一种检测CD44蛋白的电化学交流阻抗生物传感器及其制备方法与流程
本发明涉及传感器领域，具体涉及一种检测cd44蛋白的电化学交流阻抗生物传感器及其制备方法。
背景技术：
cd44是一种细胞表面糖蛋白，它参与人体淋巴细胞的活化、伤口愈合和细胞迁移等生理过程。cd44蛋白的主要功能可归纳为：(1)介导淋巴细胞与毛细血管后小静脉中的高柱状内皮细胞结合，使淋巴细胞穿过血管壁回到淋巴组织；(2)参与淋巴细胞的激活过程；(3)与细胞外基质中的透明质酸、层粘连蛋白等基质分子结合；(4)能与细胞骨架蛋白结合，参与细胞伪足形成，并与细胞的迁移运动有关。
此外，cd44与肿瘤浸润转移关系的研究已有大量报道，已在人类各种恶性肿瘤的研究中发现cd44s普遍存在。cd44在肿瘤的发生、生长和转移过程中也起着重要的作用，例如，胃癌和结肠癌患者血清中cd44的浓度约为正常人的10倍，被认为是恶性肿瘤是否已经发生转移的重要标志物。
目前已有多种方法可以检测cd44，例如，逆转录-聚合酶链反应(rt-pcr)、蛋白质免疫印迹法(westernblotting)和酶联免疫吸附法(elisa)等。但这些方法的操作程序复杂，耗时长且检测费用高，不方便应用于常规诊断。因此，需要建立一种快速、灵敏和简便的分析方法用于检测cd44。
技术实现要素：
为了克服现有技术中检测cd44方法的操作程序复杂，耗时长且检测费用高，不方便应用于常规诊断的问题，本发明提供了一种检测cd44蛋白的电化学交流阻抗生物传感器，能够对cd44蛋白进行即时检测，灵敏度高、特异性强且简单廉价。cd44蛋白作为恶性肿瘤是否已经发生转移的重要标志物，采用电化学检测技术比传统的cd44检测技术更有利于常规诊断。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种检测cdd44蛋白的电化学交流阻抗生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备cd44蛋白特异性识别探针；
(2)电化学交流阻抗生物传感器的组装。
优选的，所述步骤(1)制备cd44蛋白特异性识别探针具体为：
(a)将pex-14溶解于tris-hcl缓冲液中，得到cd44蛋白特异性识别的探针溶液，即pex-14溶液；
(b)将多肽抑制剂(isc)溶解于tris-hcl缓冲液中，得到pex-14特异性识别的探针溶液，即多肽抑制剂溶液；
优选的，所述步骤(2)电化学交流阻抗生物传感器的组装具体为：
(a)对金电极进行预处理，在预处理后的金电极表面滴加多肽抑制剂(isc)溶液进行自组装修饰，然后用tris-hcl缓冲溶液冲洗，得到isc/ge电极；
(b)在步骤(a)所得电极表面滴加mch溶液封闭电极表面未被isc占据的空白位点，封闭后用tris-hcl缓冲溶液冲洗电极表面，得到mch/isc/ge电极；
(c)在步骤(b)所得电极表面滴加pex-14溶液，通过pex-14与多肽抑制剂(isc)的特异性识别进行进一步的修饰，然后用tris-hcl缓冲溶液冲洗，得到pex-14/isc/ge电极，即为检测cd44的电化学交流阻抗生物传感器。
优选的，所述pex-14溶液的浓度为5ng/ml-20ng/ml。
优选的，所述多肽抑制剂溶液的浓度为2-20μm。
优选的，所述步骤(a)对金电极进行预处理具体为：将金电极抛光，清洗，以清洗后的金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，组成三电极体系，在电化学溶液中进行循环伏安扫描至循环伏安图谱稳定。
优选的，所述步骤(a)中多肽抑制剂(isc)自组装修饰的时间为10-15h。
优选的，所述步骤(b)中mch溶液的浓度为0.1-10mm；mch封闭时间为30-60min；所述步骤(c)中pex-14与多肽抑制剂(isc)的特异性识别的时间为20-60min。
优选的，所述tris-hcl缓冲溶液的浓度为0.01-0.1m，ph值为7-8。
优选的，一种检测cdd44蛋白的电化学交流阻抗生物传感器的制备方法制得的检测cdd44蛋白的电化学交流阻抗生物传感器。
本发明的有益效果是：
(1)灵敏度高，本发明利用的电化学交流阻抗技术作为信号输出方式，该技术本身具有极高的灵敏度，本发明中的化学交流阻抗生物传感器可定量检测0.03ng/mlcd44；
(2)选择性高，本发明以isc作为分子识别物质，基于isc和pex-14的相互作用以及pex-14和cd44的异源二聚化，使电化学交流阻抗生物传感器界面上的电化学阻抗值增大的原理来检测cd44，常见的干扰蛋白：mmp-2、mmp-7、thrombin、trypsin对检测均无干扰；
