水稻OsXrn4基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及水稻OsXrn4基因，该基因的核苷酸序列为SEQ?IDNO：1所示。该基因来源于水稻。该基因序列是通过Blast软件对拟南芥AtXRN4序列进行同源分析，再进行序列扩增而获得。本发明获取的OsXRN4超表达转基因植物，主要应用于植物抗病毒侵染研究，避免病毒病害的为害。本发明对培育高抗病毒转基因植物具有重要的理论及实际意义，对植物病害防治其他领域也有指导作用。本发明具有以下三个特点：1）具有广谱抗性。2）抗性株系抗性稳定，不易丢失。3）抗性株系对植物与环境无安全隐患。
【专利说明】水稻OsXrn4基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】及植物病害防治领域，尤其涉及水稻Xrn4(0SXrn4)基因在植物抗RNA病毒中的应用领域。
【背景技术】
[0002]植物病毒病是植物病害中的顽症，为害普遍，防治困难。病毒病几乎可感染所有的植物种类，全世界病毒病害毎年对农业、林业、蔬菜与花卉等生产发展可造成数百亿美元的直接经济损失。植物病毒病害成为仅次于真菌病害的第二大病害。目前，全世界已发现的植物病毒已达700多种，其中我国最主要的粮食作物之一水稻上面的病毒及其类似病害已达11种。近年来，水稻黑条矮缩病、南方水稻黑条矮缩病和水稻条纹叶枯病在我国多达三分之二的省市持续发生或流行，近几年江浙区域水稻条纹叶枯病发病面积已达数千万亩次，严重威胁着我国粮食安全供给和农业可持续发展。植物病毒病害的防治是植物病害防治研究領域中亟需解决的重大科研难题。
[0003]目前应用于植物病毒病害防治的方式主要有化学防治与抗病品种的栽种。但化学防治存在施用时间受限，防治时效短，环境污染严重等多重弊端。当前通过传统方式获取的种质优良且高抗的品种种类非常稀少，且随着种植年限增多，抗性逐渐丧失。探索发现新型有效的生物防治策略成为目前病毒病害防治研究领域的研究热点。
[0004]在以往抗病毒转基因研究中，多将病毒来源的基因转入植物体内诱发植物的抗病效应。但存在着抗性水平不高、抗谱不宽、抗性逐步丧失等弊端，由此得不到广泛的应用。RNA干扰(RNA interference, RNAi)机制的发现为分子生物学和遗传学等领域带来巨大贡献。RNAi是植物体抵御外来核酸入侵的ー种天然防御机制。基于RNAi技术的植物抗病毒研究成为近年来植物抗病毒领域的研究热点。然而，仅依赖单ー抗性策略不利于抗性植株种质的可持续应用，并且具有病毒变异导致抗性丧失的潜在风险。由此不断发掘植物体内抗病毒途径的关键基因，并利用这些基因来设计新型抗病毒策略、应用于转基因育种，达到提高植物抗病毒能力，获取广谱抗病毒株系，丰富抗病毒种质的目的。
[0005]Xrn4是植物体内胞质定位的ー种5’-3’核糖核酸外切酶,与酵母的Xrnl功能同源。酵母Xrnl在病毒与寄主的互作中具有重要作用，研究表明其參与病毒的RNA重组的抑制过程，影响病毒量在寄主体内的积累。近年来关于植物XRN4的研究也证实其可在RNAi途径下游行使功能參与植物抗病毒过程。拟南芥Xrn4可降解miRNA介导切割的靶基因mRNA片段；在烟草中表达AtXrn4导致CNV RNAs积累受到抑制。将烟草XRN4沉默或功能缺失可促使TBSV重组与积累，TMV侵染和CNV RNAs的积累。研究结果表明，Xrn4在植物抗病毒途径中可能參与作用。因而，本发明将水稻Xrn4基因在植物体内超表达，并通过抗性鉴定获得抗病毒转基因植物，这是首次将Xrn4基因作为ー种抗病毒基因用于转基因抗病毒植物创制。
【发明内容】
[0006]为了解决上述的技术问题，本发明的ー个目的是提供一种水稻0sXrn4基因。本发明的第二个目的是采用上述的基因的植物表达载体、宿主细胞、植物受体细胞或组织。本发明的第三个目的是提供上述基因的用途。
[0007]为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案:
水稻基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:1所示。该基因来源于水稻。该基因序列是通过Blast软件对拟南芥AtXRM序列进行同源分析，再进行序列扩增而获得。
