一种诊断膀胱癌试剂盒的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种诊断膀胱癌试剂盒。

背景技术：

世界范围内膀胱尿路上皮癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤，美国每年新增病例约76960例，死亡16390例。根据2017年临床肿瘤杂志发表的最新统计数据显示，膀胱癌发病率已位居美国男性最常见恶性肿瘤第4位^[1]。在我国其发病率及病死率均列泌尿生殖系统肿瘤的首位。2015年全国新确诊为膀胱癌的患者人数超过8万，导致的死亡人数超过3万，约70％以上首诊时是浅表性癌，30％肿瘤为侵袭性膀胱癌^[2,3,4]。另外，大约60％浅表性膀胱癌会复发，且20-30％会进展为肌层浸润肿瘤^[5]。当肿瘤侵袭，长期存活率显著降低。局限性肿瘤的5年总生存率为71％而转移癌的5年生存率仅5％^[6]。目前临床上缺乏膀胱癌的早期诊断标志物，而膀胱镜检又会给患者带来痛苦。因而发现新的膀胱癌的标志物尤为重要。

bub1被看做原癌基因是纺锤体检查点系统的一个重要组成部分，它参与检测纺锤体形成过程中微管与染色体动粒的结合。细胞在长期的进化过程中产生的监控纺锤体形态、染色体着丝点与微管联接及其产生的张力、染色体排列、确保姐妹染色单体精确分离的质控机制，即纺锤体检查点，又称有丝分裂检查点^[7]。蛋白激酶bub1作为纺锤体检查点的平台蛋白,可能是纺锤体检查点其他组分定位于纺锤体检查点的基础。

关于bub1与膀胱癌的关系及其机制的研究还鲜有报道，本发明通过临床数据和基础生物实验数据来研究bub1与膀胱癌之间的关系，本发明的成果可以为临床诊断膀胱癌提供新的方法。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种用于人的bub1蛋白进行膀胱癌检测和分型的试剂盒。

本发明的技术方案概述如下：

本发明首次发现bub1蛋白的表达量与膀胱癌具有一定的相关性，利用这种bub1蛋白的表达量与膀胱癌的相关性，可以将特异性抗bub1蛋白的抗体即bub1抗体用于制备诊断膀胱癌的试剂盒。

一种诊断膀胱癌试剂盒，包括：bub1抗体、二甲苯、乙醇、3％h2o2溶液、1％bsa封闭液、dab显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg、0.01m的ph＝6.0柠檬酸盐缓冲液和0.01mpbs。

本发明的优点和有益效果：

利用本发明的试剂盒，依据前期研究的临床数据和基础生物实验数据中bub1与膀胱癌之间的强相关性。基于bub1蛋白的表达量与膀胱癌的这种相关性，以该蛋白作为分子标记对其表达量进行检测可以用于快速指导诊断膀胱癌病人的判断。

附图说明

图1是敲减bub1蛋白能够有效抑制膀胱癌t24细胞(a)和5637(b)的生长。

图2是敲减bub1蛋白能够抑制膀胱癌t24细胞(a)和5637(b)的侵袭。

图3是蛋白免疫印记实验分析sirna敲减bub1蛋白的表达。其中(a为t24细胞)、(b为5637细胞)。

图4膀胱癌病例免疫组化评分+，无转移生长，免疫组化评分++有远处转移。其中图a,b为正常膀胱组织，c为低级别膀胱癌组织，d为高级别膀胱癌组织。

图5是膀胱癌病例的bub1表达量与病人生存率的关系。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

所述的bub1抗体为商品化抗体，制备方法参见文献：

yokoyamawm,etal.2001.productionofmonoclonalantibodies.currentprotocolsinimmunology.74:2.5.1-2.5.25.)相应的，利用特异性抗bub1蛋白的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体。

实施例1

一种诊断膀胱癌试剂盒，包括：bub1抗体、二甲苯、乙醇、3％h2o2溶液、1％bsa封闭液、dab显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg、0.01m的ph＝6.0柠檬酸盐缓冲液和0.01mpbs。

实施例2

3×10³敲减bub1蛋白的5637和t24膀胱癌细胞和对照细胞(正常5637和t24细胞)分别接种于96孔板中，分别于24,48,72和96小时mtt法(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-h-tetrazoliumbromide)检测肿瘤细胞生长活性，分管光度计检测细胞吸光度，求平均值并计算标准差。结果显示，与对照细胞相比较，敲减bub1的膀胱癌细胞体外生长能力显著减弱(图1a为t24细胞,b为5637细胞)，提示bub1可能增加膀胱癌细胞生长活力。

实施例3

2×10⁴敲减bub1蛋白的5637膀胱癌细胞和对照细胞(正常5637细胞)分别接种于聚碳酸酯膜小室(corning公司产品)的上层，培养24小时后用结晶紫将穿过聚碳酸酯膜的细胞染色后，在显微镜下观察并照相，分别记数每个视野穿过聚碳酸酯膜的癌细胞，求平均值并计算标准差。结果显示，与对照细胞相比较，敲减bub1蛋白的膀胱癌细胞体外迁移能力显著减少(图2a为t24细胞,b为5637细胞)，提示bub1蛋白可能增加膀胱癌细胞转移。

