一种土贝母药材UPLC特征图谱的构建方法及其成分含量测定方法与流程

本发明属于中药鉴别领域，具体涉及一种土贝母药材uplc特征图谱的构建方法及其成分含量测定方法。

背景技术：

土贝母俗称野瓜蒌，也称假贝母、草贝母、地苦胆等，原载于清代赵氏所编的《本草纲目拾遗》，2015年版《中国药典》规定土贝母为葫芦科植物土贝母的干燥块茎，广泛分布于河北、山西、山东、河南、湖北、湖南等地。文献报道，目前从土贝母中分离得到多种皂苷类、甾醇及其苷类、酯类、生物碱、黄酮类等成分，其中皂苷类为土贝母的主要活性成分。现代药理研究表明，土贝母具有抗炎、消肿、抗病毒、抗白血病、免疫抑制和杀精作用等。

2015年版《中国药典》仅以土贝母苷甲作为含量测定指标，由于中药有效成分多样性及复杂性，单一成分的含量测定难以全面反映药材的内在质量，且亦缺乏专属性。中药指纹/特征图谱能够提供更为全面、丰富的信息，因此常用于中药材的质量控制研究；一测多评法是借助相对校正因子，只需测定1个成分（内参物）即可实现对多个成分的含量测定，鉴于大多中药对照品制备困难，价格昂贵，或易于分解等因素难以获得，一测多评法能有效解决以上难题，在中药成分分析中逐渐得以广泛应用。目前文献关于土贝母的指纹/特征图谱和含量测定研究均采用高效液相色谱法（hplc法），该方法用时时间长，灵敏度低、分离能力有限，已经不能很好的解决复杂中药分析过程中的实际问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种土贝母药材uplc特征图谱构建方法及其成分含量测定方法，采用外标法计算出了土贝母苷甲的含量，再通过一测多评法计算土贝母苷乙、土贝母苷丙的含量，该方法快速、稳定且专属性强，能够更全面的反映土贝母药材的特征和质量，为土贝母药材质量控制提供科学的新方法。

本发明所要解决的上述技术问题，通过如下技术方案予以实现：

一种土贝母药材uplc特征图谱的构建方法，包含如下步骤：

（1）精密称取土贝母药材粉末，制备得到土贝母药材供试品溶液；

（2）将土贝母药材供试品溶液采用超高效液相色谱仪分析，得到土贝母药材uplc特征图谱。

作为一种优选方案，所述超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：采用规格为2.1×100mm，1.6μm的waterscortecst3色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.05~0.15%的磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗脱，柱温为20~40℃；流速为0.2~0.4ml/min；检测波长为180~220nm，进样量为0.5~1.5µl。

作为一种优选方案，所述梯度洗脱条件为：0~4min，流动相a的体积分数变化为5%~11%，流动相b的体积分数为95%~89%；4~7min，流动相a的体积分数变化为11%~20%，流动相b的体积分数变化为89%~80%；7~21min，流动相a的体积分数变化为20%~28%，流动相b的体积分数变化为80%~72%；21~30min，流动相a的体积分数变化为28%~32%，流动相b的体积分数变化为72%~68%；30~33min，流动相a的体积分数变化为32%~35%，流动相b的体积分数变化为68%~65%；33~38min，流动相a的体积分数为35%，流动相b的体积分数为65%。

作为一种优选方案，所述的供试品溶液的制备方法为：取土贝母药材粉末0.4~0.6g，精密称定，精密加入40~60%乙醇20~30ml，称定重量，超声处理20~40分钟，放冷，再称定重量，用40~60%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

本发明还提供了一种土贝母药材的成分含量测定方法，包括如下步骤：

（1）分别吸取对照品溶液和待测土贝母药材样品溶液注入超高效液相色谱仪，测定相应峰面积；

（2）通过外标法计算土贝母苷甲的含量；

（3）再通过一测多评法计算土贝母苷乙、土贝母苷丙的含量。

作为一种优选方案，所述对照品溶液的制备方法为：取土贝母苷甲、土贝母苷乙及土贝母苷丙对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含土贝母苷甲80~120μg、土贝母苷乙40~60μg、土贝母苷丙60~100μg的对照品溶液。

