一种测定格列吡嗪原料药及其缓释片中特定基因毒性杂质的分析方法与流程

本发明具体涉及一种高效液相色谱-串联质谱分析方法，特别是快速测定格列吡嗪原料药及其缓释片中特定基因毒性杂质的分析方法。

背景技术：

格列吡嗪是第二代磺酰脲类口服降糖药，适用于经饮食控制及体育锻炼疗效不满意的轻、中度ⅱ型糖尿病患者。格列吡嗪原料药/格列吡嗪缓释片的杂质检测方法已有报道，杂质数目及控制标准主要参照欧洲药典（9.0版，9个杂质），美国药典（41版，3个杂质）和中国药典（2015年版，1个杂质）。目前尚未见格列吡嗪原料药中具有基因毒性警示结构杂质的报道。

根据人类药品注册技术要求国际协调会议(ich)m7(r1)的规定，具有基因毒性警示结构的杂质，如果没有进行细菌诱变试验证明其无基因毒性，即为潜在毒性杂质，人在长期用药时，其每日摄入量不能超过1.5μg。格列吡嗪原料药/格列吡嗪缓释片在生产过程中如果接触到乙醇或者含有微量乙醇的试剂，会降解并形成具有氨基甲酸乙酯结构的杂质。在世界卫生组织国际癌症研究机构致癌物列表中，氨基甲酸乙酯属于2类致癌物。而格列吡嗪临床给药最大剂量为20mg，所以格列吡嗪中该杂质的最大限度为75ppm。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服以上的不足，提供一种分析快速，抗干扰性强，灵敏度高的测定格列吡嗪原料药及其缓释片中特定基因毒性杂质的分析方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种测定格列吡嗪原料药及其缓释片中特定基因毒性杂质的分析方法，包括以下步骤：

a、称取格列吡嗪原料药20mg，置20ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1mg/ml的供试品溶液；

b、称取相当于20mg格列吡嗪的格列吡嗪缓释片粉末，置20ml量瓶中，用甲醇溶解，超声，放冷，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1mg/ml的供试品溶液，高速离心后，取上清液作为供试品分析；

c、称取氨基甲酸乙酯杂质1.5mg，置200ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为7.5μg/ml的对照品储备液；精密量取2ml，置200ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配成浓度为75ng/ml的对照品溶液；

d、采用高效液相色谱-串联质谱法分析供试品，同时启动色谱采集计算机系统采集数据；使用外标法计算该特定基因毒性杂质的含量；

高效液相色谱-串联质谱分析方法：

对于原料药检测,色谱条件包括：流动相：ph3.5醋酸水溶液：乙腈=30：70v/v；色谱柱：沃特世十八烷基键合硅胶色谱柱,内径4.6mm，柱长150mm,填料粒径5μm；流速：0.4-0.6ml/min；进样体积：30μl；柱温：32-38°c；运行时间：10min。质谱条件包括：气动辅助电喷雾离子源，正离子，多反应离子监测，mrm，393→347；碎裂电压：120v，碰撞能量：10v；干燥气流量：9-10l/min，干燥气温度：350°c，雾化室压力：45psi，毛细管电压：4000v。

对于片剂检测,色谱条件包括：流动相a：ph3.5醋酸水溶液：乙腈=75：25(v/v),流动相b：ph3.5醋酸水溶液：乙腈=50：50(v/v)；梯度洗脱程序：

色谱柱：沃特世十八烷基键合硅胶色谱柱,内径4.6mm，柱长150mm,填料粒径5μm；流速：0.4-0.6ml/min；进样体积：20μl；柱温：32-38°c；运行时间：25min。质谱条件包括：气动辅助电喷雾离子源，正离子，多反应离子监测，mrm，393→347；碎裂电压：120v，碰撞能量：10v；干燥气流量：9-10l/min，干燥气温度：350°c，雾化室压力：45psi，毛细管电压：4000v。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明采用高效液相色谱-串联质谱，能够有效提高杂质的识别能力,提高分析的专属性和灵敏度，准确测定其含量；

2、本发明解决了格列吡嗪原料药及格列吡嗪缓释片中潜在的特定基因毒性杂质的测定问题；

3、本发明的方法能简便、快速、准确地分析格列吡嗪原料药及格列吡嗪缓释片中潜在的特定基因毒性杂质(格列吡嗪氨基甲酸乙酯杂质)的含量。

附图说明：

图1为实施例1溶剂空白溶液色谱图；

图2为实施例1对照品色谱图；

图3实施例1的供试品色谱图；

图4为实施例2溶剂空白溶液色谱图；

图5为实施例2对照品色谱图；

图6实施例2的供试品色谱图；

具体实施方式：

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一模块实施例，而不是全部的实施例。在本发明的一种实施方式中描述的元素和特征可以与一个或更多个其它实施方式中示出的元素和特征相结合。应当注意，为了清楚的目的，说明中省略了与本发明无关的、本领域普通技术人员已知的部件和处理的表示和描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种测定格列吡嗪原料药及其缓释片中特定基因毒性杂质的分析方法，包括以下步骤：首先称取待测物粉末至一量瓶中，接着加入甲醇，超声充分提取，最后取出并放冷，定容置刻度并摇匀，高速离心后取上清液作为供试品分析；采用高效液相色谱-串联质谱法分析供试品，启动色谱采集计算机系统采集数据；取特定基因毒性杂质对照品，加入甲醇溶解配成对照品溶液，同时进行高效液相色谱-串联质谱分析，然后计算待测样品中该特定基因毒性杂质的含量。

