一种同时检测小儿宣肺止咳颗粒中六种成分含量的方法与流程

本发明属于中药检测领域，涉及一种小儿宣肺止咳颗粒的六种成分含量的方法。
背景技术：
：cn102284029a公开了一种小儿宣肺止咳颗粒组合物及其制备方法和质量控制方法，该组合物是由麻黄、竹叶防风、西南黄芩、桔梗、芥子、苦杏仁、葶苈子、马兰、黄芪、山药、山楂、甘草共十二味中药制备而成，具有宣肺解表，清热化痰的功效，主要用于小儿外感咳嗽，痰热壅肺所致的咳嗽痰多、痰黄粘稠、咳痰不爽。小儿宣肺止咳颗粒为小儿外感咳嗽常用药品，临床疗效确切，市场需求量大，但其质量标准简单，仅对葶苈子、芥子和山楂3味药材和盐酸麻黄碱、黄芩甲苷两种成分进行了薄层定性鉴别，另外还采用hplc法对黄芩苷进行了含量测定。以上质量控制方法存在以下缺陷：(1)需要对产品分别进行多次提取和检测，导致检测周期长，需要大量人力物力和检测设备；(2)仅对黄芩苷进行了定量检测，其它成分均只能定性，无法全面控制产品内在质量，不能客观反映和评价中药质量的一致性。因此，迫切需要建立一种针对小儿宣肺止咳颗粒的新的质量控制方法，以建立可溯源的、与临床疗效高度关联的全程质量控制体系。技术实现要素：本发明的目的是建立一种同时检测小儿宣肺止咳颗粒中六种成分含量的方法，旨在更高效、可靠地控制产品质量。为实现上述目的，本发明采用如下技术手段：一种同时检测小儿宣肺止咳颗粒六种成分含量的方法，所述小儿宣肺止咳颗粒由麻黄、竹叶防风、西南黄芩、桔梗、芥子、苦杏仁、葶苈子、马兰、黄芪、山药、山楂、甘草共十二味中药材制成，所述六种成分为盐酸麻黄碱、黄芩苷、苦杏仁苷、黄芪甲苷、甘草苷、升麻素苷，所述检测方法包括将小儿宣肺止咳颗粒用提取溶剂提取，然后将提取液上高效液相色谱仪进行检测的步骤，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为205-230nm，所述高效液相色谱仪的固定相为c18色谱柱，流动相a为含0.05-0.5％(重量)十二烷基苯磺酸钠的乙腈，流动相b为0.05-0.5％(体积)甲酸溶液，采用梯度洗脱，流速为0.5-2ml/min，柱温为25～35℃。优选地，所述提取溶剂为含1％(体积)磷酸的甲醇。优选地，所述紫外检测器的设定检测波长为210nm。优选地，所述流动相a为含0.1％十二烷基苯磺酸钠的乙腈。优选地，所述流动相b为0.1％甲酸溶液。优选地，所述梯度洗脱的时间为50min，分为3个时间段，各时间段流动相a和b的体积变化见下表1，表1梯度洗脱程序时间min流动相a(体积％)流动相b(体积％)0-101-1599-8510-4015-3085-7040-5030-4070-60优选地，所述流速为0.8ml/min。优选地，所述柱温为30℃。本发明的有益效果是：(1)本发明能通过一次样品制备和进样同时检测出小儿宣肺止咳颗粒中六种物质的含量，检测时间不超过2小时，与现有技术相比具有检测耗时少，速度快，费用低，仪器少等优点，大幅提高了检测效率。(2)本发明实现了小儿宣肺止咳颗粒中六种成分的定量检测，与现有的单一成分定量结合其它成分定性检测相比，本发明能更加全面地控制中药内在质量，彻底杜绝中药掺假、伪劣现象，客观反映中药质量的一致性，更有利于对中药生产的各个阶段包括药材投料等环节进行监控，从而建立可溯源的、与临床疗效高度关联的全程质量控制体系。(3)本发明通过对hplc的检测条件进行大量筛选，使待测六种成分的色谱峰分离效果好、干扰少、出峰时间短、峰面积大，从而提高了检测结果的准确度和灵敏性，从而使小儿宣肺止咳颗粒的质量更加可控。附图说明图1是六种混合对照品的hplc图谱。图2是小儿宣肺止咳颗粒的hplc标准图谱。图3是待测样品50％甲醇超声提取后的hplc图谱。图4是待测样品50％乙醇超声提取后的hplc图谱。图5是230nm检测波长得到的待测样品hplc图谱。图6是250nm检测波长得到的待测样品hplc图谱。图7是280nm检测波长得到的待测样品hplc图谱。图8是流动相为乙腈-0.05mol/l磷酸二氢钾系统得到的待测样品hplc图谱。图9是实施例4中梯度洗脱条件为(2)时得到的待测样品hplc图谱。