一种同时测血清中尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮含量的方法与流程

本发明属于检测技术领域，具体是指一种基于超高效液相串联质谱同时测定尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮含量的方法。

背景技术：

尼古丁(nicotine)，俗名烟碱，是烟草的重要成分，会使人上瘾或产生依赖性，重复使用尼古丁也增加心脏速度和升高血压并降低食欲，也是烟草制品成瘾的首要因素。尼古丁在人体内可代谢生成多种物质，其中3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮是其主要代谢物之一。尼古丁及其代谢物在血液中的浓度水平与人体在烟气中暴露水平密切相关，因此其浓度是用来评估吸烟行为、环境中烟气暴露水平，因此建立一套快速高效的方法同时测定尼古丁及其主要代谢物对于评估吸烟行为具有数据指导意义。

睾酮是一种由睾丸、卵巢、肾上腺分泌的类固醇荷尔蒙，具有维持肌肉强度及质量、维持骨质密度及强度、提神及提升体能等作用。为了研究抽烟行为与睾酮分泌之间的关系，有必要同时检测尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮含量，现有技术中，国际上尚无同时测定血清尼古丁、吡啶吡咯酮、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、睾酮含量的液相串联质谱标准。

技术实现要素：

本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供一种同时测血清中尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮含量的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案是基于液相串联质谱同时测定尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮含量的超高效方法，包括以下步骤：

(1)使用经前处理的血清空白基质以及一系列不同溶度不同目标物配置的标准溶液，利用液相串联质谱检测，绘制标准曲线，所述的目标物为尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮或睾酮；

(2)对待检测血清样品进行前处理，然后利用液相串联质谱检测；

(3)根据标准曲线计算同时得出血清样品中的尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮的含量；

所述的步骤(1)和步骤(2)的前处理为：将待处理的血清，加入预冷的乙腈，然后涡旋和超声后冷冻离心分离，移取全部上清，再次加入预冷的乙腈，然后涡旋后冷冻离心，移取全部上清，过0.22μm滤膜，得到待检样品；

所述的步骤(1)和步骤(2)中的液相串联质谱中液相方法包括有：流动相方法和固定相方法；

所述的流动相方法基于梯度洗脱，其操作条件为基于时间的各参数为：

时间：0.00、0.20、1.20、2.20、2.21、4.00，单位为分钟；

流速：0.50、0.50、0.50、0.50、0.50、0.50，单位为ml/min；

乙腈与含0.1％甲酸的水的流动性比例为：5:95、5:95、90:10、90:10、5:95、5:95；

所述固定相方法为选用1.8μm、2.1x100mm的acquityuplchsst3柱，柱温箱温度37℃；

分别对应离子对：3-(吡咯烷-2-基)吡啶、尼古丁、吡啶吡咯酮、睾酮的质谱方法的操作条具体为：

定量离子对：149.06->132.09、163.16->130.09、177.14->80.04、289.30->109.07；

锥孔电压：30v、30v、10v、6v；

碰撞能量：12v、18v、21v、24v；

定性离子对：149.06->130.07、163.16->132.10、177.14->146.07、289.30->97.08；

锥孔电压：30v、30v、10v、6v；

碰撞能量：16v、14v、17v、22v。

进一步设置是所述步骤(1)中的不同溶度为：浓度为0.0001ng/ml、0.0002ng/ml、0.0005ng/ml、0.001ng/ml、0.002ng/ml、0.005ng/ml、0.01ng/ml、0.02ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml。

进一步设置是该方法定量限较低，3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮定量限低至0.1ng/ml，尼古丁定量限低至1.0ng/ml。

本发明的方法简单快速、检测灵敏度高、针对性强、适用范围广，经验证该方法对四种目标物的测定均具有较高的回收、良好的线性关系、较低的定量限，可一次同时检测多种目标物，快捷高效。该发明的前处理方法、液相方法以及部分液质方法同样适用于血清中与上述四种成分性质相近的其他目标物分析，适用性较强。相对其他针对该四种目标物的质谱方法，该方法灵敏度更高，能有效满足临床上血清中目标物的痕量分析需求。

目前，国际上尚无同时测定血清尼古丁、吡啶吡咯酮、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、睾酮含量的液相串联质谱标准。但有一些论文以及专利涉及到尿液、唾液、血液等体液中的相关组分检测，与这些方法相比，该发明方法在过程上以及结果上存在差异，主要如下：

