一种凤仙花药材中2-甲氧基-1,4-萘醌的含量检测方法与流程

本发明属于药物分析技术领域，涉及一种凤仙花药材中2-甲氧基-1,4-萘醌的含量检测方法。

凤仙花，为凤仙花科植物凤仙花impatiensbalsaminal.的全草。凤仙花主要含黄酮醇类及萘醌衍生物，如2-甲氧基-1,4-萘醌、山奈酚-3-鼠李糖基双葡萄糖苷、2-羟基-1,4-萘酚等,凤仙花的根含有指甲醌(lawsone)、2-甲氧基-1,4-萘醌(2-methoxy-1,4-naphtho-quinone)、东莨菪素、异嗪皮啶，菠菜甾醇(spinasterol等,具有抗真菌、抗过敏、抗炎镇痛、促皮透析等作用,其中2-甲氧基-1,4-萘醌(2-methoxy-1,naphtho4-quinone)为其主要的抗真菌成分。

姜洪芳，石宝俊，张峰伦，等.江苏农业科学2014年第42卷第12期，高效液相色谱法同时测定凤仙花中的萘醌类和黄酮类成分[j].江苏农业科学，2014，42(12):344－346.doi:10.15889/j.issn.1002－1302.2014.12.117，该方案公开了利用反相高效液相色谱，测定不同花色单瓣凤仙花和多重瓣茶凤仙茎、叶、花中指甲花醌、槲皮素、2－甲氧基－1，4萘醌、山奈酚含量。具体方法：hplc分析条件：agilenteclipsexdb－c18分离柱(4.6mm×150mm,5μm)；流动相为乙腈－2.5％醋酸水，梯度洗脱条件:0～10min，25:75；10～20min，32:68；20～35min，25:75，流速1.0ml/min，进样量20μl，柱温为25℃，dad检测器，检测波长245、250、280、360nm。对照品溶液的制备：分别称取指甲花醌、2－甲氧基－1，4萘醌、槲皮素、山奈酚对照品10mg，精确称定，甲醇溶解并定容，稀释成浓度为50、40、25、12.5、10、6.25、3.12μg/ml的溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，供hplc测定，并绘制每种物质的标准曲线。供试品溶液的制备：称取样品粉末(50℃烘干12h，磨碎过40目筛)5.0g，精确称定，加入55％乙醇水溶液80ml，室温浸泡2h，超声提取1h，定容至100ml,滤液经0.45μm的微孔滤膜过滤，供hplc测定。

上述技术方案流动相采用乙腈－2.5％醋酸水，腐蚀性大，峰形较差，分离度有待进一步提高，供试品处理方法较复杂。

本发明为了解决上述缺限，确保凤仙花中药材中2-甲氧基-1,4-萘醌含量检测的可靠性，准确性，发明人通过了大量的实验研究，对色谱条件进行系统化合理控制，采用的是高效液相色谱法测定凤仙花中的2-甲氧基-1,4-萘醌的含量，色谱条件的流动相为水和乙腈进行梯度洗脱，水相比醋酸水腐蚀性小，粘度小，从速率方程角度说，流动相传质阻抗小，有利于柱效提高，峰形较好，分离度高；另本发明供试品的制备用甲醇回流提取既得，与上述供试品的制备相比供试品处理简单易行，成分在处理过程中相对流失较少，有效成分提取率较高。本发明通过试验证实该方法线性关系良好，精密度高，重现性好,回收率高，且该方法简单、快速、准确。

技术实现要素：

本发明的目的提供一种凤仙花药材中2-甲氧基-1,4-萘醌的含量检测方法。

本发明所述检测方法为高效液液相色谱法，具体步骤为：

1)供试品溶液的制备：精密称取凤仙花药材粉末0.5～1.5g，加入50～150ml的甲醇溶液，称定重量，回流提取，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥的滤纸过滤后，续滤液用0.45um的微孔滤膜过滤后既得供试品溶液；