(3)步骤简单，电化学交流阻抗生物传感器经组装好以后，与待测cd44溶液结合30min后就可以一步检测；
(4)成本低廉，所需试剂量少。
附图说明
图1是交流阻抗传感器检测cd44的原理图；
图2是不同浓度cd44对应的电化学阻抗图谱；
图3是电化学阻抗值与cd44浓度的线性关系图；
图4是电化学交流阻抗生物传感器检测cd44的选择性结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，本发明的一种检测cd44蛋白的电化学交流阻抗生物传感器的检测原理为：基质金属蛋白酶(mmps)的类血红素结构域(pex)均呈高度保守的圆盘形状，其中的肽链相互折叠成具有伪四重对称性的β-螺旋桨状。用x射线衍射分析离体的mmp-14的pex(pex-14)，发现该结构域中叶片i和叶片iv最外部的肽链凸起，这是其它mmps所不具备的特征。研究表明，mmp-14可以通过pex-14的叶片i与cd44发生异源二聚化，从而形成mmp-14-cd44异型二聚体。因此，pex-14可作为特异性识别的探针来检测cd44。本发明利用从pex-14中筛选出来的多肽抑制剂(is4)作为特异性识别pex-14的物质，在is4上标记“(ch2)6-cys-oh”对该多肽抑制剂进行功能化修饰得到多肽抑制剂(isc)。以isc作为分子识别物质，因在isc上标记的“(ch2)6-cys-oh”带有巯基，可通过au-s自组装固定到金电极表面，用mch封闭后再进一步的与pex-14相互作用即可得到检测cd44的电化学交流阻抗生物传感器。当传感器与cd44相互作用后，cd44因与pex-14发生异源二聚化而结合到电极表面，由于cd44不具有导电性，从而阻碍了[fe(cn)6]3-/4-在金电极表面的电子转移，使得交流阻抗值随着cd44浓度的增加而增加，基于此实现对cd44高选择性和高灵敏度检测。
一种检测检测cd44的电化学交流阻抗生物传感器传的制备方法，具体制备步骤如下：
(1)金电极的预处理
将金电极在柔软的抛光布上分别用1.0μm、0.3μm和0.05μm的三氧化二铝抛光打磨至镜面，打磨后用去离子水冲洗电极表面；随后将金电极分别在乙醇和去离子水中超声清洗2-5min；以清洗后的金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极(饱和kcl)组成三电极体系在0.1-0.5mh2so4溶液中进行循环伏安扫描至循环伏安图谱稳定；扫描电位范围为-0.3v～+1.5v，扫描速率为0.1v.s-1。
(2)配置检测cd44的特异性识别探针
a.用tris-hcl缓冲液配置5-20ng/mlpex-14，即得到cd44特异性识别的探针溶液，即pex-14溶液；
b.用tris-hcl缓冲液配置2-20μm的多肽抑制剂(isc)，得到pex-14特异性识别的探针溶液，即多肽抑制剂溶液。
(3)电化学交流阻抗生物传感器的组装
a.在预处理后的金电极
其中多肽抑制剂的氨基酸序列为：vmdgypmp-(ch2)6-cys；
b.将10-30μl0.1-10mmmch的溶液滴加到isc/ge表面，封闭30-60min后用10mmtris-hcl缓冲溶液冲洗电极表面，得到mch/isc/ge；
c.在mch/isc/ge表面滴加10μl5-20ng/mlpex-14溶液，结合20-60min后用10mmtris-hcl缓冲溶液冲洗电极表面，即得到可检测cd44的电化学交流阻抗生物传感器。
tris-hcl缓冲溶液的浓度可以是0.01-0.1m内的任一值，ph值可以为7-8内的任一值，优选tris-hcl缓冲溶液的浓度为0.01m，ph7.4。
实施例1
一种检测检测cd44的电化学交流阻抗生物传感器传的制备方法，具体制备步骤如下：
(1)金电极的预处理
将金电极在柔软的抛光布上分别用1.0μm、0.3μm和0.05μm的三氧化二铝抛光打磨至镜面，打磨后用去离子水冲洗电极表面；随后将金电极分别在乙醇和去离子水中超声清洗2min；以清洗后的金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极(饱和kcl)组成三电极体系在0.5mh2so4溶液中进行循环伏安扫描至循环伏安图谱稳定；扫描电位范围为-0.3v～+1.5v，扫描速率为0.1v.s-1。
(2)配置检测cd44的特异性识别探针
a.用tris-hcl缓冲液配置10ng/mlpex-14，即得到cd44特异性识别的探针溶液，即pex-14溶液；
