一种样品中铵态氮、硝酸态氮、亚硝酸态氮以及总溶解态氮的测定方法与流程

本发明涉及氮含量检测技术领域，尤其涉及一种样品中铵态氮、硝酸态氮、亚硝酸态氮以及总溶解态氮的测定方法。

背景技术：

现有技术中测定土壤中的氮含量的方法主要依赖于普通的紫外-可见分光光度计，每次只能测定有限的几个样品。而且，受限于测定过程中反应的速度以及均一性，无法在96孔板(酶标仪)上实现。另外，单纯依赖普通的紫外-可见分光光度计法进行测量，检出限和准确度均有待提高。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种样品中铵态氮、硝酸态氮、亚硝酸态氮以及总溶解态氮的测定方法，本发明的测定方法采用了新的氧化剂和显色剂，实现了利用96孔板(酶标仪)来测定样品中各种形态氮，且该方法具有较好的检出限和准确度，实现了氮的高通量测定。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种样品中铵态氮、硝酸态氮、亚硝酸态氮以及总溶解态氮的测定方法，包括以下步骤：

标准曲线的建立：所述标准曲线包括铵态氮浓度-吸光度标准曲线、硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线、亚硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线和总溶解态氮浓度-吸光度标准曲线；

所述铵态氮浓度-吸光度标准曲线的建立包括以下步骤：

配制铵态氮标准溶液，将所述铵态氮标准溶液、氧化剂和显色剂混合、显色，测定660nm处的吸光度，得到铵态氮浓度-吸光度标准曲线；所述氧化剂为次氯酸钠和氯代异氰尿酸钠的水溶液，所述显色剂为水杨酸的氢氧化钠水溶液；

所述硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线的建立包括以下步骤：

配制硝酸态氮标准溶液，将所述硝酸态氮标准溶液、硝酸盐还原酶、第一griess试剂和第二griess试剂混合、显色，测定540nm处的吸光度，得到硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线；所述第一griess试剂为n-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐水溶液，所述第二griess试剂为磺胺和氯化钒的盐酸水溶液；

所述亚硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线的建立包括以下步骤：

配制亚硝酸态氮标准溶液，将所述亚硝酸态氮标准溶液、第一griess试剂和第二griess试剂混合、显色，测定540nm处的吸光度，得到亚硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线；

所述总溶解态氮浓度-吸光度标准曲线的建立包括以下步骤：

配制总溶解态氮标准溶液，将所述总溶解态氮标准溶液、过硫酸盐氧化剂和水混合，得到消解液；将所述消解液、硝酸盐还原酶、第一griess试剂和第二griess试剂混合、显色，测定540nm处的吸光度，得到总溶解态氮浓度-吸光度标准曲线；

待测样品中铵态氮、硝酸态氮、亚硝酸态氮以及总溶解态氮的测定：

将所述待测样品配制成待测样品溶液，将所述待测样品溶液按照各标准曲线建立时的显色反应进行显色，得到相应氮形态的吸光度，根据相应的标准曲线，获得标准曲线测铵态氮含量、标准曲线测硝酸态氮含量、标准曲线测亚硝酸态氮含量和标准曲线测总溶解态氮含量；