1.该发明方法在前处理流程及上机方法上不同，更加简单，重复性好(见实例1)。前处理试剂上仅需乙腈，成本更低。

2.该发明方法在定量上采用外标法定量，不同于内标法不需使用昂贵的同位素标物，而同位素标物是其他方法试剂耗材中最重要的成本。

3.该发明方法中尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮含量检测定量限分别为1.0ng/ml、0.1ng/ml、0.1ng/ml、0.1ng/ml；而有报道的其他质谱方法定量限数量级在1.0mg/l水平附近，灵敏度相差1000倍以上；详见实例2.结果评价。而生活在低烟气暴露水平中的健康人群，血清中目标物含量通常远远达不到1mg/l。相对而言，该发明方法的检测数据更有临床参考价值和研究意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1本发明实施例的3-(吡咯烷-2-基)吡啶定性及定量离子流图；

图2本发明实施例的尼古丁定性及定量离子流图；

图3本发明实施例的吡啶吡咯酮定性及定量离子流图；

图4本发明实施例的睾酮定性及定量离子流图；

图5尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮的标准曲线；

图6本发明的工艺流程图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

本发明的技术方案是参见图6所示，包括：

s1:使用经前处理的血清空白基质以及一系列不同溶度不同目标物配置的标准溶液，利用液相串联质谱检测，绘制标准曲线，所述的目标物为尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮或睾酮；

s2:对待检测血清样品进行前处理，然后利用液相串联质谱检测；

s3:根据标准曲线计算同时得出血清样品中的尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮的含量；

现根据具体实施例进一步阐述说明：

本发明实施例主要设备试剂：

超高效液相串联质谱(waters公司，tqs),冷冻离心机(eppendorf,centrifuge5804r)，超声仪(科导,sk3300hp)，纯水仪(milli-q,direct8)，电子天平(mettlertoledo，newclassicmf)；乙腈(默克，色谱纯)，甲酸(cnw，色谱纯)；

注：设备试剂品牌仅作参考，其他相同规格设备试剂均可满足该方法。

实施例1

为本发明实施例中，一种测定血清中尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮含量的超高效液相串联质谱方法，步骤如下：

1.1准备工作：

4.1.1取250ul血清按前处理方法处理，预冷的乙腈使用量按相应比例增加，获得1.0ml以上待测液。

4.1.2使用万分之一天平或十万分之一天平，差值法称量1.0ml待测液的重量，由此获得了待测液的密度。

4.1.3至少进行六次重复获得当前实验条件下待测液平均密度，若偏差较大应考虑实验过程的稳定性问题。

4.1.4计算前处理制备待测液的近似体积：

v表示待测液体积；ρ待测液密度。m表示100ul经沉淀的血清上清加400ul预冷乙腈的重量。

备注：该准备工作为一次性工作，在实验环境条件稳定的情况下，后续实验均可使用该平均密度和体积进行计算，无需再次进行。本专利实验中测得v＝0.496ml(温度：20℃)。

1.2样品前处理：

4.2.1取100ul血清，加入预冷的乙腈200μl，涡旋1min，超声5min。

4.2.210000rpm-5℃冷冻离心10min。

4.2.3移取全部上清，加入预冷的乙腈200μl，l，涡旋1min。

4.2.410000rpm-5℃冷冻离心10min。

4.2.5移取全部上清，过0.22μm滤膜,待测。

4.3超高效液相串联质谱检测：

4.3.1液相方法：

4.3.1.1流动相方法：梯度洗脱

4.3.1.2固定相方法：

选用acquityuplchsst3柱(1.8μm,2.1x100mm)，柱温箱温度37℃。针对目标物t3柱相对传统c18柱有更好的保留。

4.3.2质谱方法：

4.3.3谱图

分别参见图1所示的3-(吡咯烷-2-基)吡啶定性及定量流图、图2所示的尼古丁定性及定量离子流图、图3所示的吡啶吡咯酮定性及定量离子流图、以及图4所示的睾酮定性及定量离子流图

