本发明涉及分子生物
技术领域：
，特别是指一种胃癌her-2fish的组织芯片制作方法。
背景技术：
：赫赛汀联合化疗是her-2基因阳性晚期胃癌患者的一线靶向治疗方案，为患者带来生存获益，降低35％的死亡风险，显著延长生存期，提高生存质量。分子生物技术的发展日新月异，为临床靶向治疗及判断预后提供的新的思维和方向，为病人的治疗提供了全新有效的方案。her-2fish检测技术是检测her-2基因扩增的金标准，为晚期胃癌患者的诊疗方案及判断预后提供帮助，蜡块的完整保存凸显重要。传统的fish方法是制作单片切片，相对复杂，耗时耗力，成本高,易掉片，易污染,传统的芯片钳取方法严重破坏了蜡块的完整性。目前常用的组织芯片制作机主要由打孔针及距离调节器构成，通过专业技术手段把最有价值的组织从蜡块里取出后再按一定顺序排列做成组织芯片。这样的做法优点是快速，大批量。但同样缺陷是会破坏蜡块的完整性，特别是微小癌标本。并且不同类型胃癌标本存在着明显的异质性，蛋白酶k消化细胞核的时间存在明显差异，简单的使用同样的消化时限无法取得理想精确诊断结果。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种胃癌her-2fish的组织芯片制作方法，实现保持蜡块的完整性，并降低实验的材料成本和人工成本，提高工作效率和准确率。为了达成上述目的，本发明的解决方案是：一种胃癌her-2fish的组织芯片制作方法，包括以下步骤：步骤1、选取实验材料从ihc的her-2染色的对照切片中选取典型阳性肿瘤细胞集中的对照区域,对比对照区域在蜡块上划出相应的实验区域，并切取组织切面；所述实验区域的形状为面积小于10mm2的方形；步骤2、制作实验组织芯片将切取的若干个组织切面根据统筹归类，把同类型的若干个不同标本的组织切面铺设在同一玻片上，制成实验组织芯片；步骤3、将实验组织芯片进行脱蜡处理；步骤4、将实验组织芯片进行去除交联预处理；步骤5、将实验组织芯片进行蛋白酶k消化处理；步骤6、观察实验组织芯片的细胞消化效果和重复消化日常室内光线下，在实验组织芯片的各组织切面上分别覆盖去离子水，使用40倍物镜白光镜下分别观察每个组织切面，如果细胞形态结构清晰，细胞核突显，核内透亮，染色质/体呈清晰小黑点分布于细胞核内，胞质透亮，细胞膜变透明，则判断为消化到位；对于消化不到位的组织切面，直接去除其表面的去离子水，平放在水浴箱的湿盒中，用移液枪量取适量蛋白酶k工作液，滴加在消化不到位的组织切面上，反复2-3次，3min/次，再观察细胞消化效果，直至实验组织芯片上的组织切面全部消化到位；步骤7、变性和杂交在暗室中，在组织切面上滴加探针混合物，加盖盖玻片，并用软质胶封边，再进行变性和杂交处理。所述步骤1中，实验区域的形状为3×3mm2的方形。所述步骤1中，实验区域的相邻两边互不接触，相邻两边的端部距离为0.5mm。所述步骤1中，组织切面的厚度为3.5-4μm。所述步骤2中，将组织切面按照胃癌分型、ihc结果、细胞形态及大小进行统筹归类。所述步骤2中，将6个不同标本的组织切面铺设在同一玻片上。所述步骤3中，将实验组织芯片在62℃烤箱中放置18-20小时后，将实验组织芯片浸泡在室温的二甲苯中3次，10min/次；在100％乙醇、85％乙醇、70％乙醇中各浸泡1次，3min/次，再用去离子水洗涤1min。所述步骤4中，将实验组织芯片在80℃的nascn液中浸泡20-30min后，在室温的去离子水中浸泡2次，3min/次；上述nascn液的体积为10-15ml。所述步骤5中，将实验组织芯片放入预热好的蛋白酶k工作液中，在37℃下孵育10-60min后，用去离子水漂洗2次，5min/次。所述步骤7中，变性的条件为78℃，5min；杂交的条件为37℃，16-20h。采用上述方法后，本发明通过“先划实验区域再切取组织切面”的选材步骤，最大限度地保证蜡块的完整性；所切取的组织切面面积小，可以节省实验试剂、减少工作人员的动作量，提高工作效率和准确率；在一个玻片上铺设多个组织切面，可以减少后续处理步骤，进一步提高工作效率，并节省档案的存档空间；观察细胞消化效果的流程处理步骤少、时间短，无需镜油和复染剂，降低成本，并避免被两者干扰而影响探针杂交的风险，并且不会存在组织破损或掉片风险。