本发明涉及一种过渡金属纳米材料电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用，更具体而言，本发明是采用mwcnts-nh2@nafion溶液作为基底材料，负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球为二抗标记物，bnqds为共反应剂，通过层层自组装构建的心肌钙蛋白i免疫传感器，可以实现对心肌钙蛋白i的特异性检测，属于新型传感器构建技术领域。
背景技术：
早期、准确地治疗心肌损伤是非常有益的，可以防止对心脏的不可逆损害，特别是急性心肌梗死患者，并能显著提高生存率。而心肌肌钙蛋白是心肌收缩的一种调节蛋白，位于心肌肌纤蛋白双股的一定位置。当心肌损伤发生时，心肌钙蛋白i会迅速释放到血液中，其中心肌损伤的程度与心肌钙蛋白i释放到血液中的量成正比。目前，心肌钙蛋白i已被公认为诊断急性心肌梗死和急性冠状动脉综合征的标志物。到目前为止，已经建立了多种检测心肌钙蛋白i的分析方法，如液相色谱，毛细管电泳法和表面等离子共振检测方法等，但多数方法需要的仪器设备昂贵，样品准备耗时长，不适于大量样品的筛选。因此，需要建立一种灵敏度高、响应速度快和操作简便的心肌钙蛋白i测量方法。电致化学发光免疫传感器，尤其是夹心型电致化学发光免疫传感器以其灵敏度高、成本低和响应时间快等优点，在生物分析中引起了广泛的兴趣。
本发明基于纳米功能材料构建了一种新型的电致化学发光免疫传感器，用于心肌钙蛋白i的检测。利用mwcnts-nh2@nafion溶液作为基底材料，负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球为二抗标记物，氮化硼量子点bnqds为共反应剂。测试结果显示该电致化学发光免疫传感器灵敏度高，稳定性好，检出限低，基于上述发现，发明人完成了本发明。
技术实现要素：
本发明的目的之一是以mwcnts-nh2@nafion溶液作为基底材料，利用抗原抗体的特异性结合，构建一种选择性好、快速且超灵敏的电致化学发光免疫传感器，实现心肌钙蛋白i的简单、灵敏检测。
本发明的目的之二是以负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球为二抗标记物，提供了一种基于过渡金属材料核壳结构mo2c@c纳米球的电致化学发光免疫传感器的制备方法，该方法制备的传感器稳定性好、选择性好、灵敏度高和重现性好。
本发明的目的之三是以bnqds为共反应剂，构建一种新型的基于核壳结构mo2c@c纳米球的心肌钙蛋白i免疫传感器。
本发明的技术方案
1.一种基于核壳结构mo2c@c纳米球的心肌钙蛋白i免疫传感器的构建
（1）用al2o3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极，依次用无水乙醇和超纯水分别超声清洗30min，将6µl、0.1~1.0mgml-1的氨基修饰的多壁碳纳米管@全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物mwcnts-nh2@nafion溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
（2）将6µl、10mmoll-1的三联吡啶钌溶液滴涂到电极表面，室温下晾干；
（3）将3µl的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/n-羟基琥珀酰亚胺edc/nhs溶液滴加到电极表面，以活化mwcnts-nh2@nafion中的氨基，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液pbs冲洗电极，室温下晾干；
（4）将6µl、5~15µgml-1的心肌钙蛋白i捕获抗体ctni-ab1，3µl、质量分数为0.5%~2.0%的牛血清白蛋白bsa溶液滴加到电极表面，用ph为7.4的pbs冲洗电极，室温下晾干；
（5）滴加6µl、10-4~50ngml-1的一系列不同浓度的心肌钙蛋白i抗原到电极表面，孵化2h，用ph为7.4的pbs冲洗电极，室温下晾干；
（6）滴加6µl负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球的二抗标记物mo2c@c/pei-ab2溶液，室温下晾干，制得一种基于核壳结构mo2c@c纳米球的心肌钙蛋白i免疫传感器。
2.mwcnts-nh2@nafion溶液的制备
将0.4g二环乙基碳化二亚胺dcc和20mg羧基化的碳纳米管mwcnts-cooh加入到2.5ml乙二胺eda溶液中，在120℃下加热反应4天，通过离心分离得到沉淀物，并分别用超纯水和无水乙醇反复洗涤沉淀物得到氨基化碳纳米管mwcnts-nh2，将其置于35℃下真空干燥，随后称取0.04~0.4mg的mwcnts-nh2样品分散在0.4ml、质量分数为0.5%的全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物nafion溶液中，通过超声处理20min后获得均匀的mwcnts-nh2@nafion溶液。
3.负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球的二抗标记物mo2c@c/pei-ab2溶液制备
（1）核壳结构mo2c@c纳米球的制备