实施例4

免疫印迹(westernblot)检测bub1蛋白表达水平：转染细胞48h后，用细胞裂解液(150mm氯化钠+1％np-40(去垢剂)+0.1％sds(去垢剂)+2ug/mlaprotinin(蛋白酶抑制剂)(使用前加入)+2ug/mlleupeptin(蛋白酶抑制剂)(使用前加入)或1mmpmsf(蛋白酶抑制剂)+1.5mmedta(蛋白酶抑制剂)收集细胞，用bca蛋白检测试剂盒进行蛋白浓度的测定，各实验组取40ug蛋白进行sds-page跑胶，转膜，5％脱脂奶粉封闭，接着加入bub1抗体和内参抗体(gapdh)在4c°冰箱孵育过夜，膜用tbst液洗涤3次，然后再用辣根过氧化酶(hrp)标记的山羊抗小鼠(中杉金桥有限公司，1:5000)室温孵育1h。用ecl免疫印迹化学发光试剂孵育5分钟后曝光、显影、定影。结果如图3所示，sirna1,sirna2分别能够显著抑制bub1的表达。

实施例5

随机选取3例膀胱癌患者术后膀胱癌组织的石蜡切片，使用实施例1制备的诊断膀胱癌试剂盒验证对膀胱癌的诊断：包括如下步骤：

(1)将膀胱癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜；

(2)切片脱腊脱水；步骤为：将烤箱过夜石蜡切片于：

二甲苯ⅰ10min→二甲苯ⅱ10min→二甲苯ⅲ10min→100％乙醇5min→95％乙醇5min→85％乙醇5min→75％乙醇5min→双蒸水5min(ⅰ代表第一个容器，ii代表第二个容器，ⅲ代表第三个容器)；

(3)3％h2o2溶液，室温浸泡20min；

(4)双蒸水洗5min×3；

(5)抗原修复：切片放入0.01m柠檬酸盐缓冲液(ph6.0)中煮沸30min；

(6)自然冷却至室温，双蒸水洗5min×3；

(7)37℃，1％bsa封闭液封闭30min；

(8)甩去所述封闭液，加一抗(bub1抗体，稀释比例1：200)置入湿盒中4℃冰箱放置16小时；

(9)室温复温15min，然后0.01mpbs洗5min×4；

(10)滴加二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠igg，购自中国中山金桥公司，即用型，无需稀释)45min，37℃；

(11)0.01mpbs洗5min×4，dab显色试剂显色2-10min，镜下观察；

(12)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；

(13)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；

(14)取出，盖玻片覆盖；

(15)显微镜下观察阳性染色，分别于癌组织和癌旁组织各随机选取5个视野，拍照；

(16)由2位经验丰富的病理医师进行双盲阅片。计算出bub1免疫组化得分。

bub1阳性表达为细胞胞膜和(或)胞浆上呈现棕黄色颗粒；采用半定量结果判断，分别对镜下阳性细胞的百分比和染色强度给予评分。①阳性着色细胞数：每张切片上观察5个高倍视野(×200)，计数阳性细胞百分比，阳性细胞数<5％为0分，5％～25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，76％～100％为4分。②阳性着色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。③两者计分相乘即为阳性等级：0分为阴性(-)，1-4分为弱阳性(+)，5-8分为阳性(++)，9-12分为强阳性(+++)。

bub1高低表达标准以评分高于++为bub1蛋白高表达，低于+为bub1蛋白低表达。

结果：病例1免疫组化评分为+++；病例2为+；病例3为+。

实施例6

样本：某膀胱癌患者肿瘤的组织切片，采用本发明的实施例1的试剂盒，采用实施例5的检测方法，检测bub1蛋白在癌组织中的表达量。癌组织的显微图片如图4c所示。经计算，该组织的免疫组化评分++。结合临床病理分级诊断为浅表膀胱癌，未发生浸润和远处转移。

实施例7

样本：某膀胱癌癌患者肿瘤的组织切片，采用本发明的实施例1的试剂盒，采用实施例5的检测方法，检测bub1蛋白在癌组织中的表达量，癌组织的显微图片如图4d所示。经计算，该组织的免疫组化评分+++，诊断为膀胱癌(结合临床，并为病理医师确认)。

由以上试验结果可知，采用本发明的试剂盒能帮助诊断膀胱癌。当免疫组化评分高于+++时，膀胱癌可能性高。显然，bub1蛋白与膀胱癌的转移潜能具有相关性，因此，以bub1蛋白作为蛋白质分子标记对其表达量进行检测能帮助诊断膀胱癌。相应的，特异性抗bub1蛋白的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，能用于制备诊断膀胱癌试剂盒。

实施例8

将实施例4,5的bub1表达量的结果与患者生存率进行分析，如图5所示，高表达量的bub1(high)的患者生存率要低于低表达量bub1的患者(low)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

参考文献

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