作为一种优选方案，所述待测土贝母药材样品溶液的制备方法为：取土贝母药材粉末0.4~0.6g，精密称定，精密加入40~60%乙醇20~30ml，称定重量，超声处理20~40分钟，放冷，再称定重量，用40~60%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

作为一种优选方案，所述超高效液相色谱仪分析的色谱条件为:采用规格为2.1×100mm，1.6μm的waterscortecst3色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.05~0.15%的磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗脱，柱温为20~40℃；流速为0.2~0.4ml/min；检测波长为180~220nm，进样量为0.5~1.5µl。

作为一种优选方案，所述梯度洗脱条件为：：0~4min，流动相a的体积分数变化为5%~11%，流动相b的体积分数为95%~89%；4~7min，流动相a的体积分数变化为11%~20%，流动相b的体积分数变化为89%~80%；7~21min，流动相a的体积分数变化为20%~28%，流动相b的体积分数变化为80%~72%；21~30min，流动相a的体积分数变化为28%~32%，流动相b的体积分数变化为72%~68%；30~33min，流动相a的体积分数变化为32%~35%，流动相b的体积分数变化为68%~65%；33~38min，流动相a的体积分数为35%，流动相b的体积分数为65%。

土贝母药材uplc特征图谱的构建方法或土贝母药材的成分含量测定方法在检测和鉴别土贝母药材中的应用。

有益效果：（1）本发明构建了土贝母药材的uplc特征图谱，确定了4个共有峰，对4个共有峰进行化学成分的指认，确定峰2为土贝母苷乙，峰3为土贝母苷丙，峰4为土贝母苷甲，所构建的uplc特征图谱，充分反应样品的特征峰信息，展示了土贝母药材的化学成分特征；（2）本发明构建出的土贝母uplc特征图谱可以用来定性检测样品是否为土贝母药材，具有一定的特征性，且方法稳定，精密度高，重现性较好；（3）本发明通过构建土贝母药材的uplc特征图谱，测定峰面积，采用外标法计算出土贝母苷甲的含量，再通过一测多评计算出土贝母苷乙、土贝母苷丙的含量，并确立了土贝母的质量标准，即土贝母苷甲的含量应大于1%，土贝母苷甲、乙、丙的总含量应在2.65%~3.64%之间，从根本上快速、准确地对土贝母进行定量定性分析，具有一定的特征性，并通过外标法计算出所有成分的含量，验证本发明一测多评和外标法测定结果无明显差异；（4）本发明所述的一测多评法只需测定一个成分的含量，即可以该成分为内参物，计算出其它的相对校正因子，即可实现多个成分同时测定，可以有效解决质量分析过程中由于对照品短缺带来的困难；（5）本发明所述的方法快速、稳定且专属性强，基线平稳，为土贝母药材质量控制提供科学的新方法。

附图说明

图1为土贝母苷甲、土贝母苷乙、土贝母苷丙以及土贝母药材样品色谱图。

图2为供试品溶液与土贝母苷甲对照品溶液uv图。

图3为供试品溶液与土贝母苷乙对照品溶液uv图。

图4为供试品溶液与土贝母苷丙对照品溶液uv图。

图5为19批土贝母药材的uplc特征图谱叠加图。

图6为土贝母药材对照uplc特征图谱。

图7为土贝母苷甲、乙、丙含量测定色谱图。

图8为待鉴别土贝母药材uplc特征图谱。

图中标记：确定峰2为土贝母苷乙，峰3为土贝母苷丙，峰4为土贝母苷甲。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所用到的仪器、试剂与对照品信息以及土贝母药材来源：

表1仪器信息汇总表

表2试剂信息汇总表

表3对照品信息

表419批土贝母药材产地信息表

实施例1

土贝母药材uplc特征图谱的构建方法

1.超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：采用规格为2.1×100mm，1.6μm的waterscortecst3色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.1%的磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗脱，柱温为30℃；流速为0.3ml/min；检测波长为203nm，进样量为1µl。