所述标准曲线测铵态氮含量、所述标准曲线测亚硝酸态氮含量和所述标准曲线测总溶解态氮含量分别为待测样品中铵态氮含量、亚硝酸态氮含量和总溶解态氮含量；

所述标准曲线测硝酸态氮含量与所述标准曲线测亚硝酸态氮含量的差值为待测样品中硝酸态氮含量。

优选地，所述铵态氮标准溶液的溶质为氯化铵；所述硝酸氮标准溶液的溶质为硝酸钾；所述亚硝酸氮标准溶液的溶质为亚硝酸钠；所述总溶解态氮标准溶液的溶质为甘氨酸。

优选地，所述甘氨酸与过硫酸盐氧化剂的质量比为0.02～1.00：2500～3500。

优选地，所述过硫酸盐氧化剂为过硫酸钾、高锰酸钾、氢氧化钠和硼酸的混合物。

优选地，所述过硫酸盐氧化剂中过硫酸钾、高锰酸钾、氢氧化钠和硼酸的质量比为25：20～25：5～6：10～20。

优选地，所述氧化剂中次氯酸钠与氯代异氰尿酸钠的质量比为6.5～7.2：0.025～0.035。

优选地，所述第二griess试剂中磺胺和氯化钒的质量比为4.5～5.5：0.10～0.20。

优选地，所述样品包括土壤或水体。

本发明提供了一种样品中铵态氮、硝酸态氮、亚硝酸态氮以及总溶解态氮的测定方法。本发明在铵态氮测定时，采用了新的氧化剂(次氯酸钠和氯代异氰尿酸钠)和显色剂(水杨酸)体系，将铵态氮在氧化剂的作用下氧化为单氯胺，形成的单氯胺与显色剂形成靛酚，通过测定660nm处的紫外吸光度进行测量，该显色反应速度稳定及均一，能够在96孔板上进行。在进行硝酸态氮、亚硝酸态氮和总溶解态氮测量时采用新的第一griess试剂(n-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐)和第二griess试剂体系(磺胺和氯化钒)，进行测量，检出限低、灵敏度高，且反应过程稳定均一，能够在96孔板上进行。实施例的数据表明：本发明提供的测定方法精密度、准确度高，且对样品中各种氮形态有较低的检出限。

附图说明

图1为铵态氮浓度-吸光度标准曲线图；

图2为硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线图；

图3为亚硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线图；

图4为总溶解态氮浓度-吸光度标准曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种样品中铵态氮、硝酸态氮、亚硝酸态氮以及总溶解态氮的测定方法，首先建立标准曲线；所述标准曲线包括铵态氮浓度-吸光度标准曲线、硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线、亚硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线和总溶解态氮浓度-吸光度标准曲线。

在本发明中，所述样品优选为土壤或水体。在本发明中，在测定所述土壤中铵态氮、硝酸态氮、亚硝酸态氮和总溶解态氮时，优选先将土壤配制成土壤溶液；所述土壤溶液的配制方法优选包括以下步骤：

取新鲜土壤过2mm筛，称取0.5g筛取的土壤(鲜重)，加入5ml浓度为0.5mol/l的k2so4水溶液，在室温下震荡提取1h，过0.45mm滤膜，取滤液作为土壤溶液；将土壤溶液分为四组分别用于铵态氮、硝酸态氮、亚硝酸态氮和总溶解态氮的测定；在测定时，每份所述土壤溶液的体积优选为1ml。

在本发明中，所述铵态氮浓度-吸光度标准曲线的建立包括以下步骤：

配制铵态氮标准溶液，将所述铵态氮标准溶液、氧化剂和显色剂混合、显色，测定660nm处的吸光度，得到铵态氮浓度-吸光度标准曲线；所述氧化剂为次氯酸钠和氯代异氰尿酸钠的水溶液，所述显色剂为水杨酸的氢氧化钠水溶液。

在本发明中，所述铵态氮标准溶液的溶质优选为氯化铵；在本发明的具体实施例中，所述铵态氮标准溶液的配制方法优选包括以下步骤：称取3.819g氯化铵溶于水中，定容至1000ml，得到浓度(以氮计)为1000mg/l的铵态氮标准储备液；取适量铵态氮标准储备液定容至100ml，分别配制浓度(以氮计)分别为0.1mg/l、0.2mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l、2.5m/l和5mg/l的铵态氮标准溶液。

在本发明中，所述氧化剂中次氯酸钠和氯代异氰尿酸钠的质量比优选为6.5～7.2：0.025～0.035。在本发明的具体实施例中，氧化剂的制备方法优选包括以下步骤：量取65ml次氯酸钠溶液(有效氯含量>5.3％)，溶解于1000ml水中；在搅拌的条件下，再缓慢加入0.025g氯代异氰尿酸钠，静置过夜，得到氧化剂。