图10是实施例4中梯度洗脱条件为(3)时得到的待测样品hplc图谱。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明进行详细地说明。以下实施例中所用到的小儿宣肺止咳颗粒由健民药业集团股份有限公司生产。处方：麻黄105g、竹节防风210g、西南黄芩210g、桔梗105g、芥子105g、苦杏仁105g、葶苈子105g、马兰210g、黄芪210g、山药105g、山楂210g、甘草105g。制法：以上十二味，麻黄粉碎，用80％乙醇回流提取三次，每次1.5小时，合并提取液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.08(55-60℃)；其余竹节防风等十一味粉碎，用90℃水浸渍三次，每次1小时，浸渍液滤过，滤液合并，减压浓缩至相对密度为1.05(55-60℃)，放冷，加乙醇至含醇量达60％，充分搅拌均匀，静置24小时，取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.21(55-60℃)，与上述麻黄清膏混合，减压浓缩至相对密度为1.31(55-60℃)，加入适量的蔗糖粉和糊精，混匀，制成颗粒，干燥，制成1000g，即得。试药：小儿宣肺止咳颗粒(批号：190801，由健民药业集团叶开泰国药有限公司提供)；对照品盐酸麻黄碱(供含测用，中国食品药品检定研究院购买，批号：171241-201809)、升麻素苷(供含测用，中国食品药品检定研究院购买，批号：111522-201913)、黄芩苷(供含测用，中国食品药品检定研究院购买，批号：110715-201821)、黄芪甲苷(供含测用，中国食品药品检定研究院购买，批号：110781-201717)、苦杏仁苷(供含测用，中国食品药品检定研究院购买，批号：110820-201808)、甘草苷(供含测用，中国食品药品检定研究院购买，批号：111610-201908)均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，甲醇为分析醇，水为超纯水。实施例1供试品溶液的制备在进行hplc含量测定前，需要对待测药物进行提取，提取的目的一是减少制剂中的检测杂质，包括中药中与检测成分无关的提取成分，以及制剂中的辅料，从而尽可能地减少杂质对待测对象特征峰峰形的干扰，使特征峰具有更好的分离度；二是为了将待测成分尽可能充分地从药物中提取出来，从而提高特征峰的峰面积，保证检测的准确度。我们根据小儿宣肺止咳颗粒的处方和制剂特点，结合药物成分的溶解性、极性、稳定性，分别考察了三种提取溶剂对检测效果的影响。供试品溶液制备方法：1.取装量差异项下的本品，混匀，研细，取0.5g，精密称定，精密加入含1％(体积)磷酸的甲醇50ml，超声处理(功率250w，频率20khz)20分钟，滤过，取续滤液，即得。2.取装量差异项下的本品，混匀，研细，取0.5g，精密称定，精密加入50％(体积)甲醇50ml，超声处理(功率250w，频率20khz)20分钟，滤过，取续滤液，即得。3.取装量差异项下的本品，混匀，研细，取0.5g，精密称定，精密加入50％乙醇(体积)50ml，超声处理(功率250w，频率20khz)20分钟，滤过，取续滤液，即得。仪器：waterse2695高效液相色谱仪，四元泵，在线真空脱气系统，自动进样器，柱温箱，紫外检测器；ab204-e电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)。流动相：含0.1％十二烷基苯磺酸钠的乙腈为流动相a；0.1％甲酸溶液为流动相b。梯度洗脱条件：见表1。柱温：30℃；检测波长：210nm；流速：0.8ml/min；进样量：10ul结果：如图2、3、4所示，含1％磷酸的甲醇提取所得供试品溶液能够较全面反映成品中的主要成分，且峰面积大，分离度较好(图2)；图3中各个主要峰的峰面积均变小，说明待测成分提取不充分，无法达到检测的准确性和精密度，且39.3min的甘草苷未完全分离；图4中不仅峰面积更小，而且13min的苦杏仁苷未完全分离，39.3min的甘草苷无色谱峰出现，因此无法实现6种成分的含量测定。