本发明属于免疫化学检测
技术领域：
，涉及到免疫荧光检测方法，特别是牛乳中霉菌毒素及重金属快速量子点免疫荧光检测方法。
背景技术：
：黄曲霉毒素是主要由黄曲霉寄生曲霉产生的次生代谢产物，是霉菌毒素中毒性最大且对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。黄曲霉毒素主要有b1、b2、g1、g2、m1和m2等几种。人或其它哺乳类动物食用被黄曲霉毒素b1污染的食物或饲料后，会将其代谢产生黄曲霉毒素m1。黄曲霉毒素m1有很强的致癌性和致突变性，对人及动物肝脏组织有破坏作用，可导致肝癌甚至死亡，所以对牛乳中霉菌毒素含量的检测至关重要。目前常用的黄曲霉毒素m1检测方法有确证法和快速筛查法两类。确证法灵敏度高，可定量检测，但需要昂贵的仪器和熟练的操作人员，检测时间长，样品前处理也较复杂，尤其是每次检测操作人员都要接触剧毒的标准品，所以无法用于基层或现场监控。快速筛查法成本低，使用方便快速，便于基层使用和现场使用，但其只能定性检测，无法定量。目前环境中的重金属污染很严重，铅、汞、镉、铬等会损害人的神经系统和骨骼，还会引起高血压等疾病，所以对牛乳中重金属含量的检测也至关重要。目前常用的牛乳中重金属的检测方法主要是：样品经微波消解仪等方法消解后，用石墨炉原子吸收光谱法进行测定；但是原子吸收光谱仪价格昂贵，不利于推广。技术实现要素：本发明为了克服现有技术的缺陷，设计了牛乳中霉菌毒素及重金属快速量子点免疫荧光检测方法，使用时简便易操作，操作时间短，检测结果读取快速，检测限低，精确度高，检测成本低，操作人员不需要直接接触剧毒物品，降低了安全隐患，可以推广应用。本发明所采取的具体技术方案是：牛乳中霉菌毒素及重金属快速量子点免疫荧光检测方法，关键在于，所述的方法包括以下步骤：a、牛乳的预处理：将牛乳样品与稀释液均质混匀，进行离心处理，然后取上清液作为样品溶液，备用；将牛乳样品进行消解，然后与螯合剂混合，形成的螯合物分离出来备用；b、样品滴加：选择与待测黄曲霉毒素类型相匹配的黄曲霉毒素检测卡条，将样品溶液滴加到黄曲霉毒素检测卡条上，黄曲霉毒素检测卡条上量子点标记的黄曲霉毒素抗体会与样品溶液中的黄曲霉毒素结合，所得结合物先与检测线处的黄曲霉毒素检测抗原结合，然后与控制线处的二抗结合，使量子点在黄曲霉毒素检测卡条的检测线和控制线处聚集；选择与待测重金属类型相匹配的重金属检测卡条，将螯合物滴加到重金属检测卡条上，重金属检测卡条上量子点标记的螯合物的抗体会与螯合物结合，所得结合物先与检测线处的螯合物抗原结合，然后与控制线处的二抗结合，使量子点在重金属检测卡条的检测线和控制线处聚集；c、测定：利用荧光分析仪读取黄曲霉毒素检测卡条检测线、控制线处的荧光强度，分别记为t1、c1；利用荧光分析仪读取重金属检测卡条检测线、控制线处的荧光强度，分别记为t2、c2；d、结果计算：荧光分析仪根据计算得出的t1/c1值及其内置的标准曲线即可计算出牛乳中黄曲霉毒素的含量；荧光分析仪根据计算得出的t2/c2值及其内置的标准曲线即可计算出牛乳中重金属的含量。步骤a中所用的稀释液为水-乙腈溶液，v(乙腈)：v(水)＝1：1。步骤a中，v(牛乳样品)：v(稀释液)＝2：(4-6)。步骤a中的离心处理是指，以4500-5500r/min的转速持续10-15min。步骤b中黄曲霉毒素检测卡条和重金属检测卡条的控制线处喷涂的二抗都是羊抗鼠二抗。