中药质量等级检测方法与流程

本发明设计一种中药质量等级检测方法，具体涉及一种基于“成分-功效”互作关系的中药质量等级方法，属于中药检测技术领域。

背景技术：

中药资源是国家战略资源，是中医药事业和中药产业赖以生存发展的中药物质基础。因此建立“完善的中药标准化评价体系”是摆脱中药质量来源参差不齐，中药质量控制方法单一，中药疗效水平不稳定等困窘现状的重要手段。中药质量标准化是中药产业建设的重要基础，是中医药行业发展的重要“先行者”。因此，建立一套符合中医药特点的中药材/饮片科研评价方法，有利于健全完善中药质量控制体系，加强中药质量管理，推进中药标准化体系建设。

中药等级评价是一项发展潜力巨大的中药质量评价创新技术。尽管目前有根据感官类型(外观性状)、化学成分、生物活性等依据建立的中药规格等级评价系统，也随之发展了仿生识别、分子鉴定、高分辨质谱等分辨率高、速度快的特征指标量化新技术。但中药生产多受复杂多变的自然因素和人为因素影响，感官指标、化学指标、活性指标与药材等级大多不呈现线性相关，因而单一、平行的评价方法很难从整体上评价中药等级的优劣，不能够实现产业化中药质量等级判别的方法。

影响药材/饮片的因素主要分为三类：第1类是生物活性：如体外抗氧化活性、体内抗凝血活性；第2类是主要成分的质控含量；第3类是指纹图谱中各化合物的组成比例。由于预测模型的建立和参数的确定是由数据驱动，因此需要利用药材/饮片分类标准来生成数据作为建模基础。因此，将优(ⅰ)、良(ⅱ)、中(ⅲ)、差(ⅳ)分别赋予响应值4、3、2、1。

为了筛选稳定的定量指标，对中药材/饮片进行等级划分。首先采用主成分分析(principalcomponentanalysis，pca)法对样本数据进行分层聚类法(hierarchicalclustermethod，hca)和因子分析。将贡献率高的生物活性指标，化学成分指标作为观测因子。通过采用pca和hca结合的数据处理技术，来反映药材/饮片成分和活性差异。根据不同批次药材/饮片按照活性、成分的分类情况，可以初步观察到药材/饮片的分类情况。

主成分分析是一种将多维数据进行降维处理,简化为少数几个不相关的综合指标(主成分)的多元统计分析方法。其建模过程具体如下:

(1)数据预处理。假设有m个样本(i＝1,2,…,m)，n个指标(j＝1,2,…,n)，对原始数据x＝(xi*j)m×n进行均值化处理,可保留数据内的变异信息。

式中：为原始数据，为j指标的平均值，xij为数据均值化结果。

(2)计算均值化数据的协方差矩阵s＝(sij)n×n。

(3)计算协方差矩阵的特征值和特征向量。s的n个特征值记为:λ1≥λ2≥…≥λn，标准化特征向量为ajj＝(aj1,aj2,…,ajn)，则第i个样本的第j个主成分为

(4)确定主成分的个数。当累计方差贡献率达到85％时，可取前k个主成分作为综合评价指标。当可取第一主成分作为综合评价指标。

logistic回归，也叫对数几率回归，属于概率型非线性回归模型，是一种研究分类观察结果之间关系的一种多变量分析方法。其基本原理是利用logit变换将变量和因变量间的曲线关系建立线性回归模型，以预测值结果去预测真实值的对数几率。从模型的通用性和实用性考虑，具有一定数学表达式的模型更易于被理解和应用。而logistic回归模型中的二分类模型更简单易懂，对训练样本只需表示“是”或“否”，结果也能得到精确的计算分值，在理想状态下，只需将测试集数据输入以训练集建立的数学公式中即可计算得到预测结果。从等级预测角度来看，二分类logistic回归模型更适用于药材/饮片等级分类评价。

logistic回归分析的目的是建立经验公式，以便由自变量预测因变量概率分布。令y＝1,2,3,4表示中药的4个等级。令q1＝p(y≤1),q2＝p(y≤2),…,q3＝p(y≤3)，常用的logistic回归模型是：

式中:βi0为截距，i＝1，2，…，4；β1,…,βn为斜率系数；x1,…,xn为自变量。由已有观测值能估计出βi0,β1,…,βn,从而丹参投料饮片各等级的概率p表达式：

pi＝exp(βio+β1x1+…βnxn)/[1+exp(βi0+β1x1+…βn，n)](4)