2)对照品溶液的制备：精密称取2-甲氧基-1，4-萘醌对照品5mg，加入甲醇100ml配成0.05mg/ml的2-甲氧基-1，4-萘醌的对照品溶液；

3)色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱：规格为4.6×250mm，5um；流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：260～300nm；柱温：27～33℃；流速：0.7～1.3ml/min；进样量：10ul；

4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算含量，即得。

优选的，

1)供试品溶液的制备：精密称取凤仙花药材粉末0.6～1.4g，加入60～140ml的甲醇溶液，称定重量，回流提取，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥的滤纸过滤后，续滤液用0.45um的微孔滤膜过滤后既得供试品溶液；

2)对照品溶液的制备：精密称取2-甲氧基-1，4-萘醌对照品5mg，加入甲醇100ml配成0.05mg/ml的2-甲氧基-1，4-萘醌的对照品溶液；

3)色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱；规格为4.6×250mm，5um；流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：265～295nm；柱温：28～32℃；流速：0.8～1.2ml/min；进样量：10ul；

4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算含量，即得；

进一步优选的，

1)供试品溶液的制备：精密称取凤仙花药材粉末0.8～1.2g，加入80～120ml的甲醇溶液，称定重量，回流提取，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥的滤纸过滤后，续滤液用0.45um的微孔滤膜过滤后既得供试品溶液；

2)对照品溶液的制备：精密称取2-甲氧基-1，4-萘醌对照品5mg，加入甲醇100ml配成0.05mg/ml的2-甲氧基-1，4-萘醌的对照品溶液；

3)色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱：规格为4.6×250mm，5um；流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；270～290nm；柱温：29～31℃；流速：0.9～1.1ml/min；进样量：10ul；

4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算含量，即得。

更进一步优选的，

1)供试品溶液的制备：精密称取凤仙花药材粉末1.0g，加入100ml的甲醇溶液，称定重量，回流提取，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥的滤纸过滤后，续滤液用0.45um的微孔滤膜过滤后既得供试品溶液；

2)对照品溶液的制备：精密称取2-甲氧基-1，4-萘醌对照品5mg，加入甲醇100ml配成0.05mg/ml的2-甲氧基-1，4-萘醌的对照品溶液；

3)色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱：规格为4.6×250mm，5um；流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；280nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：10ul；

4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算含量，即得。

供试品溶液的制备中所述的回流提取指70～110℃下回流提取0.5～1.5小时。

优选的，

供试品溶液的制备中所述的回流提取指75～105℃下回流提取0.6～1.4小时。

进一步优选的，

供试品溶液的制备中所述的回流提取指80～100℃下回流提取0.8～1.2小时。

更进一步优选的，

供试品溶液的制备中所述的回流提取指90℃下回流提取1小时。

色谱条件与系统适应性试验所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

所述的检测方法，最优选的，

1)供试品溶液的制备：精密称取凤仙花药材粉末1g，加入100ml的甲醇溶液，称定重量，在90℃下回流提取1小时，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥的滤纸过滤后，续滤液用0.45um的微孔滤膜过滤后既得供试品溶液；

2)对照品溶液的制备：精密称取2-甲氧基-1，4-萘醌对照品5mg，加入甲醇100ml配成0.05mg/ml的2-甲氧基-1，4-萘醌的对照品溶液；

3)色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：280nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算含量，即得。

本发明的有益效果

1、本发明解决了现有技术中样品处理复杂，检验结果重现性差，峰形不好，分离效果差，检测数据波动较大的技术问题。进一步为研究凤仙花药材的检测方法提供可靠的实验方法。

2、本发明以凤仙花药材中2-甲氧基1,4-萘醌的含量为测定指标，采用高效液相色谱法(hplc)的含量测定方法测定2-甲氧基-1,4-萘醌，通过正交试验筛选出了提取凤仙花中2-甲氧基-1，4-萘醌的最佳方法为：100％甲醇溶液100ml在90℃下回流提取1小时。为凤仙花药材的检测方法研究提供了一定的实验依据。

