一种基于电子转移抑制策略的光电化学检测酸性磷酸酶的方法与流程

本发明涉及临床诊断中间信息获取方法，具体涉及一种基于电子转移抑制策略的光电化学检测酸性磷酸酶的方法。

背景技术：

酸性磷酸酶是哺乳动物组织和体液中的一种常见水解酶，可以催化磷酸单酯的水解。酸性磷酸酶在体内的异常表达可能预示着诸如前列腺癌、高雪氏病、甲状旁腺功能亢进以及多发性骨髓瘤等疾病的发生。因此酸性磷酸酶作为特征的生物标志物可用于相关疾病的临床早期诊断。

光电化学法的原理是通过光作为激发源，使得光敏材料产生激发电子而产生光电流。由于其激发信号和检测信号的完全分离而具有相对较高的灵敏度和较低的背景，作为一种测试技术已引起越来越多的研究人员的兴趣(chem.rev.,2014,114,7421)。在现有技术下，电子转移抑制策略是基于电极表面原位产生不溶性产物，产生绝缘作用以阻止电极界面上的光敏材料和电子供体之间的电子传输，改变了光电流信号，从而提高了光电化学法检测的灵敏度(anal.chem.,2018,90,11478)。然而，传统的酶促生物催化沉淀法构建的传感器性能通常不够稳定，重现性不好，难以准确检测低含量生物物质。另外，所构建的传感器也无法进行有效再生。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种准确可靠、灵敏度高、步骤简单的基于电子转移抑制策略的光电化学检测酸性磷酸酶的方法。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：

一种基于电子转移抑制策略的光电化学检测酸性磷酸酶的方法，包括：

s1：制备3,5-二氨基-1,2,4-三唑重氮盐溶液；

s2：通过电解氧化制备二氧化钛纳米管阵列，在二氧化钛纳米管阵列上原位合成类石墨氮化碳，得tna/g-c3n4；

s3：使用三电极系统进行电化学接枝3,5-二氨基-1,2,4-三唑重氮盐到tna/g-c3n4电极表面，其中tna/g-c3n4为工作电极，铂片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，以3,5-二氨基-1,2,4-三唑重氮盐溶液为电解质溶液，在一定的电位窗口范围内通过循环伏安法进行扫描若干个循环，得到tna/g-c3n4/dat传感器；

s4：首先测量可见光照射下tna/g-c3n4/dat的光电流，记为i0；将tna/g-c3n4/dat浸入若干组tris-hcl缓冲溶液中，各组tris-hcl缓冲溶液中含有一定浓度的fe(iii)、抗坏血酸2-磷酸酯和一定浓度的酸性磷酸酶，平衡一段时间，可见光照射，测得光电流值为i；传感器的光电流变化值△i＝i-i0，根据△i与酸性磷酸酶的浓度c的变化关系获得线性回归方程为△i＝0.767c(ul^-1)+1.595，0.05ul^-1≤c≤100ul^-1；

s5：首先测量可见光照射下tna/g-c3n4/dat的光电流，记为i0；将tna/g-c3n4/dat浸入tris-hcl缓冲溶液中，tris-hcl缓冲溶液中含有一定浓度的fe(iii)、抗坏血酸2-磷酸酯和未知浓度的酸性磷酸酶，平衡一段时间，可见光照射，测得光电流值为i；传感器的光电流变化值△i＝i-i0，将△i代入步骤s4中的线性方程计算出待测酸性磷酸酶的浓度。

进一步的，所述s1具体包括：

配制3,5-二氨基-1,2,4-三唑的0.2m盐酸溶液，并通干燥氮气一段时间，然后在饱和氮气氛下将一定体积的亚硝酸钠溶液加入到3,5-二氨基-1,2,4-三唑盐酸溶液中，冰水浴中搅拌一段时间，生成3,5-二氨基-1,2,4-三唑重氮盐溶液。

进一步的，所述的亚硝酸钠溶液与所述3,5-二氨基-1,2,4-三唑盐酸溶液的体积比为1：50。

进一步的，所述s2具体包括：通过电解氧化制备二氧化钛纳米管阵列，将二氧化钛纳米管阵列浸渍在一定浓度的尿素溶液中，静止保持一定时间，取出晾干，置于坩埚中并放入高温炉，盖上坩埚盖，升温至煅烧温度煅烧一段时间，得tna/g-c3n4。

进一步的，所述尿素溶液的浓度为10wt％，二氧化钛纳米管阵列在尿素溶液中静止时间为8小时，高温炉的升温速率为3℃min^-1，煅烧温度为550℃，煅烧时间为3小时。

进一步的，所述步骤s3中，循环伏安法的电位窗口范围为-0.8至+0.6v，扫描速率为10mvs^-1，循环次数为15次。

进一步的，所述步骤s4和s5中，tris-hcl缓冲溶液中fe(iii)和抗坏血酸2-磷酸酯的浓度分别为0.5μm和1.0μm。

进一步的，还包括步骤s6：将一次检测完毕的tna/g-c3n4/dat/fe(ii)浸入含有配位剂的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，室温下放置一段时间，使传感器获得再生。

进一步的，所述步骤s6具体包括：将一次检测完毕的tna/g-c3n4/dat/fe(ii)浸入含有邻二氮菲的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，室温下放置一段时间，使传感器获得再生。

