专利名称：一种藻类来源的植酸酶phyg及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种藻类来源的植酸酶PHYGP及其基因、包含该基因的重组载体和应用。
背景技术：
植酸酶是一类能水解植酸的酶类。它能将植酸磷降解为肌醇和磷酸。单胃畜禽和淡水鱼类饲料中都需要使用植酸酶，但它们对植酸酶的性质有不同的要求。对单胃畜禽而言，植酸酶的主要作用场所是单胃动物酸性的胃中，因而要求植酸酶在酸性条件下要有较高的酶活性，即酶反应的最适PH值为酸性的植酸酶。对于淡水养殖的主要鱼类一鲤科鱼类，因为它们无胃，只有PH值呈中性(pH6.5 8.0)的肠道，因而在鱼类饲料中必需使用在中性PH值条件下有高活性的植酸酶。目前商品化生产的用于单胃畜禽的植酸酶在中性pH值环境下基本没有酶活性，因而不能用于鲤科鱼类饲料。植酸酶广泛存在于微生物中，如枯草芽孢杆菌、假单孢杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、酵母及曲霉等。藻类生物数量庞大，且其生物特性呈现多样化，利用藻类可以生产许多稀有的天然活性物质，如色素、抗生素、抗病毒和真菌类药物、抗癌药物，以及微藻脂肪酸、多糖、维生素和留醇等，因此利用藻类获得新型植酸酶也将是其开发应用的重要领域之一。据了解，到目前为止，还没有来源于藻类的植酸酶基因的表达及性质研究的报道。从整个植酸磷的循环模式来看，植酸磷可从陆地环境转移进入水体环境中，特别是在养殖业密集的区域，由于大量植物性日粮中的植酸，在单胃动物消化道中没有被水解，而随着粪便被排泄到体外，这些高 植酸含量的粪便直接进入农田，但大部分植物并不能直接利用植酸，这些植酸会随着雨水流入附近的水域，而水域中的藻类可以利用植酸磷作为磷源，迅速生长造成赤潮和水体富营养化。所以，我们推测养殖业密集的区域的水体环境发生赤潮和富营养化，与藻类能直接利用植酸有一定的关系。
发明内容
本发明的目的是提供一种藻类来源的植酸酶。本发明的再一目的是提供上述藻类来源的植酸酶的基因。本发明的再一目的是提供包括上述植酸酶基因的重组载体。本发明的再一目的是提供上述植酸酶基因的重组菌株。根据本发明的含藻类来源植酸酶的重组菌株，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQIDN0.1，其保藏编号为CGMCC N0.3496。根据本发明的含藻类来源植酸酶的重组菌株，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQIDN0.2，其保藏编号为CGMCC N0.3494。根据本发明的含藻类来源植酸酶的重组菌株，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQIDN0.3，其保藏编号为CGMCC N0.3495。本发明的再一目的是提供制备上述植酸酶的方法。
本发明的再一目的是提供上述植酸酶的用途。根据本发明的藻类来源的植酸酶，为中性、其结构域为￠-折叠桶状。根据本发明的藻类来源的植酸酶，其中，所述藻类蓝藻，优选所述蓝藻为点状念珠藻、无类囊体蓝藻、或念珠藻。根据本发明的藻类来源的植酸酶，其中，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQ IDN0.1、SEQ ID N0.2、或 SEQ ID N0.3 所示。本发明提供了编码上述藻类来源的植酸酶的基因，其中，所述植酸酶基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、或 SEQ ID N0.6 所示。本发明还提供了包含上述植酸酶基因的重组载体。本发明还提供了包含上述植酸酶基因的重组菌株。
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根据本发明的制备上述植酸酶的方法包括以下步骤:I)构建上述包含植酸酶基因的重组载体；2)转化宿主菌，并表达；3)分离纯化得到所述植酸酶。根据本发明的藻类来源的植酸酶可以用于鱼类饲料。本发明首次对藻类来源的植酸酶基因进行了表达及酶学性质的研究，并证明了来源于藻类(如点状念珠藻N.punctiforme和无类囊体蓝藻G.violaceus)的植酸酶基因都能够在大肠杆菌表达系统中成功表达。表达得到的重组蛋白都能对植酸具有较好的水解作用，说明本发明获得的藻类来源的植酸酶基因都是具有植酸水解功能的基因。酶学性质的分析，表明该植酸酶结构域具有典型的BPP (beta-折叠桶状植酸酶)植酸酶的特性，在中性条件下具有较高的催化活性，Ca2+对其的活性和热稳定性都具有重要影响，最适反应Ca2+浓度为1.5mM，最适反应pH为6.0，最适反应温度为45° C。从以上结果，我们可以推测出藻类来源的植酸酶为中性植酸酶，可以用于水产动物的饲养。
