一种同时检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的生物传感器、其制备方法及其检测方法与流程

本发明属于有害物质检测技术领域，具体涉及一种同时检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的生物传感器、其制备方法与使用该传感器同时检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的方法。

背景技术：

真菌毒素是一大类由丝状真菌产生的具有毒性的次生真菌代谢产物。当摄入超过一定浓度的真菌毒素时，会引起一种称为真菌毒素中毒的毒性反应，也会导致致畸性、致癌性和致突变性。玉米赤霉烯酮(ZEN)是由多种镰刀菌产生的具有类雌激素作用的真菌毒素，玉米赤霉烯酮具有较强生殖毒性和致畸作用，在人体和动物体生殖发育、细胞增殖和器官功能等方面有极大的危害。赭曲霉毒素A(OTA)是一类主要由曲霉属和青霉属等真菌产生的次级代谢产物，在赭曲霉毒素系列中毒性最强，具有致畸、致癌、致突变等作用，会对肝脏肾脏造成损伤，被列为二类致癌物质。真菌毒素污染饲料和食品后，不仅使农业经济受到严重影响，且还会带来严重食品安全问题，威胁到人类健康。因此，开发高灵敏度、高通量、选择性的新方法，特别是同时识别多种真菌毒素仍然是必要的。

传统的检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)以及电泳法。但存在以下缺点：所需的仪器设备昂贵、前处理复杂，操作繁琐，检测成本高，灵敏度低，检测时间较长。

核酸适配体是一类由体外合成的单链核苷酸(DNA/RNA)，常用作生物识别元件，对于特定的靶标具有很高的亲和力和特异性。相比于抗体，适配体对于温度、pH值以及离子等具有很好的稳定性，并且更容易合成和改性、费用更低。核酸适配体传感器技术已经日渐成熟，在检测领域展现出广阔的应用前景。

技术实现要素：

针对现有技术中ZEN和OTA单一检测方法的方案繁琐，操作步骤复杂，检测成本高、花费的时间长等问题，本发明提供了一种以氧化石墨烯为荧光猝灭剂的荧光适配体传感器，以及使用该传感器对ZEN和OTA进行同时检测的方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种同时检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的生物传感器，

所述生物传感器由5’端被荧光基团标记的可特异性识别玉米赤霉烯酮的核酸适配体即ZEN适配体，5’端被荧光基团标记的可特异性识别赭曲霉毒素A的核酸适配体即OTA适配体，和氧化石墨烯自组装形成；

其中，所述氧化石墨烯用作荧光猝灭剂；

所述ZEN适配体的核苷酸序列为：

5’-CTACCAGCTTTGAGGCTCGATCCAGCTTATTCAATTATACCAGCTTATTCAATTATACCAGC-3’；

所述OTA适配体的核苷酸序列为：

5’-AGCCTCGTCTGTTCTCCCGGCGCATGATCATTCGGTGGGTAAGGTGGTGGTAACGTTGGGGAAGACAAGCAGACGT-3’。

在上述方案的基础上，所述ZEN适配体和OTA适配体的荧光基团标记分别为Cy3、Cy5、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594、FAM、ROX中的一种；两者的荧光基团标记的颜色不同且在荧光光谱的激发波长下有不同的最大发射波长。

在上述方案的基础上，所述ZEN适配体的荧光基团标记为Cy3，所述OTA适配体的荧光基团标记为Alexa Fluor 488。

在上述方案的基础上，所述同时检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的生物传感器的制备方法，步骤如下：

将20μL浓度为1μM的ZEN适配体和20μL浓度为1μM的OTA适配体加入到20μL的浓度为5～25μg/mL的氧化石墨烯中，摇匀后在室温下孵育10min，以使ZEN适配体和OTA适配体与氧化石墨烯充分结合，形成ZEN&OTA适配体-氧化石墨烯复合物即为同时检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的生物传感器。

在上述方案的基础上，所述氧化石墨烯的浓度为20μg/mL。

使用上述方法制备的生物传感器同时检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的方法，步骤如下：

将上述方法制备的生物传感器与待测样品按照99:1的体积比混合，于30～50℃水浴1h，以使生物传感器与待测样品充分混合，用荧光分光光度计扫描反应后的溶液分别在512nm和499nm激发波长下的荧光发射光谱，测定荧光强度，将测得的荧光强度导入标准曲线，计算获得待测样品中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的浓度。

