本申请涉及医疗检测技术领域，特别是涉及一种同型半胱氨酸检测试剂盒。
背景技术：
同型半胱氨酸(HCY)被称为“21世纪的胆固醇”，其水平的升高与人一生中多种重大疾病相关。同型半胱氨酸水平增高，它产生的超氧化物和过氧化物可直接损伤血管内皮细胞；同型半胱氨酸还刺激血管平滑肌细胞的增殖，参与动脉粥样硬化形成；它还可破坏正常凝血机制，增加血栓形成的机会。《中国高血压防治指南》(2010年修订版)已经将血同型半胱氨酸升高列为影响高血压患者心脑血管预后的重要因素。同时同型半胱氨酸还是孕妇早产、老年抑郁、老年痴呆、老年骨质疏松等疾病发病的独立危险因素。
循环酶法是目前诊断同型半胱氨酸的主流方法之一。其检测原理为同型半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶催化下，和丝氨酸反应生成L-胱硫醚，L-胱硫醚在胱硫醚-β-裂解酶催化下又生成同型半胱氨酸、丙酮酸和氨。该循环反应生成的丙酮酸可用乳酸脱氢酶(LDH)和还原型辅酶I(NADH)检测到，NADH转变成NAD+的速率与同型半胱氨酸含量成正比，测定NADH降低速率可以得到同型半胱氨酸的含量。该方法中，参与反应的胱硫醚-β-裂解酶会与丝氨酸发生反应，导致试剂的背景值偏高，高的试剂背景会导致测试重复性变差，从而影响试剂的准确度判断。降低试剂中的丝氨酸及胱硫醚-β-裂解酶的含量虽能降低试剂的背景值，但对试剂的稳定性及灵敏度又会有明显的影响。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明的目的为提供一种同型半胱氨酸检测试剂盒，具有背景低、稳定性好、检测准确度高等优点。
本发明提供的技术方案如下：
一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，
所述试剂R1包括：丝氨酸、NADH、同型半胱氨酸还原剂、乳酸脱氢酶、缓冲剂；
所述试剂R2包括：胱硫醚-β-合成酶、胱硫醚-β-裂解酶、5-磷酸吡哆醛酯一水合物、甘油、聚乙二醇、缓冲剂。
优选地，所述试剂R1包括：
丝氨酸 0.2-2.0mmol/L，
NADH 0.2-2.0mmol/L，
同型半胱氨酸还原剂 1.0-5.0mmol/L，
乳酸脱氢酶 10-100KU/L，
缓冲剂 50-200mmol/L；
所述试剂R2包括：
胱硫醚-β-合成酶 0.1-5.0g/L，
胱硫醚-β-裂解酶 0.1-5.0g/L，
5-磷酸吡哆醛酯一水合物 0.001-0.005mmol/L，
甘油 0.5-5％，
聚乙二醇 0.5-5％，
缓冲剂 50-200mmol/L。
优选地，所述同型半胱氨酸还原剂具体为三(2-羧乙基)膦盐酸盐、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇中的任意一种或多种。
优选地，所述缓冲剂具体为三羟基氨基甲烷缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、三乙醇胺、3-(N-吗啉)丙磺酸中的任意一种或多种。
优选地，所述试剂R1还包括表面活性剂、防腐剂中的一种或多种；所述试剂R2还包括保护剂、表面活性剂、防腐剂中的一种或多种。
优选地，所述试剂R1或试剂R2中表面活性剂的用量为0.01％-0.5％；
所述试剂R1中防腐剂的用量为0.05％-0.2％，所述试剂R2中防腐剂的用量为0.05％-1.0％；
所述试剂R2中保护剂的用量为0.5％-5％。
优选地，所述表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮、曲拉通、月桂醇聚氧乙烯醚中的任意一种或多种。
优选地，所述聚乙烯吡咯烷酮平均分子量为8000-100000。
优选地，所述防腐剂为叠氮钠、硫酸庆大霉素、硫柳汞中的任意一种或多种。
优选地，所述保护剂为甘油、巯基乙醇、海藻糖、可溶性淀粉的任意一种或多种。