这时对于给定的自变量x1，…，xn的值，由回归方程可以预测q1,q2,q3,再由p(y＝1)＝q1，p(y＝2)＝q2-q1，…，p(y＝3)＝q3-q2，p(y＝4)＝1q3可以预测各丹参投料等级概率。根据各类别的概率,由则可以确定响应变量类别。

为此，本发明方案是基于“成分-功效”互作关系的中药质量等级评价方法，其主要是结合主成分分析和二分类logistic回归模型来描述药材/饮片等级与影响因素(化学成分、生物活性)之间的映射关系，以此来建立药材/饮片质量等级的数学表达式。最终以此表达式，直接实现中药质量等级的产业化检测。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于检测判别中药质量等级的方法。

具体，本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种中药质量等级检测方法，所述的中药为药材或饮片；所述的检测方法，是通过建立中药生物活性与成分的关联模型而确立。

进一步地，所述的中药质量等级检测方法，包括如下步骤：(1)中药检测样品制备及成分含量测定方法的建立；(2)中药生物活性测定；(3)中药主成分测定；(4)通过logistic回归模型确定中药质量等级检测公式。

进一步地，所述的中药质量等级检测方法，所述检测方法步骤(1)中，中药检测样品制备及成分含量测定方法如下：

样品制备：取药材或饮片粉末约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得样品溶液。

成分含量测定方法：采用超高液相色谱法，在药材或饮片主要成分特征波长下，以十八烷基硅烷键硅胶为填充剂；以0.1％甲酸-水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，按如下条件进行梯度洗脱：时间0～2min，流动相b的体积比为2％；时间2～10min，流动相b的体积比由2％-100％；时间10～13min，流动相b的体积比由100％-2％；时间13～20min，流动相b的体积比为2％；体积流量0.2ml/min；柱温25℃；进样量2μl。

进一步地，所述的中药质量等级检测方法，所述检测方法步骤(2)中，中药体外生物活性的检测方法是abts⁺自由基清除率％、dpph自由基清除率％、羟自由基清除能力。

再进一步地，所述的中药质量等级检测方法，所述的检测方法步骤(3)中，中药主成分检测方法为主成分分析pca和分层聚类法hca。其中所述分析方法的全程是：pca：principalcomponentanalysis，hca：hierarchicalclustermethod。

进一步地，所述的中药质量等级检测方法，所述检测方法步骤(4)中，所述的中药质量等级分为p优、p良、p中、p差4个等级，其中p值范围是：0≤p≤1，具体相应的等级检测公式如下：

更进一步地，所述的中药质量等级检测方法，所述检测方法的中药为桂枝、丹参、牛膝中任意一种。

更进一步地，所述的中药质量等级检测方法，所述中药桂枝的质量等级检测公式如下：

进一步地，所述的中药质量等级检测方法，所述中药丹参的质量等级检测公式如下：

更进一步地，所述的中药质量等级检测方法，所述中药牛膝的质量等级检测公式如下：

本发明的技术方案中，对于中药体外活性的测定及主成分分析方法，是经过探索分析而完成的，具体实验探索的方法如下：

(1)体外测定方法：

1)abts⁺自由基清除率检测方法

参照abts快速法，配制abts工作液和酶工作液。进行各批次总抗氧化能力的测定。按下式进行abts⁺自由基清除能力计算：

a0＝未加样品的abts⁺自由基吸光度；ai＝加入样品反应后的abts⁺自由基吸光度。

2)羟自由基抑制能力检测方法

参照羟自由基抑制能力检测方法，分别配制应用液及显色剂，并将应用液在37℃水浴中预温3min，样品溶液用蒸馏水稀释成各不同浓度的待测液，分别取各不同浓度的待测液，进行各批次抑制羟自由基能力的测定。按下式进行抑制羟自由基能力计算：

3)dpph自由基清除率检测方法

参照dpph自由基清除率测定法，配制dpph工作液和酶工作液。进行各批次dpph自由基清除率的测定。按下式进行dpph自由基清除能力计算：

a0＝未加样品的dpph自由基吸光度；ai＝加入样品反应后的dpph自由基吸光度。

(2)主成分分析法：为了更直观地评价模型对样品的分类能力，对各训练集样品数据进行降维处理，采用pca方法观察样品差异情况。将色谱测定指纹图谱数据(n≥6)进行数据对齐、积分、标准化处理后，导入多元统计软件，以影响因素作为观测值(x)进行pca分析。从得到的数据矩阵中提取携带差异变量最多的主成分。由相关系数矩阵r得到特征值和累积贡献率。提取前两个主成分得到模型拟合度应大于80％。选取前2个主成分进行模型预测能够反映不同等级投料饮片的基本特征。以前2个主成分建立投影，得到散点图。结合hca聚类分析方法，对各批数据进行聚类分析，观察样本分类情况，如图1所示。由成分载荷图初步判断对样本差异贡献度较高的化学指标，并对其成分进行指认(，如图2所示。以液相色谱法测定样本，以外标法计算指认化学成分含量。