在本发明的具体实施例中，所述显色剂的配制方法优选包括以下步骤：称取144g水杨酸钠，溶解至1000ml浓度为0.3mol/l的naoh溶液中，得到显色剂。

在本发明中，所述铵态氮标准溶液、氧化剂和显色剂混合的顺序优选为先将铵态氮标准溶液与氧化剂混合后，再与所述显色剂混合。在本发明中，所述氧化剂和显色剂的加入量优选相对铵态氮标准溶液中铵态氮含量过量，以使铵态氮能够全部被氧化为单氯胺，再与后续的水杨酸形成靛酚，并全部显色表征。

在本发明中，所述显色的温度优选为室温，时间优选为30min。

在本发明的具体实施例中，所述铵态氮标准溶液、氧化剂和显色剂混合、显色的具体过程为：将100μl铵态氮标准溶液、20μl氧化剂和50μl显色剂混合，在室温下显色30min。

在本发明中，所述硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线的建立包括以下步骤：

配制硝酸态氮标准溶液，将所述硝酸态氮标准溶液、硝酸盐还原酶、第一griess试剂和第二griess试剂混合、显色，测定540nm处的吸光度，得到硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线；所述第一griess试剂为n-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐的水溶液，所述第二griess试剂为磺胺和氯化钒的盐酸水溶液。

在本发明中，所述硝酸态氮标准溶液的溶质优选为硝酸钾；在本发明的具体实施例中，所述硝酸态氮标准溶液的配制方法优选包括以下步骤：称取7.221g硝酸钾溶于水中，定容至1000ml，得到浓度(以氮计)为1000mg/l的硝酸态氮标准储备液；取适量硝酸态氮标准储备液定容至100ml，配制浓度(以氮计)分别为0.1mg/l、0.2mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l、2.5mg/l和5mg/l的硝酸态氮标准溶液。

在本发明中，所述硝酸盐还原酶优选以水溶液的形式加入，在本发明的具体实施例中，所述硝酸盐还原酶溶液的配制方法优选包括以下步骤：向含有3个单位的硝酸盐还原酶粉状制剂的安培瓶中加入ph为7.5的磷酸盐缓冲溶液1ml，震荡混匀30min，保存在-20℃下备用，得到硝酸盐还原酶储备液，所述硝酸盐还原酶储备液可稳定保存3～4个月；以移液器小心将安培瓶中的硝酸盐还原酶储备液全部移入50ml试管内，以ph为7.5的磷酸盐缓冲溶液反复润洗原安培瓶，将磷酸盐润洗液全量移入上述50ml试管，以ph为7.5的磷酸盐缓冲溶液定容至20ml，得到浓度为0.15u/ml的硝酸盐还原酶溶液，所述硝酸盐还原酶溶液可在4℃下稳定保存18h。

在本发明的具体实施例中，所述第一griess试剂的配制方法优选为：称量50mg的n-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐与250ml水混合，得到所述第一griess试剂。

在本发明中，所述第二griess试剂中磺胺和氯化钒的质量比优选为4.5～5.5：0.10～0.20，进一步优选为4.8～5.3：0.12～0.20，更优选为5.0：0.14。在本发明的具体实施例中，所述第二griess试剂的制备方法优选包括以下步骤：将5.0g磺胺、0.14g氯化钒与500ml浓度为3mol/l的hcl溶液混合，得到所述第二griess试剂，所述第二griess试剂可稳定存在数月。

在本发明中，所述硝酸态氮标准溶液、硝酸盐还原酶、第一griess试剂和第二griess试剂混合的顺序优选为先将硝酸态氮标准溶液和硝酸盐还原酶混合后，然后依次快速加入第一griess试剂和第二griess试剂。在本发明中，所述硝酸盐还原酶、第一griess试剂和第二griess试剂的加入量优选相对硝酸态氮标准溶液中硝酸态氮含量过量，以使硝酸态氮能够全部转化为亚硝酸态氮，且全部显色表征。