[0008]为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案:
包含所述的水稻0sXrn4基因的植物表达载体。作为优选，所用载体为pCV1300。
[0009]宿主细胞该宿主细胞由上述的植物表达载体转化。作为优选，所述的转化菌株为农杆菌菌株EHA105。
[0010]植物受体细胞或组织，其特征在干:该植物受体细胞或组织采用权利要求3或4所述的宿主细胞转化获得。
[0011]为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案:
水稻基因的用途，该基因用于制备转基因抗病毒植物体。作为优选，所述的基因用于制备抗水稻条纹叶枯病毒UUce stripe的水稻或抗烟草花叶病毒(TbAacco
Mosaic Virus)的烟草。
[0012]一种所述的水稻0sXrn4基因制备重组农杆菌的方法，该方法包括以下的步骤:
1)水稻0sXrn4基因的克隆
通过与已报道的拟南芥的AtXrn4序列进行Blast分析，获得水稻0sXrn4基因序列，同源性达95%以上，以此序列设计引物，获取基因全长，水稻0sXrn4基因的核苷酸序列为SEQID NO:1所示;引物序列如下:
RXRN4 f: 5’ -CCGAGACTCCGAGAGAGATTAG-3’，
RXRN4 r: 5’ -GCTTACACATTTACAATGGCCG-3’ ；
2)载体构建
分析全序列水稻0sXrn4基因酶切位点及双元表达载体pCV_GFP_2N的多克隆位点，设计引物，构建载体；引物序列如下:
RXlf: 5’ -TCTAGAATGGGAGTCCCGGCGTTCTACC-3，，
RXlr: 5’ -TCTAGACCTCTGCTGATTCAT-3’，
RX3f: 5’ -GGATCCTAGGATGGCCATGGATA-3’，
RX3r: 5’ -GAGCTCTCACTCACTCAGGCCATTGG-3’ ；
3)转化农杆菌
取-70で保存的EHA105农杆菌感受态，置冰上融解；取I Ul抽纯0sXrn4-Pcv-2N质粒加入到100 u I感受态中，混匀，加入到处理好的电击杯；设置2.2V电压，电击转化；点击完成加入900 的YEP液体培养基；28 °C, 200 rpm摇床培养2 h，菌液涂布在含50 Ug/ml卡那霉素和100 U g/ml利福平平板上，28で培养至形成单菌落。
[0013]ー种抗水稻条纹叶枯病毒OPice stripe)的水稻的制备方法，该方法采用上述的宿主细胞对水稻成熟胚进行的遗传转化获得。
[0014]—种抗烟草花叶病毒(TbAacco ifosaic Kirw1S)的烟草的制备方法,该方法采用上述的宿主细胞对烟草叶盘法进行遗传转化获得。[0015]本发明通过设计引物克隆基因阅读框全长，构建表达载体，通过遗传转化与分子技术检测，获取稳定遗传的0sXrn4超表达转基因植株。然后对转基因植株接种病毒，进行抗病毒分析，筛选抗病株系。[0016]本发明获取的OsXRM超表达转基因植物，主要应用于植物抗病毒侵染研究，避免病毒病害的为害。本发明对培育高抗病毒转基因植物具有重要的理论及实际意义，对植物病害防治其他领域也有指导作用。与通过其他抗病毒策略获得的抗性株系相比，本发明具体优势如下:
1)具有广谱抗性。XRN4基因是植物体保守存在、不可缺少的功能基因，在RNAi下游，通过參与植物病毒的代谢途径行使抗病毒功能。XRN4基因在植物体内的參与植物抗病毒途径,不针对特定病毒行使功能,没有抗病种类局限性。通过在植物体内超表达XRN4基因，植物本身的抗病毒能力增强，具有广谱抗病毒能力；
2)抗性株系抗性稳定，不易丢失。XRN4基因是植物体自身的抗病相关功能基因，功能保守，进化过程中不易发生功能缺失与更改，植物病毒短时间内无法进化出抵抗此抗病途径的能力，本发明获取的OsXRM超表达转基因植物抗性稳定，不易丢失；
3)抗性株系对植物与环境无安全隐患。因为转入的OsXRM基因属于植物的内源或同源基因，进行超表达之后不会对植物体与环境造成危害，不存在基因污染等问题，对环境无安全隐患。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1:含有0sXrn4基因的载体图谱。
[0018]图2:转0sXrn4基因水稻的PCR检测结果，其中I号泳道是阴性对照。