针对现有技术存在的问题，本申请提供一种同型半胱氨酸检测试剂盒，具有背景低、稳定性好、检测准确度高等优点。胱硫醚-β-裂解酶(CBL)本身稳定性不好且会和丝氨酸反应，导致试剂的背景值上升。所以，通常情况下为了提高试剂的稳定性，会使用较高浓度的CBL的，牺牲背景值。而本试剂通过添加聚乙二醇和甘油的保护剂组合，能很好的解决CBL稳定性不好的问题。使试剂中CBL的含量降低，达到降低背景的效果，同时比提高酶含量的稳定性更好的效果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件上，它可以直接在另一个元件上或者间接设置在另一个元件上；当一个元件被称为是“连接于”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或间接连接至另一个元件上。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本申请的描述中，多个”、“若干个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
本申请实施例采用递进的方式撰写。
本发明实施例提供一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，
所述试剂R1包括：丝氨酸、NADH、同型半胱氨酸还原剂、乳酸脱氢酶、缓冲剂；
所述试剂R2包括：胱硫醚-β-合成酶、胱硫醚-β-裂解酶、5-磷酸吡哆醛酯一水合物、甘油、聚乙二醇、缓冲剂。
针对现有技术存在的问题，本申请提供一种同型半胱氨酸检测试剂盒，具有背景低、稳定性好、检测准确度高等优点。胱硫醚-β-裂解酶(CBL)本身稳定性不好且会和丝氨酸反应，导致试剂的背景值上升。所以，通常情况下为了提高试剂的稳定性，会使用较高浓度的CBL的，牺牲背景值。而本试剂通过添加聚乙二醇和甘油的保护剂组合，能很好的解决CBL稳定性不好的问题，使试剂中CBL的含量降低，达到降低背景的效果，同时比提高酶含量的稳定性更好的效果。
本申请中使用的聚乙二醇聚合度优选为2000-12000，更优选聚合度为6000-8000。
优选地，所述试剂R1包括：
丝氨酸 0.2-2.0mmol/L，
NADH 0.2-2.0mmol/L，
同型半胱氨酸还原剂 1.0-5.0mmol/L，
乳酸脱氢酶 10-100KU/L，
缓冲剂 50-200mmol/L；
所述试剂R2包括：
胱硫醚-β-合成酶 0.1-5.0g/L，
胱硫醚-β-裂解酶 0.1-5.0g/L，
5-磷酸吡哆醛酯一水合物 0.001-0.005mmol/L，
甘油 0.5-5％，
聚乙二醇 0.5-5％，
缓冲剂 50-200mmol/L。
优选地，所述同型半胱氨酸还原剂具体为三(2-羧乙基)膦盐酸盐、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇中的任意一种或多种。
同型半胱氨酸在血液中部分以同型半胱氨酸-半胱氨酸二硫化物存在，微量以游离型同型半胱氨酸存在，大部分通过二硫键与白蛋白结合而存在。本申请中使用同型半胱氨酸还原剂，是将同型半胱氨酸还原为游离型同型半胱氨酸，游离型同型半胱氨酸再经胱硫醚-β-合成酶循环催化进行检测。游离同型半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶催化下和丝氨酸反应生成L-胱硫醚。L-胱硫醚在胱硫醚-β-裂解酶催化下又生成同型半胱氨酸、丙酮酸和氨。该循环反应生成的丙酮酸可用乳酸脱氢酶和NADH检测到。本申请中所用同型半胱氨酸还原剂具体为三(2-羧乙基)膦盐酸盐、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇中的任意一种或多种，优选使用三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)。