图1 植酸酶结构域 PhyNl-pd(图 l_a)、植酸酶 PhyNl(图 l_b)、PhyG(图 l_c)、PhyN2(图1-d)在大肠杆菌中表达及纯化的SDS-PAGE分析，其中，M:低分子量蛋白质Marker ；1:PhyNl-pd ；2:PhyNl ；2:PhyG ;3:PhyN2。图2重组植酸酶的最适Ca2+浓度，图2a:PhyNl-pd ；图2b =PhyNl ；图2c =PhyG ；图2d:PhyN20图3 重组植酸酶的最适 pH，图 3a:PhyNl-pd ；图 3b =PhyNl ；图 3c =PhyG ;图 3d:PhyN20图4重组植酸酶的最适反应温度，图4a:PhyNl-pd ；图4b =PhyNl ；图4c =PhyG ；图4d:PhyN20图5重组植酸酶的热稳定性，图5a:PhyNl-pd ；图5b =PhyNl ；图5c =PhyG ;图5d:PhyN2。根据本发明的含藻类来源植酸酶的重组菌株:大肠埃希氏菌phyNl(Escherichiacoli phyNl),所述植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.1,其保藏编号为CGMCCN0.3496，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏日期2009年12月3日。根据本发明的含藻类来源植酸酶的重组菌株:大肠埃希氏菌phyG(Escherichiacoli phyG)，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.2，其保藏编号为CGMCCN0.3494。根据本发明的含藻类来源植酸酶的重组菌株:大肠埃希氏菌phyN2(Escherichiacoli phyN2)，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.3，其保藏编号为CGMCCN0.3495。
具体实施例方式实验条件:1、菌株及载体:点状念珠藻Nostoc punctiforme美国标准菌种收藏所ATCC29133,无类囊体蓝藻Gloeobacter violaceus美国标准菌种收藏所ATCC 29082,及念珠藻Nostoc sp.美国标准菌种收藏所ATCC 27893为公知菌株。大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)、表达载体pET-22b (+)(购自 Novagen 公司)。2、酶类及其他生化试剂:内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。PNPGal、植酸钠等底物购自Sigma公司，其它都为国产试剂。3.培养基:大肠杆菌培养基为LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH7.0)。本发明中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括:Sambrook等人，Molecul ar Cloning, A Laboratory Manual (第 3版 2001) ；Kriegler, GeneTransfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；和 Current ProtocolsinMolecular Biology (Au sub el 等人编，1994)。实施例1点状念珠藻Nostoc punctiiforme ATCC 29133的培养及其基因组DNA的提取用250mL三角瓶装IOOmL BGl I培养基(IOOmL中含有NaN03150mg, KH2P044mg, MgSO4 7H20 7.5mg, CaCl23.6mg,梓檬酸 0.6mg,梓檬酸铁铵 0.6mg,EDTA0.lmg, Na2C032mg, H3B03286ng, MnCl2 4H20 181ng, ZnSO4 7H20 22.2ng, CuSO4 5H20