b.用tris-hcl缓冲液配置15μm的多肽抑制剂(isc)，得到pex-14特异性识别的探针溶液，即多肽抑制剂溶液。
(3)电化学交流阻抗生物传感器的组装
a.在预处理后的金电极
其中多肽抑制剂的氨基酸序列为：vmdgypmp-(ch2)6-cys；
b.将10μl1mmmch的溶液滴加到isc/ge表面，封闭30min后用10mmtris-hcl缓冲溶液冲洗电极表面，得到mch/isc/ge；
c.在mch/isc/ge表面滴加10μl10ng/mlpex-14溶液，结合30min后用10mmtris-hcl缓冲溶液冲洗电极表面，即得到可检测cd44的电化学交流阻抗生物传感器。
上述tris-hcl缓冲溶液的浓度为0.01m，ph7.4。
实施例2
一种检测检测cd44的电化学交流阻抗生物传感器传的制备方法，具体制备步骤如下：
(1)金电极的预处理
将金电极在柔软的抛光布上分别用1.0μm、0.3μm和0.05μm的三氧化二铝抛光打磨至镜面，打磨后用去离子水冲洗电极表面；随后将金电极分别在乙醇和去离子水中超声清洗3min；以清洗后的金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极(饱和kcl)组成三电极体系在0.5mh2so4溶液中进行循环伏安扫描至循环伏安图谱稳定；扫描电位范围为-0.3v～+1.5v，扫描速率为0.1v.s-1。
(2)配置检测cd44的特异性识别探针
a.用tris-hcl缓冲液配置5ng/mlpex-14，即得到cd44特异性识别的探针溶液，即pex-14溶液；
b.用tris-hcl缓冲液配置2μm的多肽抑制剂(isc)，得到pex-14特异性识别的探针溶液，即多肽抑制剂溶液。
(3)电化学交流阻抗生物传感器的组装
a.在预处理后的金电极
其中多肽抑制剂的氨基酸序列为：vmdgypmp-(ch2)6-cys；
b.将20μl0.1mmmch的溶液滴加到isc/ge表面，封闭45min后用10mmtris-hcl缓冲溶液冲洗电极表面，得到mch/isc/ge；
c.在mch/isc/ge表面滴加10μl5ng/mlpex-14溶液，结合20min后用10mmtris-hcl缓冲溶液冲洗电极表面，即得到可检测cd44的电化学交流阻抗生物传感器。
上述tris-hcl缓冲溶液的浓度为0.05m，ph＝7。
实施例3
一种检测cd44的电化学交流阻抗生物传感器的制备方法，具体制备步骤如下：
(1)金电极的预处理
a.金电极在柔软的抛光布上分别用1.0μm、0.3μm和0.05μm的三氧化二铝抛光打磨至镜面，打磨后用去离子水冲洗电极表面。随后将金电极分别在乙醇和去离子水中超声清洗5min。以清洗后的金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极(饱和kcl)组成三电极体系在0.5mh2so4溶液中进行循环伏安扫描至循环伏安图谱稳定；扫描电位范围为-0.3v～+1.5v，扫描速率为0.1v.s-1。
(2)配置检测cd44的特异性识别探针
a.用缓冲液(10mmtris-hcl(ph7.4))配置20ng/mlpex-14，即得到cd44特异性识别的探针溶液，即pex-14溶液；
b.用缓冲液(10mmtris-hcl(ph7.4))配置20μm的多肽抑制剂(isc)，得到pex-14特异性识别的探针溶液，即多肽抑制剂溶液。
(3)电化学交流阻抗传感器的组装
a.在预处理后的金电极
其中多肽抑制剂(isc)的氨基酸序列为：vmdgypmp-(ch2)6-cys；
b.将30μl10mmmch溶液滴加到isc/ge电极表面，封闭60min后得到mch/isc/ge；
c.在mch/isc/ge表面滴加10μl20ng/mlpex-14溶液，结合60min后用10mmtris-hcl缓冲液(ph7.4)冲洗电极表面，即得到可检测cd44的交流阻抗生物传感器。
上述tris-hcl缓冲溶液的浓度为0.1m，ph＝8。
如图2所示，本发明的一种检测cd44蛋白的电化学交流阻抗生物传感器的使用方法，具体包括以下步骤：
(1)以上述制备得到的检测cd44的电化学交流阻抗生物传感器为工作电极，ag/agcl电极(饱和kcl)为参比电极，铂丝电极为对电极，构建三电极系统；
(2)在工作电极表面滴加10μl用10mmtris-hcl(ph7.4)配制的已知浓度cd44待测液，30min后用10mmtris-hcl(ph7.4)冲洗除去任何吸附的物质。在电化学阻抗测试液中，测试电化学阻抗ret，采用的电化学方法：交流阻抗法；偏置电位：0.2v；频率：100khz～1.0hz；振幅：5.0mv；重复该步骤得到多组不同cd44浓度对应的电化学阻抗值；cd44浓度范围为0.1ng/ml-1.0ng/ml。