本发明的有益效果是：利用荧光侧向免疫层析原理，使用量子点作为荧光底物，量子点与抗原、抗体结合，通过检测量子点的荧光信号，计算牛乳中霉菌毒素和重金属的含量，较传统荧光底物发射荧光的亮度高，发光稳定性好，可以提高检测的灵敏性。量子点在荧光分析仪内置光源激发后会发荧光，利用荧光分析仪来读取检测线、控制线处的荧光强度并计算牛乳中霉菌毒素和重金属的含量，操作人员不需要绘制标准曲线，每次检测使用同一内置的标准曲线，操作更加简便，可以避免剧毒性标准品对检测人员的伤害。检测霉菌毒素时，只需要将牛乳样品与稀释液均质混匀，然后进行离心处理，取上清液作为样品溶液进行检测即可，操作简单。本发明的检测方法，使用时简便易操作，操作时间短，检测结果读取快速，检测限低，精确度高，检测成本低，操作人员不需要直接接触剧毒物品，降低了安全隐患，可以推广应用。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作详细说明：一、具体实施例实施例1、牛乳中黄曲霉毒素m1的量子点免疫荧光检测方法，包括以下步骤：a、牛乳的预处理：将牛乳样品与稀释液加入到离心管中均质混匀，以5200r/min的转速持续12min进行离心处理，然后取上清液作为样品溶液，备用；其中，稀释液为水-乙腈溶液，v(乙腈)：v(水)＝1：1，v(牛乳样品)：v(稀释液)＝2：5。b、样品滴加：选择与黄曲霉毒素m1相匹配的黄曲霉毒素m1检测卡条，黄曲霉毒素m1检测卡条包括在pvc板上端面由一端向另一端依次设置的样品垫、nc膜和吸水纸，样品垫和吸水纸靠近nc膜的一端都向上弯曲且固定在nc膜上表面，将样品溶液滴加到黄曲霉毒素m1检测卡条的样品垫上，位于黄曲霉毒素m1检测卡条样品垫上的量子点标记的黄曲霉毒素m1抗体会与样品溶液中的黄曲霉毒素结合，所得结合物沿着nc膜向吸水纸方向毛细运动，先与nc膜上检测线处的黄曲霉毒素m1检测抗原结合，然后与nc膜上控制线处的羊抗鼠二抗结合，使量子点在黄曲霉毒素m1检测卡条的检测线和控制线处聚集；c、测定：利用荧光分析仪读取黄曲霉毒素m1检测卡条检测线、控制线处的荧光强度，分别记为t1、c1；d、结果计算：荧光分析仪根据计算得出的t1/c1值及其内置的标准曲线即可计算出牛乳中黄曲霉毒素m1的含量，标准曲线为y＝ax+b，a、b为已知数，只需要将x＝t1/c1代入上述标准曲线，即可计算出y的值即牛乳中黄曲霉毒素m1的含量。实施例2、牛乳中重金属铅快速量子点免疫荧光检测方法，包括以下步骤：a、牛乳的预处理：称取3.00ml牛乳样品于聚四氟乙烯消解罐中，加入5ml硝酸，加盖固定，放入微波消解仪中进行消解，微波消解的升温程序如下面的表1所示：表1微波消解升温程序步骤设定温度(℃)升温时间(min)恒温时间(min)11205521605103180510冷却后取出聚四氟乙烯消解罐，在电热板上于140-160℃赶酸至1ml，消解罐放冷后，将消化液转移至10ml容量瓶中，用少量水洗涤消解罐2-3次，合并洗涤液于容量瓶中并用水定容至刻度，混匀得消解牛乳，然后将消解牛乳与螯合剂edta(乙二胺四乙酸)混合，螯合剂edta的质量是消解牛乳质量的0.1-1％，消解牛乳中的重金属铅离子与螯合剂结合后形成的螯合物分离出来备用；b、样品滴加：选择与重金属铅相匹配的重金属铅检测卡条，重金属铅检测卡条包括在pv控制板上端面由一端向另一端依次设置的样品垫、n控制膜和