在本发明中，所述显色的温度优选为37℃，时间优选为60min。

在本发明的具体实施例中，将所述硝酸态氮标准溶液、硝酸盐还原酶、第一griess试剂和第二griess试剂混合、显色的具体过程优选为：

将100μl硝酸态氮标准溶液与100μl硝酸盐还原酶溶液混合后，再依次迅速加入50μl第一griess试剂和50μl第二griess试剂，在37℃下显色60min。

在本发明中，所述亚硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线的建立包括以下步骤：

配制亚硝酸态氮标准溶液，将所述亚硝酸态氮标准溶液、第一griess试剂和第二griess试剂混合、显色，测定540nm处的吸光度，得到亚硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线；

在本发明中，所述亚硝酸态氮标准溶液的溶质优选为亚硝酸钠；在本发明的具体实施例中，所述亚硝酸态氮标准溶液的配制方法优选包括以下步骤：称取4.928g亚硝酸钠溶于水中，定容至1000ml，得到浓度(以氮计)为1000mg/l的亚硝酸态氮标准储备液；取适量亚硝酸态氮标准储备液定容至100ml，分别配制浓度(以氮计)为0.1mg/l、0.2mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l、2.5mg/l和5mg/l的亚硝酸态氮标准溶液。

在本发明中，所述第一griess试剂和第二griess试剂优选与所述硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线建立涉及的第一griess试剂和第二griess试剂一致，在此不再赘述。

在本发明中，所述亚硝酸态氮标准溶液、第一griess试剂和第二griess试剂混合的顺序优选为：在所述亚硝酸态氮标准溶液依次快速加入第一griess试剂和第二griess试剂。在本发明中，所述第一griess试剂和第二griess试剂的加入量优选相对亚硝酸态氮标准溶液中亚硝酸态氮含量过量，以使亚硝酸态氮全部显色。

在本发明中，所述显色的温度优选为37℃，时间优选为60min。

在本发明的具体实施例中，所述亚硝酸态氮标准溶液、第一griess试剂和第二griess试剂混合、显色的具体过程优选为：在100μl亚硝酸态氮标准溶液中依次快速加入50μl第一griess试剂和50μl第二griess试剂，在37℃下显色60min。

在本发明中，所述总溶解态氮浓度-吸光度标准曲线的建立包括以下步骤：

配制总溶解态氮标准溶液，将所述总溶解态氮标准溶液、过硫酸盐氧化剂和水混合，得到消解液；将所述消解液、硝酸盐还原酶、第一griess试剂和第二griess试剂混合、显色，测定540nm处的吸光度，得到总溶解态氮浓度-吸光度标准曲线。

在本发明中，所述总溶解态氮标准溶液的溶质优选为甘氨酸。在本发明的具体实施例中，所述总溶解态氮标准溶液的配制方法优选包括以下步骤：

称取5.362g甘氨酸溶于水中，定容至1000ml，得到浓度(以氮计)为1000mg/l的总溶解态氮标准储备液；取适量总溶解态氮标准储备液定容至100ml，分别配制浓度(以氮计)为0.1mg/l，0.2mg/l，0.5mg/l，1.0mg/l，1.5mg/l，2.5mg/l，5mg/l的总溶解态氮标准溶液。

在本发明中，所述过硫酸盐氧化剂优选为过硫酸钾、高锰酸钾、氢氧化钠和硼酸的混合物；所述过硫酸盐氧化剂中过硫酸钾、高锰酸钾、氢氧化钠和硼酸的质量比优选为25：20～25：5～6：10～20，进一步优选为25：25：6.2：15。

在本发明中，所述甘氨酸与过硫酸盐氧化剂的质量比优选为0.02～1.00：2500～3500，本发明将所述甘氨酸与过硫酸盐氧化剂的质量比控制为0.02～1.00：2500～3500，能够保证甘氨酸被全部氧化，得到硝酸态氮。

在本发明中，所述总溶解态氮标准溶液、过硫酸盐氧化剂和水的混合顺序优选为：将过硫酸盐氧化剂与水混合，过硫酸盐氧化剂水溶液；然后将所述总溶解态氮标准溶液与所述过硫酸盐氧化剂水溶液混合。