在上述方案的基础上，所述水浴温度为45℃。

本发明技术方案的优点：

1)氧化石墨烯可以猝灭90％左右的荧光，创造一个低的背景信号环境，加入靶标后，可以恢复显著荧光信号，实现荧光由开到关的状态变化。

2)操作步骤简单明了，成本低，特异性好，检测范围在1-500ng/mL之间，灵敏度高。

3)本发明的生物传感器可同时检测ZEN和OTA，克服了单一检测方法的方案繁琐，操作步骤复杂，检测成本高、花费的时间长等问题。且两种真菌毒素同时检测互不干扰，准确性高。

附图说明

图1为本发明生物传感器对玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A进行检测的荧光发射光谱图；

图2为本发明生物传感器对玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A进行检测的原子力显微镜图；

图3为对玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A标准品溶液进行检测的标准曲线图；

图4氧化石墨烯浓度的对检测平台背景的影响；

图5孵育温度对生物传感器结合玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的影响；

图6本发明生物传感器的灵敏性检测；

图7本发明生物传感器的特异性检测。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

5’端被荧光基团标记的可特异性识别玉米赤霉烯酮的核酸适配体和5’端被荧光基团标记的可特异性识别赭曲霉毒素A的核酸适配体以及PBS缓冲液(含有NaCl 136.89mM,KCl 2.67mM,Na2HPO4 8.1mM,KH2PO4 1.76Mm,pH＝7.4)由上海生工生物工程有限公司生产；氧化石墨烯采购于南京先丰纳米材料科技有限公司；玉米赤霉烯酮采购于北京美正检测技术有限公司；F-2700荧光分光光度计产自日本日立集团；SPM-9700原子力显微镜产自日本岛津集团。

实施例

(1)ZEN适配体和OTA适配体与氧化石墨烯自组装形成检测平台

预处理：将ZEN适配体和OTA适配体分别用PBS缓冲液(NaCl 136.89mM,KCl 2.67mM,Na2HPO4 8.1mM,KH2PO4 1.76Mm,pH＝7.4)溶解至1μM的浓度，放置于4℃下用锡箔纸避光保存。ZEN适配体和OTA适配体工作液浓度均为1μM。将购买的500μg/mL的氧化石墨烯的悬浮液用超纯水稀释至250μg/mL的浓度，于200W下超声1h，放置于4℃备用。

将20μL的ZEN适配体(1μM)和20μL的OTA适配体(1μM)加入到20μL的浓度为20μg/mL的GO中，摇匀后在室温下孵育10min，以使ZEN适配体和OTA适配体与氧化石墨烯充分结合，ZEN适配体和OTA适配体的荧光被氧化石墨烯完全猝灭，形成ZEN适配体&OTA适配体-氧化石墨烯复合物。

其中，

所述ZEN适配体为：

5’-Cy3-CTACCAGCTTTGAGGCTCGATCCAGCTTATTCAATTATACCAGCTTATTCAATTATACCAGC-3’。

所述OTA适配体为：

5’-Alexa Fluor 488-AGCCTCGTCTGTTCTCCCGGCGCATGATCATTCGGTGGGTAAGGTGGTGGTAACGTTGGGGAAGACAAGCAGACGT-3’。

(2)ZEN适配体和OTA适配体对靶标的特异性识别

将上述方法制备的ZEN&OTA适配体-氧化石墨烯复合物(990μL)与待测样品(10μL)均匀混合，于45℃水浴1h，以使核酸适配体与玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A充分结合，形成ZEN适配体-玉米赤霉烯酮、OTA适配体-赭曲霉毒素复合物，从而使ZEN&OTA适配体从氧化石墨烯表面解吸附，恢复显著荧光。用F-2700荧光分光光度计扫描反应后的溶液在512nm激发波长下的荧光发射光谱，测得玉米赤霉烯酮的荧光强度；用F-2700荧光分光光度计扫描反应后的溶液分别在499nm激发波长下的荧光发射光谱，测得赭曲霉毒素A的荧光强度。

