一种大肠杆菌检测芯片的制备方法及检测芯片与流程

本发明涉及微生物检测领域，尤其涉及一种大肠杆菌检测芯片的制备方法及检测芯片。

背景技术：

食源性致病菌是食源性疾病的主要起因。由食源性致病菌引发的疾病给人类造成大量的医疗花费和生产力损失。大肠杆菌o157:h7是目前世界范围内最重要的食源性致病菌之一。大肠杆菌o157:h7毒性极强，一般认为100～200个大肠杆菌o157:h7就能使人中毒。因此，实现大肠杆菌o157:h7快速、灵敏地检测，对于预防大肠杆菌o157:h7的暴发传染和保护人类健康均具有重要的意义。

目前，检测大肠杆菌o157:h7的常规方法主要包括传统培养检测方法、免疫学检测方法和分子生物学检测方法。尽管这些方法具有灵敏度高的特点，但许多方法依赖昂贵的仪器设备和熟练的操作人员，且需要复杂的样品前处理过程。这些方法无法满足基层及现场快速检测的需要。因此，建立灵敏、快速、无需昂贵仪器设备的大肠杆菌o157:h7检测方法对防范食品安全风险具有重要意义。

技术实现要素：

鉴于以上现有技术存在的问题，本发明提出一种大肠杆菌检测芯片的制备方法及检测芯片，主要解决现有大肠杆菌检测成本高且速度慢的问题。

为了实现上述目的及其他目的，本发明采用的技术方案如下。

一种大肠杆菌检测芯片的制备方法，包括

在预选的基底层上设置表面等离子体共振发生单元，所述表面等离子体共振发生单元表面分别采用大肠杆菌适配体和封闭溶液进行修饰，得到检测芯片；

所述表面等离子体发生单元包括一层金膜和一层纳米金阵列；将所述金膜的一面附着在所述基底层上，所述纳米金阵列附着在所述金膜的另一面上。

可选地，所述大肠杆菌适配体包括大肠杆菌o157:h7的核酸适配体。

可选地，在采用所述大肠杆菌适配体修饰所述表面等离子体共振发生单元之前，采用多个腺嘌呤脱氧核苷酸序列对所述大肠杆菌适配体进行修饰。

可选地，所述封闭溶液包含11-巯基十一烷酸，通过所述11-巯基十一烷酸封闭所述表面等离子体共振发生单元表面未与所述大肠杆菌适配体结合的所述金膜表面区域。

可选地，所述基底层与所述等离子发生单元之间通过铬层粘接。

可选地，组成所述纳米金阵列的纳米金颗粒粒径为10-30nm。

可选地，所述纳米金阵列的制备方法包括：

采用还原法获取含纳米金颗粒的胶体金溶液；

通过丙烯酰胺对所述胶体金溶液内的纳米金颗粒表面进行修饰；

在所述胶体金溶液上形成水-己烷分界面，将纳米金颗粒吸引到所述分界面；

通过紫外线照射所述分界面，获取单层纳米金颗粒膜；

将所述纳米金颗粒膜移至所述金膜表面形成周期性排列的所述纳米金阵列。

可选地，所述金膜厚度为45-50nm。

可选地，所述基底层包括bk7玻璃基底。

一种检测芯片，所述检测芯片采用权利要求1至9任一所述的方法制备而成。

如上所述，本发明一种大肠杆菌检测芯片的制备方法及检测芯片，具有以下有益效果。

大肠杆菌检测芯片采用金膜与纳米金颗粒阵列之间产生表面等离子体共振耦合效应，利于提高传感器灵敏度。

附图说明

图1为本发明一实施例中大肠杆菌检测芯片的制备方法的流程图。

图2为本发明一实施例中检测芯片的结构示意图。

图3为本发明一实施例中流路系统的结构示意图。

图4为本发明一实施例中使用检测芯片检测的三种不同浓度大肠杆菌o157:h7溶液的相位信号随时间变化的曲线图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。

请参阅图1至2，本发明提供一种大肠杆菌检测芯片的制备方法，包括步骤s01-s02.