实施例一

格列吡嗪原料药中氨基甲酸乙酯杂质的含量测定：

(1)、仪器与条件：

高效液相色谱-串联质谱仪：安捷伦1260高效液相色谱-6410b三重四级杆串联质谱系统及masshunter工作站；

色谱柱：沃特世sunfirec18,内径4.6mm，柱长150mm,填料粒径5μm；

(2)、实验步骤：

精密称取格列吡嗪原料药20mg，置20ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1mg/ml的供试品溶液，进样分析；

精密称取氨基甲酸乙酯杂质1.5mg，置200ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为7.5μg/ml的对照品储备液；精密量取2ml，置200ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配成浓度为75ng/ml的对照品溶液，进样分析；

色谱条件包括：流动相：ph3.5醋酸水溶液：乙腈=30：70(v/v)；色谱柱：沃特世sunfirec18,内径4.6mm，柱长150mm,填料粒径5μm；流速：0.5ml/min；进样体积：30μl；柱温：35°c；运行时间：10min。质谱条件包括：气动辅助电喷雾离子源(esi)，正离子，多反应离子监测(mrm，393→347)；碎裂电压：120v，碰撞能量：10v；干燥气流量：9.5l/min，干燥气温度：350°c，雾化室压力：45psi，毛细管电压：4000v。

方法学考察：

进样重现性：取对照品溶液连续进6针，计算氨基甲酸乙酯杂质峰面积的%rsd，为1.6，小于5，说明方法的精密度良好；

专属性：本方法氨基甲酸乙酯杂质液质检测的保留时间为5.15min左右；

重复性：平行配制6份样品，氨基甲酸乙酯杂质测定结果的%rsd小于3；

测定结果：

3批格列吡嗪供试品中氨基甲酸乙酯杂质含量分别为18ppm，35ppm和67ppm，但低于样品中该杂质的最大限度75ppm。

实施例二

格列吡嗪缓释片中氨基甲酸乙酯杂质的含量测定：

(1)、仪器与条件：

高效液相色谱-串联质谱仪：安捷伦1260高效液相色谱-6410b三重四级杆串联质谱系统及masshunter工作站；

色谱柱：沃特世sunfirec18,内径4.6mm，柱长150mm,填料粒径5μm；

(2)、实验步骤：

精密称取相当于20mg格列吡嗪格的列吡嗪缓释片粉末，置20ml量瓶中，加20.0ml甲醇，涡旋5分钟，高速离心，取上清液进样分析；

精密称取氨基甲酸乙酯杂质1.5mg，置200ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为7.5μg/ml的对照品储备液；精密量取2ml，置200ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配成浓度为75ng/ml的对照品溶液，进样分析；

色谱条件包括：流动相a：ph3.5醋酸水溶液：乙腈=75：25(v/v),流动相b：ph3.5醋酸水溶液：乙腈=50：50(v/v)；

梯度洗脱程序

色谱柱：沃特世sunfirec18,内径4.6mm，柱长150mm,填料粒径5μm；流速：0.5ml/min；进样体积：20μl；柱温：35°c；运行时间：25min。质谱条件包括：气动辅助电喷雾离子源(esi)，正离子，多反应离子监测(mrm，393→347)；碎裂电压：120v，碰撞能量：10v；干燥气流量：9.5l/min，干燥气温度：350°c，雾化室压力：45psi，毛细管电压：4000v；

系统适用性：

取对照品溶液连续进5针，计算氨基甲酸乙酯杂质峰面积的%rsd，%rsd小于10.0，满足要求；

测定结果：

3批格列吡嗪缓释片供试品中氨基甲酸乙酯杂质含量分别为30ppm，30ppm和32ppm，但低于样品中该杂质的最大限度75ppm。

本发明采用高效液相色谱-串联质谱，能够准确测定格列吡嗪原料药和格列吡嗪缓释片中基因毒性杂质氨基甲酸乙酯的含量；解决了格列吡嗪原料药和格列吡嗪缓释片中痕量基因毒性杂质的测定方法问题。

对于痕量存在的该特定的基因毒性杂质，通过高效液相色谱-串联质谱能够快速准确地检测出来。本发明具有专属性强，分析快速，抗干扰性强，灵敏度高的优点。

最后应说明的是：虽然以上已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本发明的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。