2.梯度洗脱条件为：0~4min，流动相a的体积分数变化为5%~11%，流动相b的体积分数为95%~89%；4~7min，流动相a的体积分数变化为11%~20%，流动相b的体积分数变化为89%~80%；7~21min，流动相a的体积分数变化为20%~28%，流动相b的体积分数变化为80%~72%；21~30min，流动相a的体积分数变化为28%~32%，流动相b的体积分数变化为72%~68%；30~33min，流动相a的体积分数变化为32%~35%，流动相b的体积分数变化为68%~65%；33~38min，流动相a的体积分数为35%，流动相b的体积分数为65%。

3.供试品溶液的制备方法为：取土贝母药材粉末0.5g，精密称定，精密加入50%乙醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4.对照品溶液的制备：取土贝母苷甲、土贝母苷乙及土贝母苷丙对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含土贝母苷甲100μg、土贝母苷乙50μg、土贝母苷丙80μg的混合对照品溶液。

5.土贝母药材特征图谱的方法学考察：

5.1精密度试验：取供试品溶液，在规定色谱条件下连续进样6次，以土贝母苷甲峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积rsd均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

5.2重复性试验：取同批次药材粉末6份，制备供试品溶液，在规定色谱条件下测定，以土贝母苷甲峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积rsd均小于2.0%，表明该方法重复性良好。

5.3稳定性试验：取供试品溶液，在规定色谱条件下分别在0、2、4、6、8、12、24小时进行分析，以土贝母苷甲峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积rsd均小于2.0%，说明供试品溶液在24小时内稳定性良好。

6.土贝母药材特征图谱的确定

6.1峰指认：分别取土贝母苷甲、土贝母苷乙及土贝母苷丙对照品于不同容量瓶，精密称定，加甲醇制成每1ml含土贝母苷甲100μg、土贝母苷乙100μg、土贝母苷丙100μg的对照品溶液。取供试品溶液和上述3个对照品溶液，在规定色谱条件下进行测定，并开启紫外3d扫描，将对照品溶液与供试品溶液的保留时间及uv吸收光谱进行比对，对土贝母药材特征图谱中各色谱峰进行指认。结果见图1-4，从土贝母药材特征图谱中能找到与土贝母苷甲、土贝母苷乙、土贝母苷丙保留时间一致的特征峰，且uv吸收光谱一致，确定峰2为土贝母苷乙，峰3为土贝母苷丙，峰4为土贝母苷甲。

6.2样品测定：取表4中19批土贝母药材，制备成供试品溶液，在规定的色谱条件下，获得19批土贝母药材uplc特征图谱并对其进行分析，以4号峰土贝母苷甲峰为参照峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表5和表6。

表519批土贝母药材特征图谱各特征峰的相对保留时间

表619批土贝母药材特征图谱各特征峰的相对峰面积

结果分析与讨论：选择分离度较好，色谱峰较纯的共有峰为土贝母药材特征图谱的特征峰，结果共标定了4个特征峰。以峰3为参照峰s峰，19批土贝母药材其余3个特征峰相对于s峰的相对保留时间rsd值在0.135%~3.056%范围内，均小于5.0%，19批土贝母药材其余3个特征峰相对于s峰的相对峰面积rsd值在9.231%~46.474%范围内，结果表明不同产地的土贝母药材各特征峰所代表的化学成分差异较大；其中峰1的相对峰面积范围为0.106~2.395，峰2相对峰面积范围为0.198~0.269，峰3相对峰面积范围为0.329~0.506。

因此，根据19批次不同产地土贝母药材的4个特征峰与峰4的相对峰面积波动范围，考虑19批次不同产地样品的代表性，取各特征峰相对峰面积最低、最高值，规定3个特征峰的相对峰面积范围。即：以土贝母苷甲参照物峰相应的峰3为s峰，计算各特征峰与s峰的相对峰面积，其相对峰面积应在规定范围内，规定范围为0.106~2.395（峰1）、0.198~0.269（峰2）、0.329~0.506（峰3）。