在本发明中，所述消解的温度优选为120℃，时间优选为40min。

在本发明的具体实施例中，配制总溶解态氮标准溶液，将所述总溶解态氮标准溶液、过硫酸盐氧化剂和水混合，得到消解液的具体过程优选包括以下步骤：

称取5.362g甘氨酸溶于水中，定容至1000ml，配制浓度(以氮计)为1000mg/l的总溶解态氮储备液；取适量总溶解态氮储备液定容至100ml，分别配制浓度(以氮计)为0.1mg/l、0.2mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l、2.5mg/l和5mg/l的总溶解态氮标准溶液；

称取25g过硫酸钾、25g高锰酸钾、6.2g氢氧化钠和15g硼酸，并用去离子水定容至1l，得到过硫酸盐氧化剂水溶液；

量取2.5ml不同浓度的总溶解态氮标准溶液与2.5ml过硫酸盐氧化剂水溶液，在120℃下消解40min，得到消解液。

在本发明中，所述硝酸盐还原酶、第一griess试剂和第二griess试剂优选与所述硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线建立中涉及的硝酸盐还原酶、第一griess试剂和第二griess试剂一致，在此不再赘述。

在本发明中，所述消解液、硝酸盐还原酶、第一griess试剂和第二griess试剂混合的顺序优选为：先将所述消解液与硝酸盐还原酶混合，然后再依次快速(30秒内)加入第一griess试剂和第二griess试剂。在本发明中，所述硝酸盐还原酶、第一griess试剂和第二griess试剂的加入量优选相对消解液中硝态氮含量过量，以使硝态氮全部转化为亚硝酸盐，并使亚硝酸态氮全部显色。

在本发明中，所述显色的温度优选为37℃，时间优选为60min。

在本发明的具体实施例中，所述消解液、硝酸盐还原酶、第一griess试剂和第二griess试剂混合、显色的具体过程优选为：将100μl消解液与100μl硝酸盐还原酶溶液混合后，然后依次快速加入50μl第一griess试剂和50μl第二griess试剂，在37℃下显色60min。

在本发明中，所述总溶解态氮包括硝酸态氮、亚硝酸态氮、铵态氮和溶解态有机氮。

在本发明中，所述铵态氮标准溶液、硝酸态标准溶液、亚硝酸态标准溶液和总溶解态氮标准溶液中相应氮的浓度优选小于5mg/l；这是因为在样品(水体、土壤)中各种形式的氮的浓度一般不会超过5mg/l，所以在相应标准溶液配制时，也将5mg/l作为浓度上限。

在本发明中，所述铵态氮标准溶液、硝酸态标准溶液、亚硝酸态标准溶液和总溶解态氮标准溶液的吸光度值范围均优选为0.5～2.5；当待测样品溶液或者各类氮标准溶液的吸光度超过3.0，优选先进行稀释后再测量。本发明将各形态氮标准溶液或者待测样品溶液的吸光度值控制为0.5～2.5，保证了吸光度值的准确性，进而提高了标准曲线及最终待测样品中铵态氮、硝酸态氮、亚硝酸态氮和总溶解态氮浓度的准确性。

得到铵态氮浓度-吸光度标准曲线、硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线、亚硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线和总溶解态氮浓度-吸光度标准曲线后，本发明测定样品中铵态氮、硝酸态氮、亚硝酸态氮以及总溶解态氮。

在本发明中，测定样品中铵态氮、硝酸态氮、亚硝酸态氮以及总溶解态氮的步骤优选为：

将待测样品配制成待测样品溶液，将所述待测样品溶液按照各标准曲线建立时的显色反应进行显色，得到相应氮形态的吸光度，并带入相应的标准曲线中，获得标准曲线测铵态氮含量、标准曲线测硝酸态氮含量、标准曲线测亚硝酸态氮含量和标准曲线测总溶解态氮含量。