在步骤s01中，表面等离子体共振发生单元包括一层金膜1和一层纳米金阵列3；将金膜1的一面附着在基底层上，纳米金阵列3附着在金膜1的另一面上：

在一实施例中，可选用bk7玻璃作为基底层材料，在基底层2上通过磁控溅射或真空镀膜的方式制作一层厚度为1-2nm的铬层，进而，在铬层上通过磁控溅射或者真空镀膜方式制作厚度为45-50nm的金膜1。在金膜1上通过自组装的方式制作粒径为10-30nm的纳米金颗粒阵列。

在金膜1上通过自组装方式制作左右的金纳米颗粒阵列过程如下：1)采用柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒，通过调节脱水柠檬酸三钠加热的时间和温度，可获得20nm左右直径的金纳米颗粒。

将胶体金溶液经过离心处理去掉上清液，沉淀的胶体金相继加入去离子水、丙烯酰胺和2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，直至胶体金溶液渗满培养皿。至此，完成将丙烯酰胺修饰于纳米金颗粒表面的步骤。丙烯酰胺具有的双键功能，一方面可以通过nh2与纳米金颗粒发生配位结合，另一方面通过c＝c键促进与其链接的金纳米颗粒在254nm、10w紫外光照射120分钟后产生聚合反应。

取胶体金溶液置于培养皿中，并用去离子水渗满培养皿，将己烷滴至溶液表面，形成不相容的水-已烷界面。在水-已烷界面上，逐渐滴加乙醇，达到吸引金纳米颗粒移动至交界面的目的。

采用紫外照射促进已烷挥发进而触发聚合反应，在水气界面形成完整致密、大面积和高均一度的单层金纳米颗粒膜，减少残留在颗粒表面的电荷所带来的排斥力，减少单层金纳米颗粒膜中大面积孔穴瑕疵存在的机率。将单层金纳米颗粒膜转移至传感芯片表面，形成金膜-金颗粒周期性阵列结构。

在步骤s02中，表面等离子体共振发生单元表面分别采用大肠杆菌适配体和封闭溶液进行修饰，得到检测芯片：

在一实施例中，封闭溶液包含11-巯基十一烷酸(mch)4，通过所述11-巯基十一烷酸4封闭表面等离子体共振发生单元表面未与所述大肠杆菌适配体结合的金膜表面区域。

在一实施例中，大肠杆菌适配体可采用大肠杆菌o157:h7的核酸适配体，大肠杆菌o157:h7核酸适配体修饰有连续5个腺嘌呤脱氧核苷酸序列5，称为polya修饰方法。

将合成有金膜-金颗粒周期性阵列结构的检测芯片依次由乙醇和纯水冲洗后，置于表面等离子清洗机中清洗10分钟。将金膜-金颗粒周期性阵列检测芯片浸没于含有polya修饰的大肠杆菌o157:h7核酸适配体的磷酸缓冲盐溶液(又称pbs缓冲溶液)中。静止12小时，大肠杆菌o157:h7核酸适配体通过polya结合到纳米金表面。再将检测芯片浸没于75％乙醇溶解的mch中，静止2小时。mch通过巯基与金膜-金颗粒周期性阵列结构中未于大肠杆菌o157:h7核酸适配体结合的点位所结合，达到封闭的效果。

在一实施例中，如图3所示，可通过一流路系统完成检测芯片的修饰。流路系统可包括六通电磁阀体24，其中包含电磁阀门25、电磁阀门26、电磁阀门27、电磁阀门28、电磁阀门29、电磁阀门30，蠕动泵31，装载检测芯片19并将其固定在棱镜18上的流通池32。六通电磁阀体24根据设计需要，分别选择不同的溶液进入液体管路，通过蠕动泵31控制流过检测芯片表面，并排除液体管路。