6.3土贝母药材特征图谱相似度评价

将19批土贝母药材粉末，制备供试品溶液；在规定色谱条件下进行测定，记录色谱图。将19批药材特征图谱cdf格式导入“中药色谱特征图谱相似度评价系统”（2012版）软件中，以批号为g1902024样品的特征图谱为参照图谱，以2号峰为mark峰进行保留时间校正，并进行全峰匹配，19批土贝母药材特征图谱叠加图见图5，以平均数法生成土贝母药材对照特征图谱，见图6。对19批土贝母药材进行相似度评价，结果见表7。

表719批土贝母药材相似度评价

结果分析与讨论：19批样品中，有两批（g1902024和g1903048）的相似度低于0.95，其余17批样品特征图谱相似度均在0.95以上，相似度较高，质量差异不大。从谱图进行分析，两批相似度低于0.95的样品与其余17批的差异主要表现在峰1的峰高或峰面积与其他批次差异明显，其中土贝母药材g1902024的峰高明显低于其余批次，而土贝母药材g1903048的峰高明显高于其他批次，根据19批样品的测定结果，规定按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，土贝母药材供试品特征图谱与对照特征图谱的相似度不低于0.90。

实施例2

土贝母药材成分含量测定方法

1.超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：采用规格为2.1×100mm，1.6μm的waterscortecst3色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.1%的磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗脱，柱温为30℃；流速为0.3ml/min；检测波长为203nm，进样量为1µl。

2.梯度洗脱条件为：0~4min，流动相a的体积分数变化为5%~11%，流动相b的体积分数为95%~89%；4~7min，流动相a的体积分数变化为11%~20%，流动相b的体积分数变化为89%~80%；7~21min，流动相a的体积分数变化为20%~28%，流动相b的体积分数变化为80%~72%；21~30min，流动相a的体积分数变化为28%~32%，流动相b的体积分数变化为72%~68%；30~33min，流动相a的体积分数变化为32%~35%，流动相b的体积分数变化为68%~65%；33~38min，流动相a的体积分数为35%，流动相b的体积分数为65%。

3.待测土贝母药材样品溶液的制备方法为：取土贝母药材粉末0.5g，精密称定，精密加入50%乙醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4.对照品溶液的制备：取土贝母苷甲、土贝母苷乙及土贝母苷丙对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含土贝母苷甲100μg、土贝母苷乙50μg、土贝母苷丙80μg的混合对照品溶液。

5方法学考察

5.1线性关系考察：取土贝母苷甲、土贝母苷乙及土贝母苷丙对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含土贝母苷甲3.758mg、土贝母苷乙0.971mg、土贝母苷丙1.574mg的对照品储备液。取上述对照品储备液，依次稀释至不同的浓度，在规定色谱条件下进样测定，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标进行线性回归，所得标准曲线以及线性范围如表8所示。

表83种成分的线性回归方程及范围

5.2精密度试验：取待测样品溶液，在规定色谱条件下连续进样6次，计算土贝母苷甲、乙、丙的峰面积rsd值分别为0.37%、0.59%、0.29%，表明仪器精密度良好。

5.3稳定性试验：取待测样品溶液，在规定色谱条件下分别在0、2、4、6、8、12、24小时测定，计算土贝母苷甲、乙、丙峰面积rsd值，分别为0.91%、1.15%、1.18%，表明待测样品溶液在24小时内稳定性良好。

5.4重复性试验：取同批次药材粉末6份，制备6份待测样品溶液，按，在规定色谱条件下进样测定，计算土贝母苷甲、乙、丙的含量rsd值，结果见表9。

表93种成分的重复性结果

实验结果表明，土贝母苷甲、乙、丙的含量均值为18.820mg/g，4.754mg/g和7.718mg/g，rsd值分别为0.66%、1.03%和1.03%，该方法重复性良好。