进一步的，所述醋酸-醋酸钠缓冲溶液的浓度为0.1m，ph＝4.0，邻二氮菲的浓度为10mm，室温下放置时间为30分钟。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明的方法是一种新型的基于电子转移抑制策略的光电化学检测酸性磷酸酶的方法，与现有检测技术相比，操作简便，选择性好，灵敏度高，准确度好，构建的传感器稳定性更好，而且通过再生可反复使用，有效地降低了经济成本和时间成本，可实现规模化生产和快速获取酸性磷酸酶的含量以便于临床快速诊断。

附图说明

图1是tna/g-c3n4/dat传感器的表面形貌sem图；

图2是tna/g-c3n4/dat传感器的光电流变化值对酸性磷酸酶浓度的线性关系图；

图3是经过重复再生使用的tna/g-c3n4/dat传感器的稳定性图；

图4是tna/g-c3n4/dat传感器对酸性磷酸酶检测的选择性图。

具体实施方式：

下面将结合附图和具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例：

一种基于电子转移抑制策略的光电化学检测酸性磷酸酶的方法，包括以下步骤：

(1)3,5-二氨基-1,2,4-三唑重氮盐溶液的制备

配制2.0mm3,5-二氨基-1,2,4-三唑(dat)的0.2m盐酸溶液3.0ml，通干燥氮气30分钟，然后在饱和氮气氛下将50μl浓度为0.5m的亚硝酸钠溶液加入到上述dat溶液中，冰水浴中搅拌30分钟，生成dat重氮盐溶液。

(2)tna/g-c3n4的制备

二氧化钛纳米管阵列(tna)通过电解氧化技术制得，具体为，以钛片为阳极，铂片为阴极，含有0.5wt％氟化铵和20wt％水的丙三醇溶液作为电解液，电解电位20v，电解时间4小时，电解完毕后用水清洗钛片，并在氮气氛下吹干，将制得的tna浸渍在浓度为10wt％的尿素溶液中，静止保持8小时，取出晾干，置于坩埚中并放入高温炉，盖上坩埚盖，以3℃min^-1的升温速率将高温炉温度升至550℃，并保持3小时，可在tna上原位合成类石墨氮化碳(g-c3n4)。

(3)tna/g-c3n4/dat传感器的构建

使用常规的三电极系统进行电化学接枝dat重氮盐到tna/g-c3n4电极表面，其中tna/g-c3n4为工作电极，铂片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。直接以上述制得的dat重氮盐溶液作为电解质溶液，扫描速率为10mvs^-1，在-0.8至+0.6v的电位窗口范围内通过循环伏安法进行扫描15个循环，用水洗净，晾干，得到tna/g-c3n4/dat传感器。具体的传感器表面形貌如图1所示。

(4)光电化学法检测测定酸性磷酸酶

首先测量可见光照射下tna/g-c3n4/dat的光电流，记为i0。然后，将tna/g-c3n4/dat浸入若干组0.5ml的10mmtris-hcl缓冲溶液(ph5.0)中，各组溶液中含有0.5μmfe(iii)、1.0μm抗坏血酸2-磷酸酯和不同的浓度的酸性磷酸酶，平衡15分钟，可见光照射，测得光电流值为i。结果如图2所示，传感器光电流的增加值与酸性磷酸酶的浓度0.05ul^-1至100ul^-1范围内呈现良好的线性关系，线性回归方程为△i＝0.767c(ul^-1)+1.595(r²＝0.9977)，检测限达0.016ul^-1。

(5)根据传感器的光电流变化值(△i＝i-i0)确定待测酸性磷酸酶的含量

采用步骤4同样的方法，首先测量可见光照射下tna/g-c3n4/dat的光电流，记为i0。然后，将tna/g-c3n4/dat浸入0.5ml的10mmtris-hcl缓冲溶液(ph5.0)中，各组溶液中含有0.5μmfe(iii)、1.0μm抗坏血酸2-磷酸酯和待测浓度的酸性磷酸酶，平衡15分钟，可见光照射，测得光电流值为i；传感器的光电流变化值△i＝i-i0，将△i代入步骤4中的线性方程计算出待测酸性磷酸酶的浓度。

(6)tna/g-c3n4/dat传感器的再生

将一次检测完毕的tna/g-c3n4/dat/fe(ii)浸入含有10mm邻二氮菲的0.1m醋酸-醋酸钠(ph＝4.0)缓冲溶液中，室温下放置30分钟，取出，水洗净，该传感器可获得再生。如图3所示，经过重复再生的传感器具有较高的稳定性，经过15次的重复使用，可保持其原始性能的96％。

实验可知，本发明所建立的基于电子转移抑制策略的光电化学检测酸性磷酸酶的方法的重现性也很好，对于单个传感器10次连续测量相对标准偏差(rsd)为5.2％，多个传感器(6个)平行分析的rsd为7.1％。另外，本发明还考察了基于电子转移抑制策略的光电化学法对于检测酸性磷酸酶的特异性，如图4所示，当分别对浓度分别均为1000ul^-1的葡萄糖氧化酶(god,b)，辣根过氧化物酶(hrp,c)，胰蛋白酶(try,d)，溶菌酶(lzm,e)，酪氨酸酶(tyr,f)和碱性磷酸酶(alp,g)进行检测,所显示的光电流信号与空白溶液(a)相差不大。而当检测50ul^-1的酸性磷酸酶(acp,h)时，光电流信号有明显的增加，这说明了酸性磷酸酶对对抗坏血酸2-磷酸酯的特异性催化性能以及所构建的传感器对酸性磷酸酶检测的高选择性。