由此，本发明可以极大的降低实验的材料成本和人工成本，并提高工作效率和准确率。此外，本发明的实验区域的形状为3×3mm2的方形，方形相邻两边互不接触，相邻两边的端部距离为0.5mm，可以保证切片完整性，不翻转，不卷曲。具体实施方式为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例来对本发明进行详细阐述。一种胃癌her-2fish的组织芯片制作方法，包括以下步骤：步骤1、选取实验材料从ihc的her-2染色的对照切片中选取符合实验要求的典型阳性肿瘤细胞集中的对照区域,根据对照区域在蜡块上划出相应的实验区域，并切取组织切面；上述实验区域的形状为3×3mm2的方形，其相邻两边互不接触，相邻两边的端部距离为0.5mm，以确保切取组织切面的过程中不翻片；上述组织切面的厚度为3.5-4μm。本发明的步骤1选取实验材料后，典型的肿瘤组织没有丢失，完整保留在蜡块里；所选取的实验组织小，可以做成芯片，节省试剂；后续的步骤中，杂交后读片时在100倍物镜下，组织芯片内的正常组织少，工作量大大减小，提高效率；工作人员所需观察的视野小，不容易疲劳，不容易漏诊。传统的单片方法，是切取蜡块的完整切面进行实验，组织切面的大小约20×20mm2，偏大，浪费试剂；后续的步骤中，杂交后读片时在100倍物镜下，组织芯片内的正常组织太多，工作量太大，浪费不必要的时间；工作人员所需观察的视野大，容易疲劳，更容易漏诊。传统的芯片方法，是根据对照切片的对照区域钳咬取蜡块的实验区域，盲目、随机包埋在同一蜡块中，数量不定，导致典型的肿瘤组织已丢失，蜡块的存档价值大大降低，日后的基因检测等新项目无法实现精准诊断，影响疾病的诊断和治疗。步骤2、制作实验组织芯片将切取的若干个组织切面根据胃癌分型、ihc结果、细胞形态及大小统筹归类，把同类型的若干个不同标本的组织切面沿玻片长轴方向铺设，制成实验组织芯片，做好标识；本实施例中将6个不同标本的组织切面按顺序铺设在同一玻片上。本发明的步骤2可以明显减少后续的实验步骤，提高工作效率。传统的单片方法，一个玻片上仅有一个组织切面。传统的芯片方法，没有对组织切面进行统筹归类。步骤3、脱蜡将实验组织芯片在62℃烤箱中放置18-20小时后，将实验组织芯片浸泡在室温的二甲苯中3次，10min/次；在100％乙醇、85％乙醇、70％乙醇中各浸泡1次，3min/次，再用去离子水洗涤1min。步骤4、去除交联预处理将实验组织芯片在80℃水浴中预热好的nascn液中浸泡20-30min后，在室温的去离子水中浸泡2次，3min/次；上述nascn液的体积为10-15ml。步骤5、蛋白酶k消化将实验组织芯片放入预热好的蛋白酶k工作液中，在37℃下孵育10-60min后，用去离子水漂洗2次，5min/次。步骤6、观察细胞消化效果和重复消化日常室内光线下，在实验组织芯片的各组织切面上分别覆盖适量的去离子水，使用40倍物镜白光镜下分别观察每个组织切面，如果细胞形态结构清晰，细胞核突显，核内透亮，染色质/体呈清晰小黑点分布于细胞核内，胞质透亮，细胞膜变透明，则判断为消化到位；全部组织切面消化不到位时，直接去除所有的去离子水后，再次放入蛋白酶k里消化；个别组织消化不到位时，直接去除其表面的去离子水后，平放在水浴箱的湿盒中，用移液枪量取适量蛋白酶k工作液，滴加在消化不到位的组织切面上，反复2-3次，3min/次，再观察细胞消化效果，直至实验组织芯片上的组织切面全部消化到位。本发明的步骤6处理步骤少、时间短；不需要镜油和复染剂，因此也不存在被两者干扰而影响探针杂交的风险；不存在洗脱盖玻片造成的组织破损或掉片风险；特别是不好消化的组织切面需要多次消化时，本发明的优势更加明显。