最终确定以含1％磷酸的甲醇作为提取溶剂。实施例2检测波长的选择检测波长：210nm、230nm、250nm、280nm其它条件与实施例1相同。结果：从图2、5、6、7可看出，波长为230nm时(图5)，除苦杏仁苷和黄芩苷的色谱峰面积与210nm的峰面积相当外，其他几个成分的峰面积明显小于210nm的峰面积；波长为250nm时(图6)，六个成分的峰面积均明显小于210nm的峰面积；波长为280nm时(图7)，22.8min处盐酸麻黄碱的色谱峰未完全分离，30.5min黄芪甲苷和39.3min甘草苷的峰面积明显变小。综合考虑，优选210nm为最佳波长，六种成分的峰分离度好、峰面积大。实施例3流动相的选择(1)a为0.1％十二烷基苯磺酸钠的乙腈-b为0.1％甲酸溶液(2)a为0.01％十二烷基苯磺酸钠的乙腈-b为0.1％甲酸溶液(3)a为0.5％十二烷基苯磺酸钠的乙腈-b为0.1％甲酸溶液(4)a为乙腈-b为0.1％甲酸溶液(5)a为乙腈-b为0.05mol/l磷酸二氢钾检测波长：210nm其它条件与实施例1相同。表2是根据流动相(1)-(4)的hplc图谱计算得到的六种成分色谱峰分离度，流动相(5)的hplc图谱见图8。表2六种成分色谱峰分离度从表2中的结果可以看出，当流动相a不含十二烷基苯磺酸钠时，升麻素苷、苦杏仁苷、盐酸麻黄碱三个峰未完全分离(rf值小于1.5)；当流动相a含0.01％十二烷基苯磺酸钠时，升麻素苷和盐酸麻黄碱未完全分离；当流动相a含0.5％十二烷基苯磺酸钠时，升麻素苷和苦杏仁苷未完全分离；只有当流动相a含0.1％十二烷基苯磺酸钠时，六种待测成分都具有较高的分离度(rf值大于1.5)。从图8可看出，当流动相为乙腈-0.05mol/l磷酸二氢钾时，色谱峰出峰时间过快，基线发生严重漂移，色谱峰分离度很差。最终选择流动相a为0.1％十二烷基苯磺酸钠的乙腈；b为0.1％甲酸溶液。实施例4流动相梯度洗脱条件选择流动相：0.1％十二烷基苯磺酸钠的乙腈a：0.1％甲酸溶液为流动相b柱温：30℃；检测波长：210nm；流速：0.8ml/min；进样量：10ul梯度洗脱条件：结果：如图2、9、10所示，图9中，出峰时间过快，除黄芩苷色谱峰外，其他目标峰均未完全分离；图10中，盐酸麻黄碱、黄芪甲苷没有完全分离开。故梯度洗脱条件选择(1)。实施例5方法验证1.六种物质的定位仪器：waterse2695高效液相色谱仪，四元泵，在线真空脱气系统，自动进样器，柱温箱，紫外检测器；ab204-e电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)。流动相：0.1％十二烷基苯磺酸钠的乙腈为流动相a；0.1％甲酸溶液为流动相b梯度洗脱条件：柱温：30℃；检测波长：210nm；流速：0.8ml/min；进样量：10ul对照品溶液的配制：分别精密称取盐酸麻黄碱、黄芩苷、苦杏仁苷、黄芪甲苷、升麻素苷、甘草苷的对照品适量，配成每1ml分别含盐酸麻黄碱、黄芩苷、苦杏仁苷、黄芪甲苷、升麻素苷、甘草苷20ug、80ug、30ug、10ug、20ug、30ug的混合对照品溶液。测定结果见表3，混合对照品的hplc图谱见图1。表3六种物质的定位与系统适应性试验结果表物质名称对应的峰保留时间相对保留时间分离度升麻素苷1峰9.7450.3592.87苦杏仁苷2峰13.0830.4822.19盐酸麻黄碱3峰22.9020.8432.25黄芩苷(s)4峰27.16212.89黄芪甲苷5峰30.3731.1182.67甘草苷6峰39.2351.4442.482.线性精密称取升麻素苷r13.25mg，苦杏仁苷rg16.27mg，盐酸麻黄碱5.56mg，黄芩苷,8.48mg，黄芪甲苷0.85mg，甘草苷1.14mg，置25ml量瓶中，加1％磷酸的甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀得混合对照品母液。