。本发明实施例中提供的数值范围用于表示在混合物中的组分的相对量以及其他方法实施例中列举的温度或者其他参数的范围。
在本说明书中,“诊断帕金森病(pd)”或者“评估帕金森病”既包括判断受试者是否已经患有帕金森病、也包括判断受试者是否存在患有帕金森病的风险。从疾病的状态变化来分,可以包括疾病的缓解以及疾病的完全治愈等情况。
如背景技术中所记载的,α-突触核蛋白被认为是pd的致病物质。α-突触核蛋白自身聚合能力强,可以形成比α-突触核蛋白单体毒性更强的寡聚体和纤维。因此,判断一种基因或其表达产物是否与帕金森病之间的相关关系可以通过检测基因或其表达产物与α-突触核蛋白之间的相互关系来间接的确定。
为了实现诊断或评估帕金森病,申请人创造性的提供了一种诊断试剂盒。该诊断试剂盒包括:特异性抗体以及一种或者多种检测试剂。
其中,所述特异性抗体具有与trem2蛋白特异性结合的能力,所述检测试剂用于与所述特异性抗体配合,检测样品的trem2基因表达水平。
trem2是小胶质细胞的特异性受体,其可以辅助调控小胶质细胞吞噬大脑异常蛋白(包括异常α-突触核蛋白)的功能。申请人经过实验证实,其与异常α-突触核蛋白之间具有一定的相关性,可以作为pd早期诊断的分子标志物并且不存在α-突触核蛋白所面临的一些实际应用问题。
在本说明书中,术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链(每对具有一条“轻”(l)链和一条“重”(h)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。
在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“j”区连接,重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“d”区。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。
重链恒定区由3个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。
vh和vl区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(cdr)),其间散布有较保守的称为构架区(fr)的区域。各vh和vl由按下列顺序:fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。各重链/轻链对的可变区(vh和vl)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循kabatsequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987and1991)),或chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917;chothia等人(1989)nature342:878-883的定义。
在本说明书中,所述特异性抗体不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。该特异性抗体还可以是不同种型的抗体,例如,igg(例如,igg1,igg2,igg3或igg4亚型),iga1,iga2,igd,ige或igm抗体。
在本实施例中,特异性抗体的特异性结合能力来自于“抗原结合部分”。该抗原结合部分是指全长抗体的一个或多个部分,所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如,trem2)的能力与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。
具体可通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些实施例中,抗原结合部分包括fabfab'、f(ab')2、fd、fv、dab和互补决定区(cdr)片段、单链抗体(例如,scfv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽,其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分
应当说明的是,该特异性抗体或者其片段只需要能够保留与trem2特异性结合的能力即可(即抗原结合部分)。本领域技术人员可以根据实际情况的需要,选择使用任何合适的方法或者技术手段来制备获得所述特异性抗体或者其片段。
基于本发明实施例公开的发明思想,本领域技术人员可以应用该诊断试剂盒,特异性的定量检测trem2蛋白或者trem2基因的表达水平用以辅助诊断pd,评估罹患帕金森病的风险。
在较佳的实施例中,可以同时检测被测试者脑脊液和外周血中的trem2蛋白,并根据脑脊液trem2水平和外周血trem2水平是否正常来帮助判断cns中小胶质细胞的状态和α-突触核蛋白的情况,辅助诊断被测试者罹患pd的风险。
trem2的胞外可溶性片段(solubletrem2,strem2)可以在脑脊液和外周血中被检测到。脑脊液中的strem2水平与中枢神经系统异常蛋白质水平密切相关,而外周血的strem2水平更多的反映外周系统中单核巨噬细胞的改变。
换言之,该诊断试剂盒的样品来自于待测患者的脑脊液和血液。诊断试剂盒可以采用相同或者不同的方法同时对脑脊液和血液中的trem2蛋白进行检测。
与单独检测外周血或脑脊液的trem2蛋白量或者基因表达水平的方式相比,单独检测时往往由于外周单核巨噬细胞的影响无法正确反应中枢神经系统情况,无法准确评估颅内α-突触核蛋白和颅内病变。而同时检测脑脊液和血液样品的方式可以获得颅内α-突触核蛋白和颅内病变更为准确的评估结果。
应当说明的是,本发明实施例提供的诊断试剂盒具体可以基于任何合适的原理并采用任何合适的方式实现对trem2蛋白的定量检测。任何基于对trem2蛋白进行特异性检测,用以进行pd早期诊断的试剂盒或者相关的检测设备、装置或其试剂组合均属于本发明公开的诊断试剂盒的其中一种实现形式。