传统的单片方法和芯片方法，是在暗室中红灯光线下，梯度酒精脱水3min、烤片仪干片3min、染dapi复染剂及静置15min，滴加镜油，40倍物镜汞灯下红、绿、蓝三色光不断切换观察对比，需要根据三色光的消化效果综合起来判断最后才能判断。当组织切面消化不到位时，又需要祛镜油3min、洗脱盖玻片10min、洗脱dapi复染剂10min；再重复蛋白酶k消化跟观察的步骤。传统的单片方法和芯片方法存在共同缺陷：处理步骤多、时间长；长时间暗室紧张工作造成工作人员疲劳，影响准确率和工作效率；三色光综合判断难度比较大，经常存在矛盾；三色光切换繁琐，光线对人体健康特别是皮肤有威胁；在处理消化不到位的情况时镜油或复染剂不容易洗干净，影响探针杂交；洗脱盖玻片容易造成组织破损或掉片；特别是不好消化的组织切面需要多次消化时，以上劣势更加明显。传统的芯片方法还因为没有对组织切面进行统筹归类，异质性大，导致各组织切面的消化时间跨度大，无法达到近同步的消化效果。步骤7、变性和杂交在暗室中，在组织切面上滴加5μl探针混合物，加盖盖玻片，并用软质胶封边，再进行变性和杂交处理；变性的条件为78℃，5min；杂交的条件为37℃，16-20h。本发明的步骤7，一次仅用5μl探针混合物完成6例组织切面的滴加，节省杂交仪的空间，明显提高效率。传统的单片方法，一次使用10μl探针混合物完成1例组织切面的滴加，浪费杂交仪的空间，效率低。上述各步骤中，“室温”理解为25℃，操作的温度条件不宜过低或者过高。通过上述方法，本发明通过“先划实验区域再切取组织切面”的选材步骤，最大限度地保证蜡块的完整性；所切取的组织切面面积小，可以节省实验试剂、减少工作人员的动作量，提高工作效率和准确率；在一个玻片上铺设多个组织切面，可以减少后续处理步骤，进一步提高工作效率，并节省档案的存档空间；观察细胞消化效果的流程处理步骤少、时间短，无需镜油和复染剂，降低成本，并避免被两者干扰而影响探针杂交的风险，并且不会存在组织破损或掉片风险。由此，本发明可以极大的降低实验的材料成本和人工成本，并提高工作效率和准确率。此外，本发明的实验区域的形状为3×3mm2的方形，方形相邻两边互不接触，相邻两边的端部距离为0.5mm，可以保证切片完整性，不翻转，不卷曲。以下通过实验数据说明本发明的优势。每张组织芯片选一例，进行单独实验，对比实验结果是否相符。选15例ihc(3+)病例，其中8例fish检测存在her-2基因扩增，7例fish检测存在her-2基因未见扩增；选7例ihc(2+)病例，其中2例fish检测存在her-2基因扩增，5例fish检测存在her-2基因未见扩增；选2例ihc(+)病例，其中1例fish检测存在her-2基因扩增，1例fish检测存在her-2基因未见扩增；选2例ihc(-)病例；选2例ihc(3+)及1例ihc(2+)扩增效果不满意病例。其中实验组her-2基因扩增结果如下：标准化实验对照组her-2基因扩增结果如下：标准化实验对照组her-2基因扩增结果与实验组结果完全相符。本发明与传统实验方法使用的探针混合物的剂量对比如下：可以看出本发明在处理一张组织芯片时使用的探针混合物剂量仅为传统方法的1/2，而本发明的一张组织芯片上铺设有6个甚至更多组织切面，理论上可以节省传统方法的11/12的试剂，152例标本全部完成实验实际节约82.24％。传统实验方法部分步骤及耗时如下：梯度酒精干片复染dapi祛镜油洗脱盖玻片洗脱dapi共计3min3min15min3min10min10min44min本发明比传统方法单次观察消化效果减少表格中的6个实验步骤，降低耗时至少44分钟，而本发明的一张组织芯片上铺设有6个甚至更多组织切面，相当于减少24个实验步骤、节约264min；152例标本全部完成实验共减少912个实验步骤，降低耗时6688min。上述实施例并非限定本发明的产品形态和式样，任何所属
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的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。当前第1页12