分别精密吸取上述对照品母液0.5，1，2，3，4，10ml，置10ml量瓶中，加1％磷酸的甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件测定，以峰积分面积(y：mau*min)对进样量(x：ug)进行线性回归，在定量限浓度至不高于150％指标浓度的范围内取6个浓度点进行研究。线性关系以测得的响应信号(峰面积)对被分析物浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，由相关系数r2证实良好的线性关系，要求该线性回归系数r2的数值应不小于0.990，结果见表4。表4六种物质的标准曲线、相关系数及校正因子3.重复性配制6个相同浓度的小儿宣肺止咳颗粒样品(批号：190801)溶液并进行测试，每个溶液进样2针，要求6次含量测定结果的相对标准差应不大于2.0％，结果见表5。表5六种物质含量测定的重复性试验结果样品升麻素苷苦杏仁苷盐酸麻黄碱黄芩苷黄芪甲苷甘草苷rsd1.72％1.01％1.90％1.33％1.42％1.08％结果表明：各成分的rsd值在要求范围内，表明检测方法的重复性结果良好。4.准确度取已知含量的小儿宣肺止咳颗粒(190801批，已知量按重复性结果计算)0.25g，共六份，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入对照品混合溶液(盐酸麻黄碱0.02mg/ml、黄芩苷0.08mg/ml、苦杏仁苷0.03mg/ml、黄芪甲苷0.01mg/ml、升麻素苷0.02mg/ml、甘草苷0.03mg/ml溶剂：1％磷酸的甲醇)各50ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率20khz)20分钟，放冷，再称定重量，用1％磷酸的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得准确度测定用样品溶液；按正文样品含量测定方法进行测定，计算准确度，见表7。结果表明：本方法的准确度较好，各成分的回收率在95.0％-105.0％之间，结果见表6。表6六种物质的回收率测定结果待测成分升麻素苷苦杏仁苷盐酸麻黄碱黄芩苷黄芪甲苷甘草苷平均回收率97.69％98.52％97.78％100.24％97.86％98.24％结果表明：该方法测定各有关物质的准确度良好。实施例6样品测定(1)供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品，混匀，研细，取0.5g，精密称定，精密加入含1％磷酸的甲醇50ml，超声处理(功率250w，频率20khz)20分钟，滤过，取续滤液，即得。(2)对照品溶液的制备：分别精密称取盐酸麻黄碱、黄芩苷、苦杏仁苷、黄芪甲苷、升麻素苷、甘草苷的对照品适量，用1％磷酸的甲醇配成每1ml分别含盐酸麻黄碱、黄芩苷、苦杏仁苷、黄芪甲苷、升麻素苷、甘草苷各20ug、80ug、30ug、10ug、20ug、30ug的混合溶液。(3)色谱条件与系统适应性：仪器：waterse2695高效液相色谱仪，四元泵，在线真空脱气系统，自动进样器，柱温箱，紫外检测器；流动相：0.1％十二烷基苯磺酸钠的乙腈为流动相a；0.1％甲酸溶液为流动相b梯度洗脱条件：见表1。柱温：30℃；检测波长：210nm；流速：0.8ml/min；进样量：10ul(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，测定。(5)计算公式c对为对照品溶液的浓度(mg/ml)a对为对照品溶液的峰面积a样为样品峰面积w样为样品称样量(g)(6)结果：所测得的各有关成分的含量见表7。表75批样品中六种成分的含量批次升麻素苷苦杏仁苷盐酸麻黄碱黄芩苷黄芪甲苷甘草苷1908010.14％0.33％0.21％0.89％0.004％0.044％190802015％0.38％0.22％0.88％0.006％0.041％1908030.16％0.31％0.24％0.91％0.004％0.043％1908040.14％0.34％0.25％0.94％0.006％0.045％1908050.13％0.35％0.20％0.87％0.005％0.042％当前第1页1 2 3