4.4结果定量方法：

使用经前处理的血清空白基质以及标准物质配置标准溶液，绘制标标准曲线对样品经前处理后的上机测量液中目标物浓度进行定量。并根据如下公式换算样品中目标物浓度：

c表示血清中目标物的测量浓度，单位ng/ml；

v表示样品前处理后的上机待测液体积，本专利实验中取值为v＝0.496ml，可参考；

v0表示血清样品取样量，按本专利前处理方法取样量为0.1ml；

c1表示样品上机待测液中目标物的浓度。

进一步地，以下，通过实施例2-实施例3以阐述的具体实施步骤和优点，通过实例4以具体检测为例说明实例。

实施例2：方法准确性及重复性验证-添加回收实验

具体步骤：

1.取同一来源的血清100ul8份，其中2份为空白样品，另外6份添加一定量的检测目标物。

2.加入预冷的乙腈200μl，涡旋1min，超声5min后10000rpm-5℃冷冻离心10min。

3.移取全部上清，加入预冷的乙腈200μl，l，涡旋1min后10000rpm-5℃冷冻离心10min。

4..移取全部上清，过0.22μm滤膜，液相串联质谱待测。取其中一份空白样品待测液加入一定浓度的检测目标物配置成基质标准溶液。

5.液相串联质谱检测，且计算。

使用该方法进行超高效液相质谱检测，得出各目标物回收率如表1所示；方法重复性以6次平行测定的相对标准偏差计，如表2所示。

表1尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮的检测方法回收率

表2尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮的检测方法重复性

在10ng/ml的低浓度水平下，该方法其平均回收率在70％～120％之间，且相对标准偏差均较低提示重复性较好，故而该方法对血清中尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮的的提取效率极高，且重复性良好。

实施例3：方法的线性范围及灵敏度验证(定量限)。

1.取不同来源的血清混合离心后取10.0ml2份,分别加入预冷的乙腈20ml，涡旋1min，超声5min后10000rpm-5℃冷冻离心10min。

2.分别移取全部上清，加入预冷的乙腈20ml，l，涡旋1min后10000rpm-5℃冷冻离心10min。

3.分别移取全部上清，2份混合后过0.22μm滤膜，制成基质空白液。

4.采用基质空白液和目标物标准溶液分别配置浓度为0.0001ng/ml、0.0002ng/ml、0.0005ng/ml、0.001ng/ml、0.002ng/ml、0.005ng/ml、0.01ng/ml、0.02ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的基质标准溶液。

5.液相串联质谱检测，且计算，绘制合适的标准曲线，并确定线性范围。

6.根据3倍信噪比估算检出限，配置相应浓度基质标准溶液，液相串联质谱检测10次，若检出率达到100％则认为该检出限满足检出要求，若检出率低于100％则提高检出限浓度直至达到要求。

7.比较同一检测目标物三倍检出限与线性范围内的最小值，取两者的较大值作为方法定量限。

使用上述方法得出各目标物线性范围如下图及表3所示；定量限如表4所示。

表3尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮的检测线性范围

表4尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮的检测方法定量限

由图5可见，该方法在极低浓度下依然具有很好的线性关系，尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮的标准曲线r²在0.9983～0.9999之间，均大于0.99。且经上述方法严格确证，该方法定量限较低，3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮定量限低至0.1ng/ml，尼古丁定量限低至1.0ng/ml，优于相关质谱检测方法。

实施实例4：20例临床样本试剂检测

以是否吸烟为参考因素，选取了20例脂肪肝病人的血清样本，并按如下方法步骤检测：

1.取100ul血清，加入预冷的乙腈200μl，涡旋1min，超声5min。

2.10000rpm-5℃冷冻离心10min。

3.移取全部上清，加入预冷的乙腈200μl，l，涡旋1min。

4.10000rpm-5℃冷冻离心10min。

5.移取全部上清，过0.22μm滤膜，液相串联质谱检测。

检测结果如下表所示：

结果显示，吸烟者血清中3-(吡咯烷-2-基)吡啶、尼古丁、吡啶吡咯酮与非吸烟者差异非常显著，非吸烟脂肪肝患者血清中未检测出3-(吡咯烷-2-基)吡啶、尼古丁，且检测出吡啶吡咯酮含量比吸烟者低两个数量级。且吸烟患者血清中睾酮含量平均为2.70ng/ml，非吸烟患者为1.37ng/ml，总体上吸烟患者血清中睾酮含量要更高。检测结果与理论推测及现有的研究资料结论一致，该发明方法能为相关临床诊断及研究提供可靠的依据。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。