藻蓝蛋白β亚基基因的克隆表达的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及藻蓝蛋白β亚基基因的克隆表达。通过基因工程手段将藻蓝蛋白β亚基基因克隆于pET-32a质粒载体，重组质粒转化到感受态大肠杆菌BL21中。构建的工程菌的表达产物用镍亲和层析柱纯化后，所得融合蛋白对Hela细胞的增殖有一定的抑制作用。
【专利说明】藻蓝蛋白β亚基基因的克隆表达
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及藻蓝蛋白β亚基基因的克隆表达。
技术背景
[0002]藻蓝蛋白(phycocyanin, PC)是一种存在于蓝藻和红藻细胞内的光合色素，能高效捕获光能。其基本构建单位是α和β亚基，分子量在17kD至22kD之间。α亚基由162个氨基酸残基组成，β亚基由172个氨基酸残基组成。研究发现，藻蓝蛋白的生理活性包括抗肿瘤、抗氧化、抗炎症、提高机体抗辐射能力、保护神经组织免受损伤、增强免疫功能、抑制溶血等。将藻蓝蛋白的β亚单位在大肠杆菌中表达，发现重组体藻蓝蛋白β单位有抗癌活性，但是在正常细胞中有很小的反应，抑制癌细胞增殖和诱导细胞凋亡可能会使重组体藻蓝蛋白β单位成为一种有效的癌症预防和治疗的手段。研究发现与相同摩尔浓度的藻蓝蛋白及其α亚基相比，β亚基对某些肿瘤细胞的生长有更强的抑制作用，提示β亚基具有成为抗肿瘤药物的良好潜力。
[0003]本发明首先克隆表达藻蓝蛋白β亚基的基因，并纯化表达的融合蛋白，体外检测该蛋白对Hela细胞生长的抑制作用，为其作为抗肿瘤药物的研发提供实验依据。
【发明内容】
[0004]本发明所述的藻蓝蛋白β亚基融合蛋白是通过重组质粒构建后转化到感受态大肠杆菌，通过诱导表达 ，纯化所得蛋白而得。其制备方法如下:
[0005]从本实验室保存的含有操监蛋白全部β亚基和部分Ct亚基基因的重组质粒上，PCR法扩增出β亚基基因片段，用内切酶BamH 1、HindIII37°C双酶切β亚基基因片段和pET-32a质粒1.5h，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的产物再16°C连接16h。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21中。工程菌用LB培养基培养到细菌生长的对数期，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，20°C诱导表达20h。诱导结束后lOOOOrpm、15min离心收集菌体，按照每收集IL菌体加入50ml缓冲液的比例，用缓冲液重悬菌体，60%功率超声破碎，12000rpm、30min收集上清，用镍亲和层析柱纯化得到藻蓝蛋白β亚基的融合蛋白。
[0006]将本发明所述的含藻蓝蛋白β亚基的融合蛋白作用于Hela细胞，MTT法检测其对Hela细胞增殖的抑制作用，发现该融合蛋白对Hela细胞有明显的增殖抑制作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1为PCR扩增出的藻蓝蛋白β亚基基因序列。M =DNAMarker ；1:藻蓝蛋白β亚
基基因O
[0008]图2为菌液PCR扩增出的藻蓝蛋白β亚基基因序列。M:DNA Marker ；1:藻蓝蛋白β亚基基因。
[0009]图3为提取的重组质粒双酶切验证。M =DNAMarker ；1:双酶切得到的藻蓝蛋白β
亚基基因。[0010]图4为融合蛋白镍亲和层析柱纯化结果。M:蛋白marker ；1:诱导前菌体；2:诱导后菌体；3:菌体超声破碎离心后上清；4:菌体超声破碎离心后沉淀；5:融合蛋白镍亲和层析柱纯化效果。
【具体实施方式】
[0011]下面结合一些实例并参照图表数据对本发明做进一步的说明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0012]实施例1
[0013]含藻蓝蛋白β亚基基因的重组质粒的构建
[0014]选择藻蓝蛋白β亚基对应的基因序列克隆，序列长度为519bp。在目的基因的上下游引物中分别加入BamH 1、HindIII酶切位点。用本实验室保存的含藻蓝蛋白全部β亚基和部分α亚基基因的重组质粒PMD18-T-PC作为模板，并进行PCR扩增β亚基对应基因。PCR反应结束后，产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，如图1，切下含有目的DNA的凝胶，按照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收目的DNA片段。目的基因片段与pET-32a质粒载体同时双酶切，取双酶切产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，切下含有目的DNA的凝胶，按照凝胶回收试剂盒说明书回收目的片段。将目的基因片段与双酶切后的原核表达载体pET-32a在16°C、16h条件下连接。