吸水纸，样品垫和吸水纸靠近n控制膜的一端都向上弯曲且固定在n控制膜上表面，将螯合物滴加到重金属铅检测卡条的样品垫上，位于重金属铅检测卡条样品垫上的量子点标记的螯合物的抗体会与螯合物结合，所得结合物沿着n控制膜向吸水纸方向毛细运动，先与n控制膜上检测线处的螯合物抗原结合，然后与n控制膜上控制线处的羊抗鼠二抗结合，使量子点在重金属铅检测卡条的检测线和控制线处聚集；c、测定：利用荧光分析仪读取重金属铅检测卡条检测线、控制线处的荧光强度，分别记为t2、c2；d、结果计算：荧光分析仪根据计算得出的t2/c2值及其内置的标准曲线即可计算出与重金属铅的螯合物结合的量子点的量，从而得出牛乳中重金属铅的含量，标准曲线为y＝ax+b，a、b为已知数，只需要将x＝t2/c2代入上述标准曲线，即可计算出y的值即牛乳中重金属铅的含量。二、试验验证(1)为了验证本发明的检测性能，将用国标法测定黄曲霉毒素m1的含量为零的牛乳样品均分成三组，分别为第一组、第二组、第三组，每一组的牛乳样品又均分成六份，同一组的六份牛乳样品中分别添加黄曲霉毒素m1的浓度为0.05μg/kg、0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.3μg/kg、0.4μg/kg、0.5μg/kg的标准品，然后使用实施例1的方法对18份牛乳样品进行检测，检测结果如下面的表2所示：表218份牛乳样品中黄曲霉毒素m1的含量由表2中的数据可知，利用实施例1的方法检测出的黄曲霉毒素m1的含量与黄曲霉毒素m1添加量之间的误差较小，平均回收率达到96.67％以上，最高可以达到99.73％。(2)为了验证本发明的检测性能，将用国标法测定黄曲霉毒素b1的含量为零的牛乳样品均分成三组，分别为第四组、第五组、第六组，每一组的牛乳样品又均分成六份，同一组的六份牛乳样品中分别添加黄曲霉毒素b1的浓度为0.05μg/kg、0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.3μg/kg、0.4μg/kg、0.5μg/kg的标准品，然后使用实施例1的方法对18份牛乳样品进行检测，检测结果如下面的表3所示：表318份牛乳样品中黄曲霉毒素b1的含量由表3中的数据可知，利用实施例1的方法检测出的黄曲霉毒素b1的含量与黄曲霉毒素b1添加量之间的误差较小，平均回收率达到98.00％以上，最高可以达到99.53％。(3)为了验证本发明的检测性能，将用国标法测定重金属铅的含量为零的牛乳样品均分成三组，分别为第七组、第八组、第九组，每一组的牛乳样品又均分成六份，同一组的六份牛乳样品中分别添加重金属铅的浓度为0.05μg/kg、0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.3μg/kg、0.4μg/kg、0.5μg/kg的标准品，然后使用实施例2的方法对18份牛乳样品进行检测，检测结果如下面的表4所示：表418份牛乳样品中重金属铅的含量由表4中的数据可知，利用实施例2的方法检测出的重金属铅的含量与重金属铅添加量之间的误差较小，平均回收率达到98.33％以上，最高可以达到99.87％。综上所述，本发明的检测方法使用时简便易操作，操作时间短，检测结果读取快速，检测限低，精确度高，检测成本低，操作人员不需要直接接触剧毒物品，降低了安全隐患，可以推广应用。当前第1页12