具体地，将大肠杆菌o157:h7的核酸适配体溶于pbs缓冲液中，核酸适配体浓度为10μm。mch用75％浓度的乙醇进行溶解，mch溶液浓度为1mm。将传感芯片用超纯水清洗，放入表面等离子体清洗机清洗10分钟后，将传感芯片固定在检测仪器上的流通池32中。

电磁阀25与空气相通。打开电磁阀25，启动蠕动泵31，通过相位信息监测管路的排空程度。当流路系统排空完毕，关闭电磁阀25和蠕动泵31。

电磁阀26与核酸适配体溶液相连。打开电磁阀26，蠕动泵31以50μl/min转速转动90秒，将核酸适配体溶液送入并充满流通池32。利用12小时的静止时间，促使核酸适配体修饰在表面等离子体共振发生单元表面。

电磁阀29与mch溶液相连。打开电磁阀29，蠕动泵31以50μl/min转速转动200秒，用mch溶液完全替换流通池32中原有的核酸适配体溶液，将mch溶液充满流通池32，核酸适配体溶液从流通池32中完全排除。利用2小时的静止时间，促使mch修饰在等离子体发生单元表面。

电磁阀28与pbs溶液相连。打开电磁阀28，蠕动泵31以50μl/min转速转动200秒，用pbs溶液完全替换完流通池中原有的mch溶液，将pbs溶液充满流通池，mch溶液从流通池中完全排除。

当使用制备的大肠杆菌检测芯片进行检测时，具体包括以下步骤：

电磁阀28与pbs溶液相连。电磁阀27与大肠杆菌o157:h7溶液相连。电磁阀30与naoh溶液相连。

通过白光led光源、光谱仪配合发出单色偏振光照射到检测芯片表面，记录相位信息。

pbs溶液注入流路管路，用时200秒。

大肠杆菌o157:h7溶液注入流路管路，用时200秒，充满流通池32后，静止20分钟。该静止时间利于传感芯片上的核酸适配体捕获大肠杆菌o157:h7。

pbs溶液注入流路管路，用时500秒，用于冲洗掉检测芯片上未与核酸适配体结合的大肠杆菌o157:h7，保证测量的准确性。

naoh溶液注入流路管路，用时1000秒，用于将传感芯片上核酸适配体捕获的大肠杆菌o157:h7从金膜表面洗脱掉，利于检测芯片重复使用。

pbs溶液再次注入流路管路，用时200秒，用于保持传感芯片处于pbs溶液环境。

当通过相位信号测量大肠杆菌o157:h7浓度时，如图4所示，使用0μg/l，10μg/l，20μg/l的大肠杆菌o157:h7标准溶液样品测试，微处理器分别获得各个浓度的大肠杆菌o157:h7标准溶液相位信号后，与预先存储在微处理器内部的相位信号强度与大肠杆菌o157:h7浓度间的标准曲线对比，计算大肠杆菌o157:h7的浓度。其中，沿纵坐标方向，从下向上依次为0μg/l，10μg/l，20μg/l的大肠杆菌o157:h7标准溶液的相位信号与时间的关系曲线图。

综上所述，本发明一种大肠杆菌检测芯片的制备方法及检测芯片，当单色偏振光照射到表面等离子体共振发生单元表面时，引发金膜与纳米金阵列间的等离子体共振耦合效应，可提高检测的精度和检测限；通过polya修饰方法，使得核酸适配体在纳米晶表面能够具有一定的分散间隔，使得核酸适配体在捕获目标是具有更小的空间位阻，可提高捕获效率；采用紫外照射促进已烷挥发进而触发聚合反应，在水气界面形成完整致密、大面积和高均一度的单层金纳米颗粒膜，减少残留在颗粒表面的电荷所带来的排斥力，减少单层金纳米颗粒膜中大面积孔穴瑕疵存在的机率；检测芯片可重复利用，可降低成本。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。