5.5加样回收率测定：取土贝母药材粉末0.25g，精密称定，按样品与对照品土贝母苷甲、乙、丙的含量比为1:0.5，1:1及1:1.5的比例加入土贝母苷甲、乙、丙对照品，每种比例平行3份，制备9份待测样品溶液，在规定色谱条件下进样测定，计算3种成分的回收率范围及rsd值，结果见表10。

表103种成分的加样回收率结果

实验结果表明，土贝母苷甲、乙、丙的加样回收率范围分别是94.04%～104.70%、95.74%～104.87%、97.19%～107.73%，rsd值均小于4.0%，表明该分析方法准确度良好。

6.相对校正因子(f)的计算：以土贝母苷甲作为内标物，按照公式其中as为内标物s的对照品峰面积，cs为内标物s的对照品浓度，ai为其他成分i的对照品峰面积，ci为其他成分i的对照品浓度。根据线性考察结果，以对照品的浓度及其对应的色谱峰面积，计算内标物土贝母苷甲与土贝母苷乙、土贝母苷丙的相对校正因子。结果见表11。

表112种成分的相对校正因子

实验结果表明，土贝母苷乙、土贝母苷丙的平均相对校正因子分别为1.140和1.259，rsd值分别为1.22%和2.05%。土贝母苷甲、乙、丙含量测定色谱图见图7。

7.耐用性考察：精密吸取混合对照品溶液1μl，在规定色谱条件下进样测定，分别考察watersh-class、thermosvanquish、agilent1290infinity3种超高效液相色谱仪和waterscortecst3（2.1mm×100mm，1.6μm）色谱柱、watershsst3色谱柱（2.1mm×100mm，1.8μm）、watersbehc18色谱柱（2.1mm×100mm，1.7μm）3种不同色谱柱，以及不同柱温和流速对土贝母苷乙和土贝母苷丙的相对校正因子的影响。结果见表12。

表12不同色谱条件的相对校正因子

实验结果表明，不同色谱条件的相对校正因子的rsd均小于2.0%，不同色谱仪和色谱柱及不同柱温和流速对相对校正因子无显著影响。

8.色谱峰定位：根据上述耐用性考察结果，以土贝母苷甲峰为参照峰，计算土贝母苷丙、土贝母苷乙相对于参照峰的相对保留时间，结果见表13。

表13不同色谱条件的相对保留时间

实验结果表明，土贝母苷乙和土贝母苷丙的相对保留时间均值分别是0.735和0.771，且rsd均小于3.0%，表明不同色谱仪和色谱柱及不同柱温和流速对相对保留时间无显著影响。因此，以土贝母苷甲对照品为参照峰s，计算土贝母苷乙、土贝母苷丙与s峰的相对保留时间，土贝母苷乙的相对保留时间应在0.735±10%范围内，土贝母苷丙的相对保时间应在0.771±10%的范围内。

9、一测多评法与外标法测定结果的比较

精密称取19批土贝母药材粉末，制备成待测样品溶液，在规定得到的色谱条件下进样测定，分别采用外标法（esm）和一测多评法（qams）计算19批土贝母药材土贝母苷乙和土贝母苷丙的含量，并计算两种测定法的相对偏差，结果见表14。

表1419批土贝母药材含量测定结果

结果分析与讨论：两种方法测定的土贝母苷乙含量相对偏差在0.88%~3.70%范围内，土贝母苷丙含量相对偏差在0.59%~4.35%范围内，均小于5.0%，说明一测多评法与外标法测定结果无明显差异，一测多评法结果可靠，能准确测定3种成分的含量，能替代外标法对土贝母药材进行含量控制。19批土贝母药材土贝母苷甲的含量均大于1.0%，符合2015年版《中国药典》含量限度的要求；19批土贝母药材3种有效成分的总量在2.65%~3.64%之间，可作为土贝母药材的质量评价标准。