在本发明中，所述待测样品中铵态氮含量的测定步骤优选为：将100μl待测样品溶液、20μl氧化剂和50μl显色剂混合，在室温下显色30min，测定660nm处的吸光度，将得到的吸光度值带入到所述铵态氮含量标准曲线中，得到标准曲线测铵态氮含量，得到的标准曲线测铵态氮含量即为待测样品中铵态氮含量。

在本发明中，所述待测样品中亚硝酸态氮含量的测定步骤优选为：在100μl待测样品溶液依次迅速加入50μl第一griess试剂和50μl第二griess试剂，在37℃下显色60min，测定540nm处的吸光度，将得到的吸光度值带入到所述亚硝酸态氮标准曲线中，得到标准曲线测亚硝酸态氮含量，得到的标准曲线测亚硝酸态氮含量即为待测样品中亚硝酸态氮含量。

在本发明中，所述待测样品中硝酸态氮含量的测定步骤优选为：将100μl待测样品溶液与100μl硝酸盐还原酶溶液混合后，再依次迅速加入50μl第一griess试剂和50μl第二griess试剂，在37℃下显色60min，测定540nm处的吸光度，将得到的吸光度值带入到所述硝酸态氮标准曲线，得到标准曲线测硝酸态氮含量，所述标准曲线测硝酸态氮含量与所述标准曲线测亚硝酸态氮含量的差值为待测样品中硝酸态氮含量。

在本发明中，所述待测样品中总溶解态氮含量的测定步骤优选为：将2.5ml待测样品与2.5ml过硫酸盐氧化剂水溶液(称取25g过硫酸钾、25g高锰酸钾、6.2g氢氧化钠和15g硼酸，并用去离子水定容至1l，得到过硫酸盐氧化剂水溶液；)混合，在120℃下消解40min，得到消解液；将100μl消解液与100μl硝酸盐还原酶溶液混合后，然后依次快速加入50μl第一griess试剂和50μl第二griess试剂，在37℃下显色60min，测定540nm处的吸光度，将得到的吸光度值带入到所述总溶解态氮标准曲线，得到标准曲线测总溶解态氮含量，得到的标准曲线测总溶解态氮含量即为待测样品中总溶解态氮含量。

下面结合实施例对本发明提供的样品中铵态氮、硝酸态氮、亚硝酸态氮以及总溶解态氮的测定方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

土壤溶液的配制：取新鲜土壤过2mm筛，称取0.5g筛取的土壤(鲜重)，加入5ml浓度为0.5mol/l的k2so4水溶液，在室温下震荡提取1h，过0.45μm滤膜，取滤液作为土壤溶液；将土壤溶液分为四组分别用于铵态氮、硝酸态氮、亚硝酸态氮和总溶解态氮的测定；测定时，每份所述土壤溶液的体积为1ml。

(1)铵态氮浓度-吸光度标准曲线的建立

配制氧化剂：量取65ml次氯酸钠溶液(有效氯含量>5.3％)，溶解于1000ml水中；在搅拌的条件下，再缓慢加入0.025g氯代异氰尿酸钠，静置过夜，得到所述氧化剂。

配制显色剂：称取144g水杨酸钠，溶解至1000ml浓度为0.3mol/l的naoh溶液中，得到显色剂。

配制铵态氮标准溶液：称取3.819g氯化铵溶于水中，定容至1000ml，得到浓度(以氮计)为1000mg/l的铵态氮标准储备液；取适量铵态氮标准储备液定容至100ml，分别配制浓度(以氮计)为0.1mg/l，0.2mg/l，0.5mg/l，1.0mg/l，1.5mg/l，2.5mg/l和5mg/l的铵态氮标准溶液。

显色反应：将100μl铵态氮标准溶液+20μl氧化剂+50μl显色剂；在室温下显色30min，在660nm处测定吸光度，建立铵态氮浓度-吸光度标准曲线，结果如图1所示，所得标准曲线的参数如表1所示。采用外标法测定所得土壤溶液中铵态氮的检出限，结果如表1所示。从表1中可以看出：铵态氮浓度-吸光度标准曲线在铵态氮浓度(以氮计)为0.1～5mg/l的范围内，斜率为0.517，截距为0.064，相关系数为0.95；该标准曲线对土壤溶液中铵态氮的检出限(lod)为0.021mg/l，换算到土壤样品中，检出限为0.21mg/kg。

