一种靶向线粒体的荧光寿命温度传感器及其制备方法及应用与流程

本发明涉及纳米温度计领域。更具体地，涉及一种靶向线粒体的荧光寿命温度传感器及其制备方法及应用。

背景技术：

线粒体的温度在细胞的新陈代谢中具有重要的角色。准确测量线粒体的温度能够帮助人们了解细胞的生理过程，揭示某些疾病的发病机理。用荧光的技术测量线粒体温度具有很大的优势。其中，相比于荧光强度的方法，利用荧光寿命可以有效避免荧光物质的浓度干扰和光源信号的波动。现有的利用荧光寿命测量线粒体温度的探针中，探针寿命与细胞自发荧光的寿命在同一量级，信号干扰大。同时，探针多为有机物，光漂白效应明显，不适合长时间观察。

针对此问题，需要提供一种具有长荧光寿命、光稳定性强的荧光寿命温度传感器。

技术实现要素：

本发明的第一个目于在于提供一种靶向线粒体的荧光寿命温度传感器，该传感器可靶向定位于线粒体，且其荧光寿命长、光稳定性强，可利用其荧光寿命准确地测量线粒体的温度。

本发明的第二个目的在于提供一种靶向线粒体的荧光寿命温度传感器的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供一种靶向线粒体的荧光寿命温度传感器的应用。

为达到上述第一个目的，本发明采用下述技术方案：

一种靶向线粒体的荧光寿命温度传感器，所述传感器由表面受配体保护的金纳米簇与三苯基膦化合物或其衍生物通过共价偶联而成；

其中，所述配体为谷胱甘肽。这种方法制备的金纳米簇其荧光寿命比采用其他配体合成的金簇长1μs左右。

可选地，所述三苯基膦化合物或其衍生物为4-羧丁基三苯基溴化膦。此时，得到的温度传感器具有很好的定位效果。

可选地，所述受配体保护的金纳米簇的平均直径为2nm以下。

为达到上述第二个目的，本发明采用下述技术方案：

一种靶向线粒体的荧光寿命温度传感器的制备方法，包括如下步骤：

将三苯基膦化合物或其衍生物的mes溶液、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、n-羟基磺酸基琥珀酰亚胺钠盐混合，反应活化后，加入表面受配体保护的金纳米簇的水溶液，避光反应，再经透析，得所述荧光寿命温度传感器。

可选地，所述表面受配体保护的金纳米簇的制备包括如下步骤：

将氯金酸的水溶液与谷胱甘肽于室温混合均匀后，再于70-80℃温度下搅拌至溶液澄清呈淡黄色，透析后得所述表面受配体保护的金纳米簇。通过该方法制备得到的金纳米簇荧光寿命长，在生理温区条件下均可达到微秒级。可选地，所述搅拌的时间为18h以上。

可选地，所述三苯基膦化合物或其衍生物的mes溶液中，三苯基膦化合物或其衍生物的浓度为6-10mg/ml。

为达到上述第三个目的，本发明提供如上第一个目的提供的荧光寿命温度传感器在线粒体温度测量中的应用。

可选地，所述应用包括：

采用波长为390nm的激光，在0-370μs的范围内测试所述荧光寿命温度传感器的荧光寿命，以温度为横坐标、所述传感器的荧光寿命值为纵坐标，建立体外工作曲线；随温度的增加，非辐射跃迁增加，导致所述荧光寿命传感器的荧光寿命降低；

将所述荧光寿命温度传感器靶向定位于待测温度的线粒体，并采用荧光寿命成像显微镜，测试定位后的传感器的寿命，得荧光寿命图像，根据所述荧光寿命图像中的信号值确定线粒体的温度分布，再根据所述体外工作曲线，得到所述荧光寿命值对应的具体的温度。具体地，在荧光寿命图像中，寿命短的信号值代表该点的温度较高，寿命长的信号值代表该点的温度较低。进而通过荧光寿命成像图中的信号值得到线粒体的温度分布，再分析具体每个像素点的荧光寿命值，根据所述体外工作曲线，可以得到该点的具体温度。