如图1所示，ZEN适配体和OTA适配体自身均具有很强的荧光，当其与氧化石墨烯混合后，ZEN适配体和OTA适配体被氧化石墨烯吸附，由于荧光共振能量转移作用，ZEN适配体和OTA适配体的荧光被氧化石墨烯猝灭，形成一个低背景信号环境。当加入玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A孵育后，出现了显著的荧光恢复，ZEN适配体、OTA适配体从氧化石墨烯表面解吸下来分别与玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A形成复合物。ZEN适配体的最大发射波长在560～570nm之间，OTA适配体的最大发射波长在520～540nm之间；由图可以看出，在荧光光谱的激发波长下两者有不同的最大发射波长。

用SPM-9700原子力显微镜扫描氧化石墨烯样品、ZEN&OTA适配体-氧化石墨烯样品以及ZEN&OTA适配体-氧化石墨烯-玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A样品，确定样品的高度变化。如图2所示，氧化石墨烯本身的厚度在1.28nm左右，当同时加入ZEN&OTA适配体后，适配体被吸附在氧化石墨烯表面上，厚度大约为2.19nm；当玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A存在时，厚度减小到1.65nm，证明ZEN&OTA适配体从氧化石墨烯表面释放出来，形成了ZEN适配体-玉米赤霉烯酮复合物、OTA适配体-赭曲霉毒素A复合物。

按上述步骤对含有不同浓度的玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A标准溶液的样品进行检测，记录各样品所产生的荧光强度值；对标准溶液中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A浓度作图获得标准曲线，未知样品中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A所产生的荧光强度与标准曲线对照量化其浓度。

对不同已知浓度的玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A样品作图获得标准曲线(如图3所示)，荧光强度跟玉米赤霉烯酮的浓度存在y＝8.9712ln(x)+84.532的线性关系，R²＝0.9986。其中x为玉米赤霉烯酮，y为荧光强度。荧光强度跟赭曲霉毒素A的浓度存在y＝13.352ln(x)+88.132的线性关系，R²＝0.9886。其中x为赭曲霉毒素A的浓度，y为荧光强度。未知样品中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A所产生的荧光强度与标准曲线对照量化其浓度。

氧化石墨烯浓度的对检测平台背景的影响

向1μM ZEN&OTA适配体加入不同浓度的猝灭剂氧化石墨烯。氧化石墨烯的浓度设定为0，5，10，15，20，25μg/mL，分别对应着1-6号样品。结果如图4所示，随着氧化石墨烯浓度的增加，ZEN适配体和OTA适配体的荧光强度逐渐减弱。当氧化石墨烯的浓度达到25μg/mL，荧光强度趋于稳定。因此，氧化石墨烯的最佳浓度为20μg/mL。

孵育温度对生物传感器结合玉米赤霉烯酮的影响

在ZEN&OTA适配体-氧化石墨烯复合物中加入玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A，在室温条件下充分混合后，并没有得到显著的荧光恢复。考虑到升高温度可以减弱ZEN&OTA适配体与氧化石墨烯之间的相互作用，从而增加ZEN&OTA适配体从氧化石墨烯表面游离出来的机会。因此为了提高荧光恢复，本发明采取了升高温度的措施。选取的温度区间在30-50℃。如图所示，不加玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的样品的荧光强度恢复值随温度的升高逐渐升高，证明升温确实可以促进ZEN&OTA适配体从氧化石墨烯表面释放。加入玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的样品的荧光强度恢复值都明显的高于不加玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的，并且在温度升高到45℃之前都是有规律地上升，而在50℃时，略有下降。说明了升高温度对于加入靶标后的荧光恢复是有很大作用的，但是温度过高反而会破坏ZEN适配体-玉米赤霉烯酮复合物、OTA适配体-赭曲霉毒素A复合物的结合力，因此，45℃是荧光恢复的最佳孵育温度。

生物传感器的灵敏性和特异性检测

灵敏度如图6所示，该生物传感器的对玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的检测范围在1-500ng/mL之间，检测下限均达到1ng/mL。

选择了展青霉毒素(patulin)、伏马毒素(FB)、黄曲霉毒素B1(AFB1)和黄曲霉毒素M1(AFM1)四种干扰的真菌毒素与玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A(OTA)一起来验证该生物传感器的特异性，各毒素的浓度均为100ng/mL。特异性结果如图7所示：在512nm激发波长下由荧光恢复值可以看出玉米赤霉烯酮的数值是其他真菌毒素的至少三倍，在499nm激发波长下由荧光恢复值可以看出赭曲霉毒素A的数值是其他真菌毒素的六倍左右，因此，该适配体传感器对玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A具有很高的特异性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。