表1外标法测定铵态氮标准曲线及检出限

选取四个不同的土壤样品，按照土壤样品的配制方法，配制土壤溶液；采用相同的显色反应，测定土壤溶液中铵态氮的浓度；并采用外标法验证铵态氮浓度-吸光度标准曲线对四个土壤样品的测定的精密度及准确度，结果如表2所示。

表2外标法测定铵态氮标准曲线的精密度及准确度

从表2可以看出：本发明提供的铵态氮标准曲线的变异系数为2.57～5.21％，说明该方法精密度高；加标回收率为81～102％，说明准确度高。

(2)硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线的建立

硝酸盐还原酶溶液的配制：向含有3个单位的硝酸盐还原酶粉状制剂(atnar2，ec#1.7.1.1.)的安培瓶中加入ph为7.5的磷酸盐缓冲溶液1ml，震荡混匀30min，保存在-20℃下备用，得到硝酸盐还原酶储备液；

以移液器小心将安瓶中所有的硝酸盐还原酶储备液移入50ml试管内，以ph为7.5的磷酸盐缓冲溶液反复润洗原安培瓶，将磷酸盐润洗液全量移入上述50ml试管，以ph为7.5的磷酸盐缓冲溶液定容至20ml，得到浓度为0.15u/ml的硝酸盐还原酶溶液；此溶液可在4℃下稳定保存18h。

配制第一griess试剂：称量50mg的n-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐与250ml水混合，得到第一griess试剂。

配制第二griess试剂：将5g磺胺、0.14g氯化钒和500ml浓度为3mol/l的hcl溶液混合，得到所述第二griess试剂。

配制硝酸态氮标准溶液：称取7.221g硝酸钾溶于水中，定容至1000ml，得到浓度(以氮计)为1000mg/l的硝酸态氮标准储备液；取适量硝酸态氮标准储备液定容至100ml，分别得到浓度(以氮计)为0.1mg/l、0.2mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l、2.5mg/l和5mg/l的硝酸态标准溶液。

显色反应：100μl硝酸态氮标准溶液+100μl硝酸盐还原酶溶液+50μl第一griess试剂(迅速加入)+50μl第二griess试剂(迅速加入)，共计300μl反应体系；反应体系在37℃下显色60min，在540nm处测定吸光度，建立硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线，结果如图2所示，所得标准曲线的参数如表3所示。采用外标法测定所得土壤溶液中硝酸态氮检出限，结果如表3所示。从表3中可以看出：硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线在硝酸态氮浓度(以氮计)为0.1～5mg/l的范围内，斜率为0.197，截距为0.076，相关系数为0.97；该标准曲线对土壤溶液中硝酸态氮的检出限(lod)为0.024mg/l，换算到土壤样品中，检出限为0.24mg/kg。

表3外标法测定硝酸态氮标准曲线及检出限

选取四个不同的土壤样品，按照土壤样品的配制方法，配制土壤溶液；采用相同的显色反应，测定土壤溶液中硝酸态氮的浓度；并采用外标法验证硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线对四个土壤样品的测定的精密度及准确度，结果如表4所示。

表4外标法测定硝酸态氮标准曲线的精密度及准确度

从表4可以看出：本发明提供的硝酸态氮标准曲线的变异系数为2.66～4.97％，说明该方法精密度高；加标回收率为86～110％，说明准确度高。

(3)亚硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线的建立

第一griess试剂和第二griess试剂的配制参照(2)。

配制亚硝酸态氮标准溶液：称取4.928g亚硝酸钠溶于水中，定容至1000ml，得到浓度(以氮计)为1000mg/l的亚硝酸态氮标准储备液；取适量标准储备液定容至100ml，分别配制浓度(以氮计)为0.1mg/l、0.2mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l、2.5mg/l和5mg/l的亚硝酸态氮标准溶液。