(3)二分类logistic回归模型建立：从建立的主成分-logistic回归模型为基础，应用效果完全依赖于质量影响因素的等级分类标准的准确性。

采用logistic模型建立各训练集样本对应的主成分与等级之间的函数关系。以spss软件实现logistic模型参数的求解，得到模型表达式如下：

将测试集各指标实测值逐一代入上式中即可计算影响因素属于各等级的概率，从而确定药材/饮片等级，其中计算结果接近1的则判定为该等级。

本发明的有益效果

1.本发明建立了中药等级检测方法，其中采用二分类logistic回归对训练样本只要求表述成“是”“否”两类等级，结果得到精确的分值，能够保证评级结果的客观性；同时，二分类logistic回归能够综合考虑中药生产过程中多种影响因素的作用，评价结果具有全面性和实用性，还可以利用统计学方法来检验训练集数据中每个测定指标对分类准确性的重要程度以排除次要指标。

2.本发明技术，是基于“成分-功效”互作关系的研究方法，将整合组学的概念引入到中药质量评价中，符合传统中药质量控制和评价的“整体观”理念，体现了“成分反映活性，活性指向功效”的中药质量控制思路。

3.本发明所确立的中药等级评价方法，以及所建立的药材/饮片预测数学模型方法为中药商品规格等级评价提供了较好的科学数据支撑，满足了中药材流通“按质论价”的交易需求，也保证了中药临床用药的安全性和有效性。

附图说明

图1是本发明方案中关于中药主成分分类散点图；

图2是本发明方案中关于中药主成分分析载荷图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1中药桂枝质量等级检测方法

(1)样品制备：取桂枝粉末(过四号筛)约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率140w，频率42khz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得样品溶液。

(2)采用超高液相色谱法采集桂枝指纹图谱积分数据：采用超高液相色谱法，在桂枝主要成分特征波长254nm下，以十八烷基硅烷键硅胶为填充剂；以0.1％甲酸-水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，按如下条件进行梯度洗脱：时间0～2min，流动相b的体积比为2％；时间2～10min，流动相b的体积比由2％-100％；时间10～13min，流动相b的体积比由100％-2％；时间13～20min，流动相b的体积比为2％；体积流量0.2ml/min；柱温25℃；进样量2μl，采集色谱积分数据。

(3)测定体外抗氧化活性指标：抗氧化abts+、抗氧化dpph和抗氧化oh.，结果如表1所示：

表1桂枝体外抗氧化活性指标结果

(4)主成分分析法：

将提取的数据(n＝6)进行数据对齐、积分、标准化处理后，导入simca-p14.1软件，以积分数据和生物活性数据作为观测值(x)进行pca分析。从得到的数据矩阵中提取携带差异变量最多的主成分。由相关系数矩阵r得到特征值和累积贡献率。模型自动拟合2个主成分，模型拟合度为95.9％，第一主成分pc1的贡献率为95.9％，包合差异信息最多，说明模型拟合能力较好。以前2个主成分建立投影，采用hca聚类分析方法，对各批数据进行聚类分析。由成分载荷结果初步判断对样本差异贡献度较高的化学指标为桂皮醛、桂皮醇、肉桂酸、香豆素；体外活性指标为dpph自由基清除率(抗氧化dpph)和羟自由基抑制能力(抗氧化oh)。取桂枝中主要成分桂皮醛、桂皮醇、肉桂酸、香豆素对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成质量浓度为0.5mg/ml的溶液，0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得对照品溶液。以液相色谱外标法计算指认化学成分含量。设定变量为：c桂皮醛、c桂皮醇、c肉桂酸、c香豆素、抗氧化dpph和抗氧化oh。

(5)采用二分类logistic模型建立各训练集样本对应的化学成分含量、抗氧化活性与经验等级之间的函数关系。得到模型表达式如下:

将各指标实测值代入上式中即可计算影响因素属于各等级的概率，从而确定桂枝等级，具体测定20批桂枝等级计算结果如表2所示，其判定概率大于95％。

表2桂枝等级分类结果

实施例2中药丹参质量等级检测方法

(1)样品制备：取丹参粉末(过四号筛)约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率140w，频率42khz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得样品溶液。