3、采用本发明的检测方法，2-甲氧基-1,4-萘醌的线性范围在浓度0.0034mg/ml-0.054mg.ml范围内与峰面积呈现良好的线性关系，线性方程为:y＝6*10⁷-16256(r＝0.9997)；仪器精度高，rsd％值为0.22％,重复性rsd值为0.55％,采用本发明方法处理的供试品溶液的稳定性rsd％为1.1％，加样回收率回收平均值为100.05％，rsd＝0.73％，表明该加样回收率结果良好。

4、采用本发明方法供试品的响应值高，结果准确可靠，重现性好、精密度高且方法简便,可有效地控制凤仙花药材的质量，十批不同产地所述物中2-甲氧基-1,4-萘醌含量均值为0.989mg/g。

说明书附图

图1：粉末显微鉴定图(1单细胞腺毛、2多细胞腺毛、3草酸钙针晶、4草酸钙簇晶、5草酸钙方晶、6叶碎片、7纤维束、8晶鞘纤维、9花粉粒、10-11气孔、12-14导管)。

图2：展开剂为庚烷-苯-三氯甲烷(1：1：1)的薄层鉴定图。

图3：展开剂为苯-甲醇(9：1)的薄层鉴定图。

图4：展开剂为正己烷-乙酸乙酯-甲酸(7：5：0.8)的薄层鉴定图。

图5：薄层鉴定图(图中斑点1：2-甲氧基-1，4-萘醌对照品，斑点2至11表示不同产地药材，即2：遵义市南白镇；3：黔南市瓮安县；4：六盘水市水城县；5：黔西南安龙县；6：贵阳市龙里县；7：铜仁市松桃县；8：安顺市普定县；9：毕节市金沙县；10黔东南凯里县；11：贵阳市花溪区)

图6样品吸收波普图。

图7对照品吸收波普图。

图8线性关系图。

图9线性合并图。

图10精密度合并图。

图11重复性合并图。

图12加样回收合并图。

图13稳定性合图。

图14凤仙花药材中2-甲氧基1,4-萘醌含量图谱(产地：黔东南凯里县)。

图15凤仙花药材中2-甲氧基1,4-萘醌含量图谱(产地：毕节市金沙县)。

图16凤仙花药材中2-甲氧基1,4-萘醌含量图谱(产地：安顺市普定县)。

图17凤仙花药材中2-甲氧基1,4-萘醌含量图谱(产地：铜仁市松桃县)。

图18凤仙花药材中2-甲氧基1,4-萘醌含量图谱(产地：贵阳市龙里县)。

图19凤仙花药材中2-甲氧基1,4-萘醌含量图谱(产地：黔西南安龙县)。

图20凤仙花药材中2-甲氧基1,4-萘醌含量图谱(产地：六盘水市水城县)。

图21凤仙花药材中2-甲氧基1,4-萘醌含量图谱(产地：黔南市瓮安县)

图22凤仙花药材中2-甲氧基1,4-萘醌含量图谱(产地：遵义市南白镇)。

图23凤仙花药材中2-甲氧基1,4-萘醌含量图谱(产地：贵阳市花溪区)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

供试品溶液的制备：精密称取凤仙花药材粉末1g，加入100ml的甲醇溶液，称定重量，在90℃下回流提取1小时，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥的滤纸过滤后，续滤液用0.45um的微孔滤膜过滤后既得供试品溶液；

对照品溶液的制备：精密称取2-甲氧基-1，4-萘醌对照品5mg，加入甲醇100ml配成0.05mg/ml的2-甲氧基-1，4-萘醌的对照品溶液；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：280nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算含量，即得。

实施例2

供试品溶液的制备：精密称取凤仙花药材粉末0.5g，加入50ml的甲醇溶液，称定重量，在70℃下回流提取0.5小时，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥的滤纸过滤后，续滤液用0.45um的微孔滤膜过滤后既得供试品溶液；

对照品溶液的制备：精密称取2-甲氧基-1，4-萘醌对照品5mg，加入甲醇100ml配成0.05mg/ml的2-甲氧基-1，4-萘醌的对照品溶液；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：280nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算含量，即得。