将12~30mg钼酸铵与500~1200mg葡萄糖先后溶于45ml超纯水，然后转移到高压反应釜中，使其在180℃反应10h，反应结束后，将产物置于离心管中进行离心，用无水乙醇和超纯水分别洗涤三次，随后置于25℃下真空干燥12h，将所得到的样品进行研磨，并使用管式炉在氩气下800℃煅烧2h，得到核壳结构mo2c@c纳米球；
（2）负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球的二抗标记物mo2c@c/pei-ab2溶液制备
将3.0ml、1.0mgml-1的核壳结构mo2c@c纳米球分散在12ml含有0.625moll-1氯化钾和1.25mgml-1pei的混合溶液中，超声2h后震荡12h，得到均一的黑色溶液，离心收集固体产物，用超纯水洗三次并将其分散于6ml的超纯水中得到mo2c@c/pei溶液，随后移取1ml上述溶液，并加入200µl心肌钙蛋白i检测抗体ctni-ab2，在4℃下震荡孵化12~24h后离心，将该固体重新分散于1ml、ph为7.4的pbs中即得到负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球的二抗标记物mo2c@c/pei-ab2。
4.心肌钙蛋白i的检测
（1）将参比电极-ag/agcl电极、对电极-铂丝电极和所修饰好的工作电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，在电解池中加入10ml含有nacl的三正丙胺溶液和bnqds的混合溶液，二者的体积比例为5:1，其中三正丙胺溶液的浓度为1~5mmoll-1；
（2）用循环伏安法对不同浓度的心肌钙蛋白i标准溶液进行检测，光电倍增管的高压设置为800v，扫描电压设置为0~1.0v；
（3）根据所得的电化学发光强度值与心肌钙蛋白i浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。
本发明的有益成果
（1）本发明的发明人将mwcnts-nh2@nafion溶液作为基底材料，由于mwcnts-nh2@nafion具有良好的导电性和大的比表面积，提高了传感器的灵敏度和稳定性；
（2）本发明将负载有pei的核壳结构mo2c@c纳米球的二抗标记物mo2c@c/pei-ab2应用到电致化学发光免疫传感器的制备当中，由于核壳结构mo2c@c纳米球具有良好的导电性和稳定的化学性质，提高了传感器的稳定性和重现性；
（3）本发明采用bnqds为共反应剂，构建了一个基于核壳结构mo2c@c纳米球的心肌钙蛋白i免疫传感器，并且对心肌钙蛋白i进行了有效的检测，此方法操作较为简单；
（4）本发明制备的电致化学发光免疫传感器用于心肌钙蛋白i的检测，该电致化学发光免疫传感器稳定性高，重现性好，灵敏度高，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。
具体实施方式
实施例1一种基于核壳结构mo2c@c纳米球的心肌钙蛋白i免疫传感器的构建
（1）用al2o3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极，依次用无水乙醇和超纯水分别超声清洗30min，将6µl、0.1mgml-1的氨基修饰的多壁碳纳米管@全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物mwcnts-nh2@nafion溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
（2）将6µl、10mmoll-1的三联吡啶钌溶液滴涂到电极表面，室温下晾干；
（3）将3µl的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/n-羟基琥珀酰亚胺edc/nhs溶液滴涂到电极表面，以活化mwcnts-nh2@nafion中的氨基，用ph为7.4的pbs冲洗电极，室温下晾干；
（4）将6µl、5µgml-1的心肌钙蛋白i捕获抗体ctni-ab1，3µl、质量分数为0.5%的牛血清白蛋白bsa溶液滴涂到电极表面，用ph为7.4的pbs冲洗电极，室温下晾干；
（5）滴加6µl、10-4~50ngml-1的一系列不同浓度的心肌钙蛋白i抗原到电极表面，孵化2h，用ph为7.4的pbs冲洗电极，室温下晾干；
（6）滴加6µl负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球的二抗标记物mo2c@c/pei-ab2溶液，室温下晾干，制得一种基于核壳结构mo2c@c纳米球的心肌钙蛋白i免疫传感器。
实施例2一种基于核壳结构mo2c@c纳米球的心肌钙蛋白i免疫传感器的构建
（1）用al2o3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极，依次用无水乙醇和超纯水分别超声清洗30min，将6µl、0.5mgml-1的氨基修饰的多壁碳纳米管@全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物mwcnts-nh2@nafion溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
（2）将6µl、10mmoll-1的三联吡啶钌溶液滴涂到电极表面，室温下晾干；
（3）将3µl的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/n-羟基琥珀酰亚胺edc/nhs溶液滴涂到电极表面，以活化mwcnts-nh2@nafion中的氨基，用ph为7.4的pbs冲洗电极，室温下晾干；