显色反应：100μl亚硝酸态氮标准溶液+50μl第一griess试剂(迅速加入)+50μl第二griess试剂(迅速加入)，共计200μl反应体系；反应体系在37℃下显色60min，在540nm处测定吸光度，建立亚硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线，结果如图3所示，所得标准曲线的参数如表5所示。采用外标法测定所得土壤溶液中亚硝酸态氮检出限，结果如表3所示。从表3中可以看出：亚硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线在亚硝酸态氮浓度(以氮计)为0.1～5mg/l的范围内，斜率为0.289，截距为0.081，相关系数为0.97；该标准曲线对土壤溶液中硝酸态氮的检出限(lod)为0.021mg/l，换算到土壤样品中，检出限为0.21mg/kg。

表5外标法测定亚硝酸态氮标准曲线及检出限

选取四个不同的土壤样品，按照土壤样品的配制方法，配制土壤溶液；采用相同的显色反应，测定土壤溶液中亚硝酸态氮的浓度；并采用外标法验证亚硝酸态氮浓度-吸光度标准曲线对四个土壤样品的测定的精密度及准确度，结果如表6所示。

表6外标法测定亚硝酸态氮标准曲线的精密度及准确度

从表6可以看出：本发明提供的亚硝酸态氮标准曲线的变异系数为3.17～4.35％，说明该方法精密度高；加标回收率为89～104％，说明准确度高。

(4)总溶解态氮(tdn)浓度-吸光度标准曲线的建立

硝酸盐还原酶溶液、第一griess试剂和第二griess试剂的配制参照(2)。

配制过硫酸盐氧化剂水溶液：称量25g过硫酸钾(k2s2o8)、25g高锰酸钾、6.2g氢氧化钠(naoh)和15g硼酸(h3bo3)，用去离子水定容至1l，得到过硫酸盐氧化剂水溶液。

配制总溶解态氮(tdn)的标准溶液：称取5.362g甘氨酸溶于水中，定容至1000ml，配制浓度(以氮计)为1000mg/l的总溶解态氮储备液；取适量总溶解态氮储备液定容至100ml，分别配制浓度(以氮计)为0.1mg/l、0.2mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l、2.5mg/l和5mg/l的总溶解态氮标准溶液。

显色反应：分别取系列2.5ml总溶解态氮标准溶液与2.5ml过硫酸盐氧化剂水溶液混合，在120℃下消解40min，得到消解溶液。

将100μl消解溶液+100μl硝酸盐还原酶溶液+50μl第一griess试剂(迅速加入)+50μl第二griess试剂(迅速加入)，共计300μl反应体系；反应体系在37℃下显色60min，在540nm处测定吸光度，建立总溶解态氮(tdn)浓度-吸光度标准曲线，结果如图4所示，所得标准曲线的参数如表7所示。采用外标法测定所得土壤溶液中总溶解态氮检出限，结果如表7所示。从表7可以看出：总溶解态氮浓度-吸光度标准曲线在总溶解态氮浓度(以氮计)为0.1～5mg/l的范围内，斜率为0.379，截距为0.093，相关系数为0.97；该标准曲线对土壤溶液中总溶解态氮的检出限(lod)为0.24mg/l，换算到土壤样品中，检出限为2.4mg/kg。

表7外标法测定总溶解态氮标准曲线及检出限

选取四个不同的土壤样品，按照土壤样品的配制方法，配制土壤溶液；采用相同的显色反应，测定土壤溶液中总溶解态氮的浓度；并采用外标法验证总溶解态氮浓度-吸光度标准曲线对四个土壤样品的测定的精密度及准确度，结果如表8所示。

表8外标法测定总溶解态氮标准曲线的精密度及准确度

从表8可以看出：本发明提供的总溶解态氮标准曲线的变异系数为3.86～5.35％，说明该方法精密度高；加标回收率为89～110％，说明准确度高。

从实施例可以看出：本发明提供的测定方法精密度、准确度高，且对样品中各种氮形态均有较低的检出限。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。