实施例3

利用uplc特征图谱鉴别土贝母药材。

土贝母药材为随机在市场上购买的药材。

1.超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：采用规格为2.1×100mm，1.6μm的waterscortecst3色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.1%的磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗脱，柱温为30℃；流速为0.3ml/min；检测波长为203nm，进样量为1µl。

2.梯度洗脱条件为：0~4min，流动相a的体积分数变化为5%~11%，流动相b的体积分数为95%~89%；4~7min，流动相a的体积分数变化为11%~20%，流动相b的体积分数变化为89%~80%；7~21min，流动相a的体积分数变化为20%~28%，流动相b的体积分数变化为80%~72%；21~30min，流动相a的体积分数变化为28%~32%，流动相b的体积分数变化为72%~68%；30~33min，流动相a的体积分数变化为32%~35%，流动相b的体积分数变化为68%~65%；33~38min，流动相a的体积分数为35%，流动相b的体积分数为65%。

3.待鉴别土贝母药材样品溶液的制备方法为：取土贝母药材粉末0.5g，精密称定，精密加入50%乙醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4.对照品溶液的制备：取土贝母苷甲对照品，加甲醇制成每1ml含土贝母苷甲100μg的对照品溶液。

5.分别精密吸取对照品溶液和待鉴别土贝母药材样品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

6.测定结果：将待鉴别的土贝母药材样品特征图谱(图8)与土贝母药材对照特征图谱(图6)进行比较：待鉴别土贝母药材能检出4个特征峰，并与土贝母药材对照特征图谱中的4个特征峰相对应；数据结果显示（表15），该样品的4个特征峰的相对保留时间和相对峰面积范围均在标准规定的范围内，该待鉴别样品为土贝母药材。

表15土贝母草药材各特征峰相对保留时间和相对峰面积规定范围

实施例4

利用土贝母药材成分含量测定方法测定土贝母药材中土贝母苷甲、土贝母苷乙、土贝母苷丙的含量。

土贝母药材为随机在市场上购买的药材。

1.超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：采用规格为2.1×100mm，1.6μm的waterscortecst3色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.1%的磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗脱，柱温为30℃；流速为0.3ml/min；检测波长为203nm，进样量为1µl。

2.梯度洗脱条件为：0~4min，流动相a的体积分数变化为5%~11%，流动相b的体积分数为95%~89%；4~7min，流动相a的体积分数变化为11%~20%，流动相b的体积分数变化为89%~80%；7~21min，流动相a的体积分数变化为20%~28%，流动相b的体积分数变化为80%~72%；21~30min，流动相a的体积分数变化为28%~32%，流动相b的体积分数变化为72%~68%；30~33min，流动相a的体积分数变化为32%~35%，流动相b的体积分数变化为68%~65%；33~38min，流动相a的体积分数为35%，流动相b的体积分数为65%。

3.待测土贝母药材样品溶液的制备方法为：取土贝母药材粉末0.5g，精密称定，精密加入50%乙醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4.对照品溶液的制备：取土贝母苷甲、土贝母苷乙及土贝母苷丙对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含土贝母苷甲100μg、土贝母苷乙50μg、土贝母苷丙80μg的混合对照品溶液。

5.测定：分别精密吸取参照物溶液和待测土贝母药材样品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定相应峰面积，通过外标法算出土贝母苷甲的含量，再通过一测多评法算出土贝母苷乙、土贝母苷丙的含量；另外，用外标法算出土贝母苷乙、土贝母苷丙的含量验证可靠性。

6.测定结果见表16和17。

表16土贝母苷乙和丙的相对保留时间

表17采用一测多评法和外标法测定的土贝母苷甲、乙、丙的含量

结果显示，土贝母苷乙和丙的相对保留时间均在规定的范围内，一测多评的测定结果与外标法测定无明显差异，说明该方法较可靠；

土贝母苷甲含量为1.57%大于1.0%，符合2015年版《中国药典》含量限度的要求；土贝母药材中3种有效成分的总量为2.87%，在2.65%~3.64%之间，为合格的土贝母药材。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。