（4）将6µl、10µgml-1的心肌钙蛋白i捕获抗体ctni-ab1，3µl、质量分数为1%的牛血清白蛋白bsa溶液滴加到电极表面，用ph为7.4的pbs冲洗电极，室温下晾干；
（5）滴加6µl、10-4~50ngml-1的一系列不同浓度的心肌钙蛋白i抗原到电极表面，孵化2h，用ph为7.4的pbs冲洗电极，室温下晾干；
（6）滴加6µl负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球的二抗标记物mo2c@c/pei-ab2溶液，室温下晾干，制得一种基于核壳结构mo2c@c纳米球的心肌钙蛋白i免疫传感器。
实施例3一种基于核壳结构mo2c@c纳米球的心肌钙蛋白i免疫传感器的构建
（1）用al2o3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极，依次用无水乙醇和超纯水分别超声清洗30min，将6µl、1.0mgml-1的氨基修饰的多壁碳纳米管@全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物mwcnts-nh2@nafion溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
（2）将6µl、10mmoll-1的三联吡啶钌溶液滴涂到电极表面，室温下晾干；
（3）将3µl的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/n-羟基琥珀酰亚胺edc/nhs溶液滴涂到电极表面，以活化mwcnts-nh2@nafion中的氨基，用ph为7.4的pbs冲洗电极，室温下晾干；
（4）将6µl、15µgml-1的心肌钙蛋白i捕获抗体ctni-ab1，3µl、质量分数为2%的牛血清白蛋白bsa溶液滴加到电极表面，用ph为7.4的pbs冲洗电极，室温下晾干；
（5）滴加6µl、10-4~50ngml-1的一系列不同浓度的心肌钙蛋白i抗原到电极表面，孵化2h，用ph为7.4的pbs冲洗电极，室温下晾干；
（6）滴加6µl负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球的二抗标记物mo2c@c/pei-ab2溶液，室温下晾干，制得一种基于核壳结构mo2c@c纳米球的心肌钙蛋白i免疫传感器。
实施例4mwcnts-nh2@nafion溶液的制备
将0.4g二环乙基碳化二亚胺dcc和20mg羧基化的碳纳米管mwcnts-cooh加入到2.5ml乙二胺eda溶液中，在120℃下加热反应4天，通过离心分离得到沉淀物，并分别用超纯水和无水乙醇反复洗涤沉淀物得到氨基化碳纳米管mwcnts-nh2，将其置于35℃下真空干燥，随后称取0.04mg的mwcnts-nh2样品分散在0.4ml、质量分数为0.5%的全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物nafion溶液中，通过超声处理20min后获得均匀的mwcnts-nh2@nafion溶液。
实施例5mwcnts-nh2@nafion溶液的制备
将0.4g二环乙基碳化二亚胺dcc和20mg羧基化的碳纳米管mwcnts-cooh加入到2.5ml乙二胺eda溶液中，在120℃下加热反应4天，通过离心分离得到沉淀物，并分别用超纯水和无水乙醇反复洗涤沉淀物得到氨基化碳纳米管mwcnts-nh2，将其置于35℃下真空干燥，随后称取0.1mg的mwcnts-nh2样品分散在0.4ml、质量分数为0.5%的全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物nafion溶液中，通过超声处理20min后获得均匀的mwcnts-nh2@nafion溶液。
实施例6mwcnts-nh2@nafion溶液的制备
将0.4g二环乙基碳化二亚胺dcc和20mg羧基化的碳纳米管mwcnts-cooh加入到2.5ml乙二胺eda溶液中，在120℃下加热反应4天，通过离心分离得到沉淀物，并分别用超纯水和无水乙醇反复洗涤沉淀物得到氨基化碳纳米管mwcnts-nh2，将其置于35℃下真空干燥，随后称取0.4mg的mwcnts-nh2样品分散在0.4ml、质量分数为0.5%的全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物nafion溶液中，通过超声处理20min后获得均匀的mwcnts-nh2@nafion溶液。
实施例7负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球的二抗标记物mo2c@c/pei-ab2溶液制备
（1）核壳结构mo2c@c纳米球的制备
将12mg钼酸铵与500mg葡萄糖先后溶于45ml超纯水，然后转移到高压反应釜中，使其在180℃反应10h，反应结束后，将产品置于离心管中进行离心，用无水乙醇和超纯水分别洗涤三次，随后置于25℃下真空干燥12h，将所得到的样品进行研磨，并使用管式炉在氩气下800℃煅烧2h，得到核壳结构mo2c@c纳米球；
（2）负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球的二抗标记物mo2c@c/pei-ab2溶液制备