进一步地，将荧光寿命温度传感器靶向定位于待测温度的线粒体的方法为：将所述荧光寿命温度传感器孵育进入细胞后，该传感器将靶向定位于线粒体。

可选地，所述荧光寿命成像显微镜的测试使用波长为402nm的飞秒激光，激光重复频率为80mhz，使用的滤波片为582/75nm。

本发明的有益效果如下：

本发明中提供的靶向线粒体的荧光寿命温度传感器具有超长的荧光寿命能够有效地降低生物体自发荧光的干扰，提高信噪比；具有很好的光稳定性，在长时间观察下，仍然具有较强的荧光信号，适合长时间观察样品；其该传感器对温度具有较高的温度灵敏度，利用其荧光寿命能准确的测量线粒体的温度。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出发明实施方式中靶向线粒体的荧光寿命温度传感器的设计原理图。

图2示出实施例1制备得到的表面共价结合有谷胱甘肽的金纳米线的透射电镜图。

图3示出实施例1制备得到的m-auncs的透射电镜图。

图4示出实施例1中修饰tpp前后auncs的zeta电位变化图。

图5示出实施例1中制备得到的m-auncs的荧光强度随温度变化的变化趋势图。

图6示出实施例1中制备得到的m-auncs的荧光寿命随温度变化的变化趋势图。

图7示出实施例1中制备得到的m-auncs的荧光寿命随温度变化图的工作曲线。

图8示出实施例1中制备得到的m-auncs进入细胞后的荧光强度，光谱和寿命图。

图9示出实施例3制备得到的m-auncs与商用线粒体染料的共定位图。

图10示出实施例3制备得到的m-auncs在线粒体中寿命分布图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

本发明实施方式中，靶向线粒体的荧光寿命温度传感器的设计原理如图1所示。

实施例1

一种靶向线粒体的荧光寿命温度传感器的制备方法，包括如下步骤：

1)将0.1m的氯金酸溶液溶于5ml水中，再加入42mg的谷胱甘肽，在室温下搅拌30min后，升温至70℃，搅拌过夜，得到auncs，其透射电镜图如图2所示；

2)将合成好的auncs通过透析(5000d，24h)进行提纯。提纯后的auncs置于4℃冰箱备用；

3)取30mg的4-羧丁基三苯基溴化膦(tpp)，溶于5ml的mes溶液中，加入25mg的edc与10mg的nhs；反应活化4h后，加入4ml的auncs溶液，在避光条件下，反应20小时，产物用5000d的透析袋进行透析24h，每隔6h进行换水处理，得到的m-auncs(也即所述传感器)，并置于4℃冰箱储存，制备得到的m-auncs的透色电镜图如图3所示；通过zeta电位表征，修饰前后，金纳米簇的zeta电位从负变为正，如图4所示；

5)将得到的m-auncs用400nm的激光激发，得到的荧光最大发射波长是600nm。测试温度从10℃升高至60℃时，荧光强度的变化，可知，荧光强度随温度的升高而降低，如图5所示；

6)利用荧光寿命光谱仪进行测试，得到的m-auncs荧光寿命随温度从10℃升高至50℃时逐渐减少，如图6所示。并建立工作曲线，如图7所示；

7)得到的m-auncs与l929细胞进行共孵育4小时后，利用激光共聚焦成像图，m-auncs与商业线粒体染料共染后，发现m-auncs定位于线粒体内，利用荧光寿命成像，得到荧光寿命图。将荧光寿命图与荧光强度图进行比对，发现荧光寿命信号来源于荧光探针的信号，对比数据如图8所示。图8中，a图是m-auncs荧光强度成像，b图是m-auncs的荧光寿命成像，c图是的明场成像，d图是m-auncs的荧光光谱成像。其中a图和d图是利用m-auncs的荧光的强度和光谱信号进行成像，b图是利用荧光寿命进行成像，c图是使用明场照明进行成像，四幅图中的细胞形态相同，信号重叠度较高，说明所测得荧光寿命信号来源于探针的荧光。