在一些实施例中,所述诊断试剂盒可以为免疫检测试剂盒。所述检测试剂和所述特异性抗体,通过酶联免疫检测的方法,定量检测所述样品中的水溶性trem2蛋白。
换言之,诊断试剂盒内可以包含有与酶联免疫相适配的多种试剂,相互配合以完成对trem2的检测。当然,在酶联免疫过程中,具体使用的检测试剂是为本领域技术人员所熟知的,可以根据实际情况的需要而选择使用合适的试剂。
在一些实施例中,所述trem2蛋白为trem2基因的表达产物,含有与帕金森病相关的功能域,例如可以包括可溶性的人trem2蛋白以及人trem2蛋白的功能等同物。
该功能等同物是具有相同或者近似功能的多肽,包括但不限于人trem2蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段,或其活性衍生物,等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人trem2的dna杂交的dna所编码的蛋白质等。
具体的,所述trem2蛋白选自如下三种蛋白质中的一种或者多种:
(1)如seqidno.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
(2)由seqidno.1所示的氨基酸序列衍生的,并且具有与seqidno.1所示的氨基酸序列具有相同的功能的蛋白质。
在一些实施例中,该衍生的具有相同功能的蛋白质可以是将seqidno.1所示的氨基酸序列通过一个或者多个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加而衍生的蛋白质。
典型的,所述取代和/或缺失和/或添加的氨基酸数量为1-50个。较佳的是,可以控制在1-30个之间。更佳的是选自1-20个。在最佳实施例中,控制在1-10个氨基酸。
(3)与seqidno.1所示的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。
同源性又可以被称为序列同一性,表明了两个氨基酸序列之间的相近程度。在较佳的实施例中,可以是具有与seqidno.1所示的氨基酸序列90%-95%以上同源性的氨基酸序列。在另一些实施例中,具体可以选择是具有与seqidno.1所示的氨基酸序列96%、97%、98%、99%同源性的氨基酸序列构成的多肽。
应当说明的是,特定蛋白质中的一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人可以理解,改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰。
蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质,提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
举例而言,trem2蛋白的融合蛋白是通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质。在本发明实施例中,对于与trem2蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制,只要所得的融合蛋白保留trem2蛋白的生物学活性即可。
在另一些实施例中,本发明实施例提供的trem2蛋白还包括对seqidno.1所示的氨基酸序列的非保守修饰,只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留trem2蛋白的生物学活性即可。典型的,在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目可以是10个或者更少,例如6个或者更少,例如3个或者更少。
在本发明实施例提供了通过脑脊液和外周血中的总蛋白来进行trem2基因差异表达的发明思路,揭示了trem2蛋白水平与帕金森病的相关性。本领域技术人员可以理解,脑组织中的细胞表达trem2会脱落到脑脊液中进行循环,即可溶性trem2蛋白,因此脑脊液中可溶性trem2水平可反应脑组织中trem2基因的表达情况。
由此,通过本发明实施例提供的诊断试剂盒,可对脑脊液和外周血的可溶性trem2基因的表达水平进行检测,并进一步用于判断受试者是否患有帕金森病。
本发明实施例提供的诊断试剂盒可以同时检测受试者脑脊液和外周血中trem2的蛋白水平,可以作为一种pd临床诊断产品使用,用于判断受试者是否患有帕金森病或者判断受试者是否存在患有帕金森病的风险,从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
以下结合具体实例,详细描述本发明实施例提供的诊断试剂盒及其在pd早期诊断上的使用效果。应当说明的是,为了陈述简便,在具体实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如sambrook等人,分子克隆:实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件,或按照试剂或者设备制造厂商所建议的条件执行。
实施例1:
1)外周血和脑脊液样本的收集:
作为实验组的pd患者来自广州医科大学附属第一医院,共50例。年龄介乎57-66岁,所有病例被诊断为pd,其诊断标准参照帕金森病的uk脑库临床诊断标准。
对照组共40例,选自广州医科大学附属第一医院常规体检人群,所有入试者均排除血脂代谢、神经系统慢性退行性疾病等疾病,年龄介乎55-68岁。
所有研究对象均已签署了对该检测项目的知情同意书,并且提供了外周血和脑脊液用于基因的检测。
2)构建测定脑脊液和血液可溶性trme2蛋白的检测试剂盒:
21)使用两种不同的针对人trme2蛋白的细胞外部分的单克隆抗trme2抗体(使用抗人trme2单克隆抗体作为捕获抗体,使用生物素化小鼠抗人trme2单克隆抗体作为检测抗体)定量测定可溶性trme2的含量。