[0019]图3:转0sXrn4基因水稻的Southern blot结果。
[0020]图4:转0sXrn4基因水稻的real-time PCR结果。
[0021]图5:转0sXrn4基因水稻的抗水稻条纹病毒鉴定。
[0022]图6 -M 0sXrn4基因烟草的PCR检测结果，其中19号泳道是阴性对照。
[0023]图7 -M 0sXrn4基因烟草的抗烟草花叶病毒鉴定。
【具体实施方式】
[0024]实施例1转OsXRM水稻的获得与抗RSV功能分析 本发明所转水稻品种为日本睛。
[0025]1.重组农杆菌的获得
1)0sXrn4的克隆
本发明通过与已报道的拟南芥的AtXrn4序列进行Blast分析，获得水稻0sXrn4基因序列，同源性达95%以上，以此序列设计引物，获取基因全长。引物序列如下:
RXRN4 f: 5’ -CCGAGACTCCGAGAGAGATTAG-3，
RXRN4 r: 5’ -GCTTACACATTTACAATGGCCG-3’
2)载体构建
分析全序列0sXrn4酶切位点及双元表达载体pCV_GFP_2N的多克隆位点，设计引物。构建完成的载体图谱如图1显示。引物序列如下:
【权利要求】
1.水稻基因，其特征在于:该基因的核苷酸序列为SEQID N0:1所示。
2.包含权利要求1所述的基因的植物表达载体。
3.宿主细胞,其特征在于:该宿主细胞由权利要求2所述的植物表达载体转化。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于:转化菌株为农杆菌菌株EHA105。
5.植物受体细胞或组织，其特征在于:该植物受体细胞或组织采用权利要求3或4所述的宿主细胞转化获得。
6.根据权利要求1所述的水稻基因的用途，其特征在于:该基因用于制备转基因抗病毒植物体。
7.根据权利要求6所述的水稻基因的用途，其特征在于:该基因用于制备抗水稻条纹叶枯病毒(沿stripe Firw1S)的水稻或抗烟草花叶病毒(TbAacco ifosaic Virus)的烟草。
8.ー种采用权利要求1所述的水稻基因制备重组农杆菌的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤: 1)水稻0sXrn4基因的克隆 通过与已报道的拟南芥的AtXrn4序列进行Blast分析，获得水稻0sXrn4基因序列，同源性达95%以上，以此序列设计引物，获取基因全长，水稻0sXrn4基因的核苷酸序列为SEQID NO:1所示;引物序列如下:
RXRN4 f: 5’ -CCGAGACT CCGAGAGAGATTAG-3'
RXRN4 r: 5’ -GCTTACACATTTACAATGGCCG-3’ ； 2)载体构建 分析全序列水稻0sXrn4基因酶切位点及双元表达载体pCV_GFP_2N的多克隆位点，设计引物，构建载体；引物序列如下:
RXlf: 5’ -TCTAGAATGGGAGTCCCGGCGTTCTACC-3，，
RXlr: 5’ -TCTAGACCTCTGCTGATTCAT-3’，
RX3f: 5’ -GGATCCTAGGATGGCCATGGATA-3’，
RX3r: 5’ -GAGCTCTCACTCACTCAGGCCATTGG-3’ ； 3)转化农杆菌 取-70で保存的EHA105农杆菌感受态，置冰上融解；取I Ul抽纯0sXrn4-Pcv-2N质粒加入到100 u I感受态中，混匀，加入到处理好的电击杯；设置2.2V电压，电击转化；点击完成加入900 的YEP液体培养基；28 °C, 200 rpm摇床培养2 h，菌液涂布在含50 Ug/ml卡那霉素和100 u g/ml利福平平板上，28で培养至形成单菌落。
9.ー种抗水稻条纹叶枯病毒(/Pice stripe的水稻的制备方法,其特征在于该方法采用利要求3所述的宿主细胞对水稻成熟胚进行的遗传转化获得。
10.一种抗烟草花叶病毒(Tb如cco Mosaic KZrw1S)的烟草的制备方法,其特征在于该方法采用利要求3所述的宿主细胞对烟草叶盘法进行遗传转化获得。
【文档编号】C12N15/55GK103497958SQ201310442714
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】燕飞, 姜珊珊, 姜良良, 杨健, 鲁宇文, 郑红英, 林林, 程晔, 陈剑平 申请人:浙江省农业科学院