(3)在0.1ng/ml-1.0ng/ml浓度范围内，电化学阻抗值随cd44浓度的增大而增大。根据步骤(2)得到的多组不同cd44浓度对应的电化学阻抗数据模拟得到cd44浓度与电化学阻抗之间的拟合曲线。
(4)在工作电极表面滴加待测溶液结合一段时间后，以结合后的电极为工作电极，在电化学阻抗测试液中，测试电化学阻抗ret，根据cd44浓度与电化学阻抗之间的拟合曲线，得到待测溶液中cd44的浓度，单位为ng/ml。
所述的电化学阻抗测试液为含10mmk4[fe(cn)6]-、10mmk3[fe(cn)6]-、10mmnacl的tris-hcl缓冲溶液。
本发明所述的电化学交流阻抗生物传感器可以用于检测cd44，测试时步骤简单，电化学交流阻抗生物传感器组装好以后，与待测cd44溶液结合30min后就可以一步检测，有利于多种疾病的诊断和治疗。
如图2-4所示，本发明的一种检测cd44蛋白的电化学交流阻抗生物传感器电的应用实例为：
应用实例1检测cd44
一种检测cd44的电化学交流阻抗生物传感器使用方法，包括如下步骤：
(1)使用本发明实施例1制备得到的检测早mmps的电化学交流阻抗生物传感器为工作电极，ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，构建三电极系统；
(2)在工作电极表面分别滴加10μl用10mmtris-hcl配制的浓度为0.1ng/ml、0.5ng/ml、0.7ng/ml、0.8ng/ml、1.0ng/ml、的cd44待测液，结合30min后用10mmtris-hcl冲洗除去任何吸附的物质，在电化学阻抗测试液中,测试电化学阻抗ret，采用的电化学方法：交流阻抗法；偏置电位：0.2v；频率：100khz～1.0hz；振幅：5.0mv。
(3)根据测试结果发现，电化学交流阻抗值ret在cd44浓度为0.1ng/ml-1.0ng/ml范围内呈线性关系ret＝11021c+7986.8(c单位：ng/ml，r2＝0.9960)，不同浓度的cd44对应的电化学阻抗图谱如图2所示，电化学阻抗值与cd44浓度之间的线性关系图如图3所示。
(4)在工作电极表面滴加10μlcd44待测溶液，结合30min后，在电化学阻抗测试液中，测试得到电化学阻抗ret，根据cd44浓度与电化学阻抗之间的拟合曲线，得到待测溶液中cd44的浓度，单位为ng/ml。
所述的电化学阻抗试液为含10mmk4[fe(cn)6]-、10mmk3[fe(cn)6]-、10mmnacl的tris-hcl缓冲溶液。
由该应用实例1可知，电化学交流阻抗值与cd44浓度在0.1ng/ml-1.0ng/ml浓度范围内呈线性关系，因此，根据检测限计算公式3σ/s，经计算得到本申请的实施例1制备得到的检测mmps的电化学交流阻抗生物传感器检测mmp-14的检测限可达0.03ng/ml，这说明本发明的电化学交流阻抗传感器的灵敏度很高。
实例2选择性测试：
使用本发明实施例1制备得到的检测cd44的电化学交流阻抗生物传感器为工作电极，实验条件与实施例1相同,检测0.1ng/mlcd44以及10ng/ml常见干扰蛋白：mmp-2、mmp-7、thrombin、trypsin，结果如图4所示。
结果表明：除目标物cd44外，其余干扰蛋白与电化学交流阻抗生物传感器相互作用后，交流阻抗值变化均很小。这说明100倍的常见的干扰蛋白不影响检测，本发明的生物传感器具有较好的选择性。这主要是因为生物传感器是通过自组装到金电极表面的多肽抑制剂(isc)和pex-14的相互作用后，cd44通过和pex-14的异源二聚化结合到传感器表面，使传感器界面上的电化学阻抗值增大的原理来检测cd44。
本发明基于多肽抑制剂(isc)和pex-14的相互作用以及pex-14和cd44的异源二聚化，构建了一种灵敏度高、特异性强的检测cd44的电化学交流阻抗生物传感器。由于本发明传感器是利用多肽抑制剂(isc)与pex-14之间的特异性结合以及pex-14与cd44之间的特异性反应，因此检测结果更准确。本发明通过研究多肽抑制剂(isc)与pex-14之间的相互作用以及pex-14与cd44之间的相互作用，提出了一种新颖的方法用于临床诊断某些肿瘤疾病，以及为抗癌药物的筛选提供了新的研究平台。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
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