7.4ng, MoO3L 5ng),接种0.1g湿藻泥，40001ux连续光照，温度为24°C，反复式摇床培养20天，纱布过滤，并用滤纸吸干多余水分用作DNA提取的材料。培养获得藻泥重悬于Iml 0.25mol/l的EDTA缓冲液中(pH8.0)，37°C温育30min，加入0.1ml 10%的N-十二烷基肌氨酸钠(sarkosyl)溶液，继续温育15min，离心收集细胞沉淀，重悬于0.4ml重蒸水中，加入0.1ml溶菌酶(10mg/ml)，37°C温育2小时，再加入
0.lmllO%SDS溶液并轻轻晃动至样品澄清，加入等体积的苯酚抽提，再用苯酚/氯仿混合液抽提，最后用氯仿抽提2次。加入2倍体积的预冷乙醇沉淀DNA，离心后溶于TE缓冲液，用于基因的克隆。实施例2点状念珠藻Nostoc punctiiforme ATCC 29133植酸酶编码基因的克隆使用Pfam 蛋白质家族网站(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)的 折叠桶植酸酶家族的所有植酸酶序列进行比对分析，可以发现在BPP植酸酶中存在两个相对比较保守的区域:D-A-[A/T/E]-D-D-P-A-[I/L/V]-W 和 N_N-[V/I]-D_[I/L/V] -R- [Y/D/Q]。在BBP植酸酶中，前一个保守区域是钙离子的结合位点，后一个保守区域在BBP植酸酶序列是催化活性中心，这两个区域在BPP植酸酶中非常保守。利用CODEHAPprimer设计的基本原理，根据这两个保守区域设计一组简并引物。在保证特异性扩增植酸酶基因的前提下，为了使引物能够与潜在的更多植酸酶基因配对结合，将设计的简并引物利用 Harvard Medica School 的 MS-BLAST(http://genetics, bwh.harvard, edu/msblast/)进行BLAST比对分析，然后根据比对结果优化引物序列使之能与更多的植酸酶基因配对结合。最终设计确定了 BPP植酸酶的简并引物BPP-F，5’ -GACGCCGAYGAYCCNGCNITNTGG-3’ 和 BPP-R, 5’-CAGGSCGCANRTCIACRTTRTT-3'。(Y 代表 C 或 T ;R 代表 A 或 G ;S 代表C或G ;N代表A，C，G或T ; I代表A，C，G或T)。以念珠藻基因组DNA为模板，利用降落PCR的方法来扩增目标植酸酶基因片段对
引物的可行性进行验证。反应体系包括:
权利要求
1.一种藻类来源的植酸酶PHYG，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.2。
2.一种藻类来源的植酸酶基因phyG，其特征在于，编码权利要求1所述的植酸酶。
3.根据权利要求1所述的植酸酶基因phyG，其特征在于，所述植酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。
4.一种含藻类来源植酸酶的重组菌株，其特征在于，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQID N0.2，其保藏编号为 CGMCC N0.3494。
5.根据权利要求1所述植酸酶PHYG用于水解植酸的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种藻类来源的植酸酶及其基因、包含该基因的重组载体和应用。根据本发明的藻类来源的植酸酶，其中，所述藻类蓝藻，优选所述蓝藻为点状念珠藻、无类囊体蓝藻、或念珠藻。本发明首次对藻类来源的植酸酶基因进行了表达及酶学性质的研究，并证明了来源于藻类的植酸酶基因都能够在大肠杆菌表达系统中成功表达。表达得到的重组蛋白都能对植酸具有较好的水解作用，说明本发明获得的藻类来源的植酸酶基因都是具有植酸水解功能的基因。
文档编号C12N15/55GK103114080SQ20121043834
公开日2013年5月22日 申请日期2009年12月15日 优先权日2009年12月15日
发明者姚斌, 黄火清, 杨培龙, 罗会颖, 石鹏君, 袁铁铮, 王亚茹, 柏映国, 孟昆, 史秀云 申请人:中国农业科学院饲料研究所