8)利用荧光寿命成像设备，对细胞进行寿命成像，得到寿命图像。根据寿命与温度的关系，可以得知此时细胞的平均温度是37℃。

实施例2

一种靶向线粒体的荧光寿命温度传感器的制备方法。

1)将0.1m的氯金酸溶液溶于5ml水中，再加入42mg的谷胱甘肽，在室温下搅拌30min后，升温至70℃，搅拌过夜，得到auncs；

2)将合成好的auncs通过透析(5000d，24h)进行提纯。提纯后的auncs置于4℃冰箱备用；

3)取40mg的tpp，溶于5ml的mes溶液中，加入20mg的edc与5mg的nhs。反应活化3h后，加入3ml的auncs溶液，在避光条件下，反应18小时，产物用5000d的透析袋进行透析24h，每隔6h进行换水处理，得到的m-auncs，置于4℃冰箱储存；通过zeta电位表征，修饰前后，金纳米簇的zeta电位从负变为正；

5)将得到的m-auncs用400nm的激光激发，得到的荧光最大发射波长是600m，荧光强度随温度的升高而降低；

6)利用荧光寿命光谱仪进行测试，得到的m-auncs荧光寿命随温度的升高而减少。分别测试m-auncs在10℃，20℃，30℃，40℃和50℃下的荧光寿命，将得到的荧光寿命绘制工作曲线，建立如实施例1所述的工作曲线；

7)得到的m-auncs与l929细胞进行共孵育4小时后，利用激光共聚焦成像图，m-auncs与商业线粒体染料共染后，发现m-auncs定位于线粒体内；利用荧光寿命成像，得到荧光寿命图。结果与实施例1相近。

实施例3

一种靶向线粒体的荧光寿命温度传感器的制备方法：

1)将0.1m的氯金酸溶液溶于5ml水中，再加入42mg的谷胱甘肽，在室温下搅拌30min后，升温至70℃，搅拌过夜。得到auncs；

2)将合成好的auncs通过透析(5000d，24h)进行提纯，提纯后的auncs置于4℃冰箱备用；

3)取50mg的tpp，溶于5ml的mes溶液中，加入30mg的edc与15mg的nhs，反应活化6h后，加入5ml的auncs溶液，在避光条件下，反应24小时产物用5000d的透析袋进行透析24h，每隔6h进行换水处理，得到的m-auncs，置于4℃冰箱储存；通过zeta电位表征，修饰前后，金纳米簇的zeta电位从负变为正；

5)将得到的m-auncs用400nm的激光激发，得到的荧光最大发射波长是600m，荧光强度随温度的升高而降低；

6)利用荧光寿命光谱仪进行测试，得到的m-auncs荧光寿命随温度的升高而减少。分别测试m-auncs在10℃，20℃，30℃，40℃和50℃下的荧光寿命，将得到的荧光寿命绘制工作曲线，建立如实施例1所述的工作曲线；

7)得到的m-auncs与l929细胞进行共孵育4小时后，利用激光共聚焦成像图，得到荧光强度，光谱和寿命图；m-auncs与商业线粒体染料共染后，发现m-auncs定位于线粒体内，共定位系数高达0.92，如图9所示。高的共定位系数，说明合成的金纳米簇具有靶向线粒体的功能，在进入细胞后，能够通过静电吸附作用靶向线粒体。随后，利用荧光寿命成像，得到样品的荧光寿命图，通过寿命与温度的关系，可以得知样品的平均温度。图10示出了制备得到的m-auncs在线粒体中寿命分布图。根据温度相对灵敏的计算公式可知，此时的温度相对灵敏度为3％。

通过上述实施例1-3说明，合成的m-auncs具有靶向线粒体的功能，同时说明其寿命在微秒量级，与细胞自发荧光的寿命(纳秒量级)明显不同。可以有效地避免细胞自发荧光的干扰。且合成的m-auncs具有较低的细胞毒性，抗漂白的能力，适合细胞线粒体温度检测。

对比例1

重复实施例1，区别在于，将步骤1)中的“auncs”换成如下文献1中所述的金纳米簇。可以得知，通过溶液法合成的金纳米簇，当表面覆盖有不同的表面配体时，其荧光寿命只有纳秒级别，与细胞内的自发荧光的寿命在同一个量级，无法有效避免自发荧光物质带来的干扰。

文献1.mishra,d.；aldeek,f.；lochner,e.；palui,g.；zeng,b.；mackowski,s.；mattoussi,h.langmuir2016,32,(25),6445-58.

也即，本发明的技术方案中，采用本方法的合成条件，合成出具有微秒级的荧光寿命的纳米簇，并且能采用其荧光寿命准确的测量出线粒体的温度。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。