实施例3

供试品溶液的制备：精密称取凤仙花药材粉末1.5g，加入150ml的甲醇溶液，称定重量，在110℃下回流提取1.5小时，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥的滤纸过滤后，续滤液用0.45um的微孔滤膜过滤后既得供试品溶液；

对照品溶液的制备：精密称取2-甲氧基-1，4-萘醌对照品5mg，加入甲醇100ml配成0.05mg/ml的2-甲氧基-1，4-萘醌的对照品溶液；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：280nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算含量，即得。

实施例4

供试品溶液的制备：精密称取凤仙花药材粉末0.5g，加入50ml的甲醇溶液，称定重量，在70℃下回流提取0.5小时，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥的滤纸过滤后，续滤液用0.45um的微孔滤膜过滤后既得供试品溶液；

对照品溶液的制备：精密称取2-甲氧基-1，4-萘醌对照品5mg，加入甲醇100ml配成0.05mg/ml的2-甲氧基-1，4-萘醌的对照品溶液；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：260nm；柱温：27℃；流速：0.7ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算含量，即得。

实施例5

供试品溶液的制备：供试品溶液的制备：精密称取凤仙花药材粉末1.5g，加入150ml的甲醇溶液，称定重量，在110℃下回流提取1.5小时，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥的滤纸过滤后，续滤液用0.45um的微孔滤膜过滤后既得供试品溶液；

对照品溶液的制备：精密称取2-甲氧基-1，4-萘醌对照品5mg，加入甲醇100ml配成0.05mg/ml的2-甲氧基-1，4-萘醌的对照品溶液；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：300nm；柱温：27℃；流速：0.7ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算含量，即得。

实施例6

供试品溶液的制备：精密称取凤仙花药材粉末0.6g，加入60ml的甲醇溶液，称定重量，在80℃下回流提取0.6小时，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥的滤纸过滤后，续滤液用0.45um的微孔滤膜过滤后既得供试品溶液；

对照品溶液的制备：同实施例1；

色谱条件与系统适应性试验：同实施例1；

测定法：同实施例1；

实施例7

供试品溶液的制备：精密称取凤仙花药材粉末0.7g，加入70ml的甲醇溶液，称定重量，在90℃下回流提取0.7小时，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥的滤纸过滤后，续滤液用0.45um的微孔滤膜过滤后既得供试品溶液；

对照品溶液的制备：同实施例1；

色谱条件与系统适应性试验：同实施例1；

测定法：同实施例1；

实施例8

供试品溶液的制备：精密称取凤仙花药材粉末0.8g，加入80ml的甲醇溶液，称定重量，在90℃下回流提取0.8小时，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥的滤纸过滤后，续滤液用0.45um的微孔滤膜过滤后既得供试品溶液；

对照品溶液的制备：同实施例1；

色谱条件与系统适应性试验：同实施例1；

测定法：同实施例1；

实施例8

供试品溶液的制备：精密称取凤仙花药材粉末1.1g，加入110ml的甲醇溶液，称定重量，在90℃下回流提取1.1小时，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥的滤纸过滤后，续滤液用0.45um的微孔滤膜过滤后既得供试品溶液；

对照品溶液的制备：同实施例1；

色谱条件与系统适应性试验：同实施例1；

测定法：同实施例1；

实施例9

供试品溶液的制备：精密称取凤仙花药材粉末1.3g，加入120ml的甲醇溶液，称定重量，在90℃下回流提取1.1小时，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥的滤纸过滤后，续滤液用0.45um的微孔滤膜过滤后既得供试品溶液；

对照品溶液的制备：同实施例1；

色谱条件与系统适应性试验：同实施例1；

测定法：同实施例1；

实施例10

供试品溶液的制备：精密称取凤仙花药材粉末1.4g，加入140ml的甲醇溶液，称定重量，在100℃下回流提取1.3小时，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥的滤纸过滤后，续滤液用0.45um的微孔滤膜过滤后既得供试品溶液；