22)在96孔检测板上捕获抗体以2.0μg/ml的最终浓度在pbs缓冲液中室温(rt)包埋过夜。
23)用washbuffer(0.05%tween20inpbs,ph=7.2)清洗3遍后,在25℃条件下,用reagentdiluents(1%bsainpbs)将检测板封闭1h。
3)构建测定突触核蛋白的检测试剂盒:
31)用两种不同对人突触核蛋白蛋白的单克隆抗trme2抗体(使用抗人突触核蛋白单克隆抗体作为捕获抗体,使用生物素化小鼠抗人突触核蛋白单克隆抗体作为检测抗体)定量测定突触核蛋白的含量。
32)在96孔检测板上捕获抗体以4.0μg/ml的最终浓度在pbs缓冲液中室温包埋过夜。
33)用washbuffer(0.05%tween20inpbs,ph=7.2)清洗3遍后,在25℃条件下,用reagentdiluents(1%bsainpbs)将检测板封闭1h。
4)血清和脑脊液中可溶性trme2的测定(所有试验中均使用可溶性人trme2-fc和人a-synuclein-fc作为标准品):
41)取全血或脑脊液250μl(或0.25g)至rnase-free过滤柱中,13000rpm离心2分钟,收集上清液。
42)在包被待测板中加入100μl新鲜复温好的csf、血清和标准品室温在孵育2h,用washbuffer清洗后加入至100μl终浓度为可溶性trme2蛋白的检测抗体(终浓度:35.0ng/ml)和a-synuclein检测抗体(终浓度:25.0ng/ml)室温孵育2h。
43)用washbuffer清洗后,加入100μl辣根过氧化物酶标记的streptavidin在室温下避光孵育20min。
44)用washbuffer清洗后,加入100μlsubstratesolution(r&dcatalog#dy999)在室温下避光孵育20min。
45)通过添加50μl2n硫酸(r&dcatalog#dy994)来中止颜色的发展。
46)在450纳米处测定每孔的od值,同时采用540纳米处测定的od值来校正。
5)统计方法:
每个实验重复3次,数据都是以平均值±标准差的方式来表示,采用spss21.0统计软件进行统计分析。两者之间的差异采用t检验,认为当p<0.05时具有统计学意义。
6)实验结果:
如图1所示,与正常人群相比,对照组血液可溶性trem2和突触核蛋白水平有升高趋势,差异无统计学意义(p<0.05)。
如图2所示,与正常人群相比,对照组脑脊液可溶性trem2突触核蛋白的水平显著升高,差异有统计学意义(p<0.05)。
如图3所示,脑脊液可溶性trem2蛋白量和突触核蛋白水平呈正相关,差异有统计学意义(p<0.05)。
如图4所示,血浆可溶性trem2和突触核蛋白水平呈正相关,差异无统计学意义(p<0.05)。
如图5所示,脑脊液可溶性trem2水平鉴别pd与正常老年人的roc曲线(auc=0.92)。
如图6所示,脑脊液的可溶性trem2用作pd诊断时的灵敏度和准确度示意图。
通过以上实验结果显示,与正常人群相比,帕金森病患者脑脊液的可溶性trem2水平增高,外周血中可溶性trem2水平无显著关系,表明通过测定受试者脑脊液和血液中可溶性trem2的水平有助于判断受试者罹患帕金森病的风险。由此,可以将trem2作为评估pd病症的分子标志物。
本发明实施例还提供了一种诊断试剂盒及其应用。该诊断试剂盒同时定量检测外周血和脑脊液trem2蛋白,通过trem2基因的表达水平来评估受试者罹患帕金森病风险,提高帕金森病的临床诊治水平。
可以理解的是,对本领域普通技术人员来说,可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变,而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
序列表
<120>基于trem2的诊断试剂盒及其在帕金森病诊断产品上的应用
<141>2019-05-29
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>230
<212>prt
<213>homosapiens
<400>1
metgluproleuargleuleuileleuleuphevalthrgluleuser
151015
glyalahisasnthrthrvalpheglnglyvalalaglyglnserleu
202530
glnvalsercysprotyraspsermetlyshistrpglyargarglys
354045
alatrpcysargglnleuglyglulysglyprocysglnargvalval
505560
serthrhisasnleutrpleuleuserpheleuargargtrpasngly
65707580
serthralailethraspaspthrleuglyglythrleuthrilethr
859095
leuargasnleuglnprohisaspalaglyleutyrglncysglnser
100105110
leuhisglyserglualaaspthrleuarglysvalleuvalgluval
115120125
leualaaspproleuasphisargaspalaglyaspleutrpphepro
130135140
glyglusergluserphegluaspalahisvalgluhisserileser
145150155160
argserleuleugluglygluilepropheproprothrserileleu
165170175
leuleuleualacysilepheleuilelysileleualaalaserala
180185190
leutrpalaalaalatrphisglyglnlysproglythrhispropro
195200205
sergluleuaspcysglyhisaspproglytyrglnleuglnthrleu
210215220
proglyleuargaspthr
225230