[0015]实施例2
[0016]重组质粒转化到感受态大肠杆菌BL21中 [0017]取连接产物10 μ I加入到50 μ I已制备好的大肠杆菌BL21感受态细胞，轻轻混匀后冰浴30min ;42°C水浴中热激90s后，迅速再次冰浴3min ;加入500 μ I LB液体培养基并充分混匀，37°C、220rpm振摇培养Ih ;离心弃上清留取约100 μ I转化菌液，涂布于含氨苄青霉素(Amp+，100 μ g/mL)的LB固体培养基平板上，37°C培养12_16h。挑取转化成功的单克隆进行菌液PCR验证(图2)、提取质粒双酶切验证(图3)，并测序。
[0018]实施例3
[0019]工程菌的诱导表达
[0020]将保存的菌种接种于含LB培养基的小试管中，37°C、220rpm摇至菌液饱和，作为种子菌。将饱和菌液按1:100比例转接到含LB培养基的锥形瓶中，37度220rpm摇到0D600在 0.6-0.8 之间。加入终浓度为 0.2mmol/L 的 IPTG，20°C诱导 20h。lOOOOrpm、15min 离心收集菌体。
[0021]实施例4
[0022]融合蛋白的纯化
[0023]收集的菌体用缓冲液重悬，超声破碎菌体，12000rpm、30min收集上清。镍离子亲和层析柱纯化蛋白:用结合缓冲液平衡柱子，将要流尽时，将已用0.45 μ m微孔滤膜过滤后的超声上清液加入柱中；待上清液流尽，用结合缓冲液冲洗填料洗去未结合的蛋白；最后用含200mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱液并浓缩处理，加入终浓度为10%的甘油并用0.22 μ m无菌滤器过滤后备用。
[0024]实施例5
[0025]融合蛋白对Hela细胞的增殖抑制实验[0026]将纯化后的含藻蓝蛋白β亚基的融合蛋白作用于宫颈癌细胞Hela，终浓度分别为 0,0.625、1.25,2.5、5、10ymol/L 的融合蛋白及 10ymol/L 的 pET_32a 空载体蛋白，72h后，MTT法检测Hela细胞存活率。具体操作步骤:取生长良好的对数期Hela细胞，用DMEM培养基制成浓度为2 X IO4个/mL的单细胞悬液，每孔加入100 μ I于96孔板中培养至细胞贴壁。实验设空白:用于调零；阴性对照组:只加10 μ mo I/L的pET-32a空载体蛋白；实验组:0.625、1.25、2.5、5、10μπιΟ1/1的含藻蓝蛋白β亚基的融合蛋白组，每孔加培养基至总体积100 μ I。37°C二氧化碳培养箱中培养72h后弃去上清液，加入5mg/mL的MTT，每孔10μ 1，37°C继续培养4h。弃上清液，加入DMS0150y 1/L孔，振荡混匀后，在酶标仪上测定570nm下的OD值，按下式计算融合蛋白对Hela细胞生长抑制率:
[0027]抑制率％= (1-0D实验组/OD阴性对照组)X100%
[0028]表1
[0029]
【权利要求】
1.一种藻蓝蛋白β亚基基因在质粒载体上的克隆，其特征在于:质粒载体为pET-32a，酶切位点为BamH I, HindII1。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于:重组质粒需转化到感受态大肠杆菌BL21中以表达融合蛋白。
3.—种权利要求1所述的重组质粒的构建方法，其特征在于:PCR法扩增出藻蓝蛋白β亚基基因，将扩增出的基因片段和质粒载体pET-32a同时用BamH 1、HindIII内切酶于37°C双酶切1.5h，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的产物，16°C连接16h。
4.根据权利要求3所述，一种构建的工程菌表达的融合蛋白，其特征在于:融合蛋白用镍亲和层析柱纯化后，达电泳纯。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于:对Hela细胞的增殖有一定的抑制作用。
【文档编号】C12N15/66GK103923938SQ201410186005
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】欧瑜, 张静 申请人:中国药科大学