优选地，所述缓冲剂具体为三羟基氨基甲烷缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、三乙醇胺、3-(N-吗啉)丙磺酸中的任意一种或多种。
缓冲剂能够平衡试剂的pH，使体系的pH始终处于适合酶保存和发挥活性的范围内。本申请所用的缓冲剂具体为三羟基氨基甲烷缓冲液(Tris-HCl)、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液(Pipes)、三乙醇胺(TEA)、3-(N-吗啉)丙磺酸(Mops)中的任意一种或多种。
优选地，所述试剂R1还包括表面活性剂、防腐剂中的一种或多种；所述试剂R2还包括保护剂、表面活性剂、防腐剂中的一种或多种。
使用防腐剂，可以使得检测试剂盒在长期存储后仍能保证检测结果的精准。表面活性剂，可以排除待检测样本中某些物质的干扰，降低非特异性的结合，提高检测结果的准确度。而保护剂可以降低体系的极性，有助于蛋白结构的稳定，而有些大分子的保护剂能够在蛋白表面形成一层保护膜，使蛋白结构免遭破坏，提高试剂的稳定性。
聚乙二醇本身为表面活性剂的一种，甘油本身为保护剂中的一种，但申请人通过实验发现聚乙二醇和甘油组合使用，可以很好的解决CBL稳定性不好的问题，使试剂中CBL的含量降低，达到降低背景的效果，同时比提高酶含量的稳定性更好的效果。除了聚乙二醇和甘油之外，本申请还可以加入其它表面活性剂、保护剂，以及防腐剂配合使用，进一步提高试剂的稳定性。
优选地，所述试剂R1或试剂R2中表面活性剂的用量为0.01％-0.5％；
所述试剂R1中防腐剂的用量为0.05％-0.2％，所述试剂R2中防腐剂的用量为0.05％-1.0％；
所述试剂R2中保护剂的用量为0.5％-5％。
优选地，所述表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、曲拉通(TX-100)、月桂醇聚氧乙烯醚(Brij-35)中的任意一种或多种。
优选地，所述聚乙烯吡咯烷酮平均分子量为8000-100000。
优选地，所述防腐剂为叠氮钠、硫酸庆大霉素、硫柳汞中的任意一种或多种。
优选地，所述保护剂为甘油、巯基乙醇、海藻糖、可溶性淀粉的任意一种或多种。
实施例1-3
实施例1-3和对比例1-2提供一种同型半胱氨酸检测试剂盒，试剂背景低且稳定性能好，由试剂R1及R2组成。所述试剂的R1及R2成分及浓度见表1所示：
表1
对比例3
对比例3使用已上市的某国产同类型同型半胱氨酸检测试剂。
国产同类型同型半胱氨酸检测试剂是使用胱硫醚方法学的检测试剂，其中含有R1：乳酸脱氢酶35KU/L丝氨酸0.76mmol/L还原型辅酶0.47mmol/L；R2：胱硫醚-β-合成酶20KU/L胱硫醚-β-裂解酶10KU/L。
将实施例1-3及对比例1-3的同型半胱氨酸检测试剂，用日立7600全自动生化分析仪对空白样本(生理盐水)及朗道购买的同型半胱氨酸质控品(水平1：靶值11.5、水平2靶值28.7)进行测试。
具体地，用实施例1-3及对比例1-3的同型半胱氨酸检测试剂在日立7600全自动生化分析仪对空白样本(生理盐水)测试10次，记录原始吸光度值，结果如表2所示。将实施例1-3及对比例1-3的试剂在37℃保存，每隔1天取样一次，检测7天内试剂的稳定性，结果如表3所示：
表2试剂背景值
表3稳定性测试结果
从上面数据可知，实施例1-实施例3的试剂在试剂背景降低的情况下，其稳定性得到了明显的改善，在37℃条件下放置7天后的测试结果依然稳定。而对比例1-3的试剂的背景较高，且在37℃7天后明显衰减。其中，对比例2的试剂背景虽然明显降低，但是试剂的稳定性与实施例1比无改善甚至有衰减更明显的趋势。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。