(2)采用超高液相色谱法采集丹参指纹图谱积分数据：采用优化的超高液相色谱法，在丹参主要成分特征波长270nm下，以十八烷基硅烷键硅胶为填充剂；以0.1％甲酸-水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，按如下条件进行梯度洗脱：时间0～2min，流动相b的体积比为2％；时间2～10min，流动相b的体积比由2％-100％；时间10～13min，流动相b的体积比由100％-2％；时间13～20min，流动相b的体积比为2％；体积流量0.2ml/min；柱温25℃；进样量2μl，采集色谱积分数据。

(3)测定体外抗氧化活性指标：抗氧化abts+、抗氧化dpph和抗氧化oh.，结果如表3所示。

表3丹参体外抗氧化活性指标结果

(4)主成分分析法：将色谱积分数据和抗氧化数据导入多元统计软件，进行主成分分析。将提取的数据(n＝6)进行数据对齐、积分、标准化处理后，导入simca-p14.1软件，以以积分数据和生物活性数据作为观测值(x)进行pca分析。从得到的数据矩阵中提取携带差异变量最多的主成分。由相关系数矩阵r得到特征值和累积贡献率。模型自动拟合2个主成分，模型拟合度为83.90％，第一主成分pc1的贡献率为66.1％，包合差异信息最多，说明模型拟合能力较好。以前2个主成分建立投影，采用hca聚类分析方法，对各批数据进行聚类分析。由成分载荷结果初步判断对样本差异贡献度较高的化学指标为丹参酮iia、丹酚酸b；体外活性指标为dpph自由基清除率(抗氧化dpph)和羟自由基抑制能力(抗氧化oh)。精密称取丹参中主要成分丹酚酸b和丹参酮iia的对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇制成质量浓度分别为0.21mg/ml和0.22mg/ml的溶液，0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得对照品溶液。以液相色谱外标法计算指认化学成分含量。设定变量为：c丹酚酸b、c丹参酮iia、抗氧化dpph和抗氧化oh。

(5)采用二分类logistic模型建立各训练集样本对应的化学成分含量、抗氧化活性与经验等级之间的函数关系，得到模型表达式如下：

将各指标实测值代入上式中即可计算影响因素属于各等级的概率，从而确定丹参等级检测结果，具体见表4所示，其判定概率大于87％。

表4丹参等级分类结果

实施例3中药牛膝质量等级检测方法

(1)样品制备：取牛膝粉末(过四号筛)约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率140w，频率42khz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得样品溶液。

(2)采用超高液相色谱法采集牛膝指纹图谱积分数据：采用优化的超高液相色谱法，在牛膝主要成分特征波长250nm下，以十八烷基硅烷键硅胶为填充剂；以0.1％甲酸-水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，按如下条件进行梯度洗脱：时间0～2min，流动相b的体积比为2％；时间2～10min，流动相b的体积比由2％-100％；时间10～13min，流动相b的体积比由100％-2％；时间13～20min，流动相b的体积比为2％；体积流量0.2ml/min；柱温25℃；进样量2μl，采集色谱积分数据。

(3)测定体外抗氧化活性指标：抗氧化abts+、抗氧化dpph和抗氧化oh.，结果如表5所示。

表5牛膝体外抗氧化活性指标结果

(4)主成分分析法：将色谱积分数据和抗氧化数据导入多元统计软件，进行主成分分析。将提取的数据(n＝6)进行数据对齐、积分、标准化处理后，导入simca-p14.1软件，以以积分数据和生物活性数据作为观测值(x)进行pca分析。从得到的数据矩阵中提取携带差异变量最多的主成分。由相关系数矩阵r得到特征值和累积贡献率。模型自动拟合2个主成分，模型拟合度为79.6％，第一主成分pc1的贡献率为63.9％，包合差异信息最多，说明模型拟合能力较好。以前2个主成分建立投影，采用hca聚类分析方法，对各批数据进行聚类分析。由成分载荷结果初步判断对样本差异贡献度较高的化学指标为β-蜕皮甾酮；体外活性指标为dpph自由基清除率(抗氧化dpph)和羟自由基抑制能力(抗氧化oh)。精密称取牛膝中主要成分β-蜕皮甾酮适量，置棕色量瓶中，加甲醇制成质量浓度为1mg/ml的溶液，0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得对照品溶液。以液相色谱外标法计算指认化学成分含量。设定变量为：c蜕皮甾酮、抗氧化dpph和抗氧化oh。

(5)采用二分类logistic模型建立各训练集样本对应的化学成分含量、抗氧化活性与经验等级之间的函数关系，得到模型表达式如下：

将各指标实测值代入上式中即可计算影响因素属于各等级的概率，从而确定牛膝等级检测结果，具体见表6所示，其判定概率大于87％。

表6牛膝等级分类结果