将3.0ml、1.0mgml-1的核壳结构mo2c@c纳米球分散在12ml含有0.625moll-1氯化钾和1.25mgml-1pei的混合溶液中，超声2h后震荡12h，得到均一的黑色溶液，离心收集固体产物，用超纯水洗三次并将其分散于6ml的超纯水中得到mo2c@c/pei溶液，随后移取1ml上述溶液，并加入200μl心肌钙蛋白i检测抗体ctni-ab2，在4℃下震荡孵化12h后离心，将该固体重新分散于1ml、ph为7.4的pbs中即得到负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球的二抗标记物mo2c@c/pei-ab2。
实施例8负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球的二抗标记物mo2c@c/pei-ab2溶液制备
（1）核壳结构mo2c@c纳米球的制备
将23mg钼酸铵与1000mg葡萄糖先后溶于45ml超纯水，然后转移到高压反应釜中，使其在180℃下反应10h，反应结束后，将产品置于离心管中进行离心，用无水乙醇和超纯水分别洗涤三次，随后置于25℃下真空干燥12h，将所得到的样品进行研磨，并使用管式炉在氩气下800℃煅烧2h，得到核壳结构mo2c@c纳米球；
（2）负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球的二抗标记物mo2c@c/pei-ab2溶液制备
将3.0ml、1.0mgml-1的核壳结构mo2c@c纳米球分散在12ml含有0.625moll-1氯化钾和1.25mgml-1pei的混合溶液中，超声2h后震荡12h，得到均一的黑色溶液，离心收集固体产物，用超纯水洗三次并将其分散于6ml的超纯水中得到mo2c@c/pei溶液，随后移取1ml上述溶液，并加入200μl心肌钙蛋白i检测抗体ctni-ab2，在4℃下震荡孵化18h后离心，将该固体重新分散于1ml、ph为7.4的pbs中即得到负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球的二抗标记物mo2c@c/pei-ab2。
实施例9负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球的二抗标记物mo2c@c/pei-ab2溶液制备
（1）核壳结构mo2c@c纳米球的制备
将30mg钼酸铵与1200mg葡萄糖先后溶于45ml超纯水，然后转移到高压反应釜中，使其在180℃反应10h，反应结束后，将产物置于离心管中进行离心，用无水乙醇和超纯水分别洗涤三次，随后置于25℃下真空干燥12h，将所得到的样品进行研磨，并使用管式炉在氩气下800℃煅烧2h，得到核壳结构mo2c@c纳米球；
（2）负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球的二抗标记物mo2c@c/pei-ab2溶液制备
将3.0ml、1.0mgml-1的核壳结构mo2c@c纳米球分散在12ml含有0.625moll-1氯化钾和1.25mgml-1pei的混合溶液中，超声2h后震荡12h，得到均一的黑色溶液，离心收集固体产物，用超纯水洗三次并将其分散于6ml的超纯水中得到mo2c@c/pei溶液，随后移取1ml上述溶液，并加入200μl心肌钙蛋白i检测抗体ctni-ab2，在4℃下震荡孵化24h后离心，将该固体重新分散于1ml、ph为7.4的pbs中即得到负载有聚乙烯亚胺pei的核壳结构mo2c@c纳米球的二抗标记物mo2c@c/pei-ab2。
实施例10心肌钙蛋白i的检测
（1）将参比电极-ag/agcl电极、对电极-铂丝电极和所修饰好的工作电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，在电解池中加入10ml含有nacl的三正丙胺溶液和bnqds的混合溶液，二者的体积比例为5:1，其中三正丙胺溶液的浓度为1mmoll-1；
（2）用循环伏安法对不同浓度的心肌钙蛋白i标准溶液进行检测，光电倍增管的高压设置为800v，扫描电压设置为0~1.0v；
（3）根据所得的电化学发光强度值与心肌钙蛋白i浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。
实施例11心肌钙蛋白i的检测
（1）将参比电极-ag/agcl电极、对电极-铂丝电极和所修饰好的工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，在电解池中加入10ml含有nacl的三正丙胺溶液和bnqds的混合溶液，二者的体积比例为5:1，其中三正丙胺溶液的浓度为2mmoll-1；
（2）用循环伏安法对不同浓度的心肌钙蛋白i标准溶液进行检测，光电倍增管的高压设置为800v，扫描电压设置为0~1.0v；
（3）根据所得的电化学发光强度值与心肌钙蛋白i浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。
实施例12心肌钙蛋白i的检测
（1）将参比电极-ag/agcl电极、对电极-铂丝电极和所修饰好的工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，在电解池中加入10ml含有nacl的三正丙胺溶液和bnqds的混合溶液，二者的体积比例为5:1，其中三正丙胺溶液的浓度为5mmoll-1；
（2）用循环伏安法对不同浓度的心肌钙蛋白i标准溶液进行检测，光电倍增管的高压设置为800v，扫描电压设置为0~1.0v；
（3）根据所得的电化学发光强度值与心肌钙蛋白i浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。