对照品溶液的制备：同实施例1；

色谱条件与系统适应性试验：同实施例1；

测定法：同实施例1；

实施例11

供试品溶液的制备：同实施例2；

对照品溶液的制备：同实施例2；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：270nm；柱温：28℃；流速：0.8ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：同实施例2；

实施例12

供试品溶液的制备：同实施例3；

对照品溶液的制备：同实施例3；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：270nm；柱温：28℃；流速：0.8ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：同实施例3；

实施例13

供试品溶液的制备：同实施例4；

对照品溶液的制备：同实施例4；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：270nm；柱温：28℃；流速：0.8ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：同实施例4；

实施例14

供试品溶液的制备：同实施例5；

对照品溶液的制备：同实施例5；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：270nm；柱温：28℃；流速：0.8ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：同实施例5；

实施例15

供试品溶液的制备：同实施例6；

对照品溶液的制备：同实施例6；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：270nm；柱温：28℃；流速：0.8ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：同实施例6；

实施例16

供试品溶液的制备：同实施例7；

对照品溶液的制备：同实施例7；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：270nm；柱温：28℃；流速：0.8ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：同实施例7；

实施例17

供试品溶液的制备：同实施例8；

对照品溶液的制备：同实施例8；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：270nm；柱温：28℃；流速：0.8ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：同实施例8；

实施例18

供试品溶液的制备：同实施例9；

对照品溶液的制备：同实施例9；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：270nm；柱温：28℃；流速：0.8ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：同实施例9；

实施例19

供试品溶液的制备：同实施例10；

对照品溶液的制备：同实施例10；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：270nm；柱温：28℃；流速：0.8ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：同实施例10；

实施例20

供试品溶液的制备：同实施例2；

对照品溶液的制备：同实施例2；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：290nm；柱温：31℃；流速：1.1ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：同实施例2；

实施例21

供试品溶液的制备：同实施例3；

对照品溶液的制备：同实施例3；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：290nm；柱温：31℃；流速：1.1ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：同实施例3；

实施例22

供试品溶液的制备：同实施例4；

对照品溶液的制备：同实施例4；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：290nm；柱温：31℃；流速：1.1ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：同实施例4；

实施例23

供试品溶液的制备：同实施例5；

对照品溶液的制备：同实施例5；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：290nm；柱温：31℃；流速：1.1ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：同实施例5；

实施例24

供试品溶液的制备：同实施例6；

对照品溶液的制备：同实施例6；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：290nm；柱温：31℃；流速：1.1ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：同实施例6；

实施例25

供试品溶液的制备：同实施例7；

对照品溶液的制备：同实施例7；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：290nm；柱温：31℃；流速：1.1ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：同实施例7；

实施例26

供试品溶液的制备：同实施例8；

对照品溶液的制备：同实施例8；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：290nm；柱温：31℃；流速：1.1ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：同实施例8；

实施例27

供试品溶液的制备：同实施例9；

对照品溶液的制备：同实施例9；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：290nm；柱温：31℃；流速：1.1ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：同实施例9；

实施例28

供试品溶液的制备：同实施例10；

对照品溶液的制备：同实施例10；

色谱条件与系统适应性试验：cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5um)流动相：a相为水，b相为乙腈，梯度洗脱；检测波长：290nm；柱温：31℃；流速：1.1ml/min；进样量：10ul；所述梯度洗脱具体为：0～5min，90％～65％a，10％～35％b；5～15min，65％a,35％b；15～20min，65％～35％a,35％～65％b；20～21min，35％～90％a,65％～10％b；21～30min，90％a,10％b；

测定法：同实施例10；

实验例：为证明本发明的科学性与合理性，进行了以下方法学实验研究：

1化学成分研究

凤仙花的药效物质基础研究越来越明确，目前认为凤仙花中主要含有萘醌类、黄酮类、香豆素类、甾醇类、有机酸类^[1,6]。

1.1萘醌类

目前凤仙花中萘醌类成分主要为1,4-萘醌类成分及其衍生物。主要有2-甲氧基-1,4-萘醌^[9]、2-羟基-1,4-萘醌、1，2，4-三羟基萘-1，4-双-β-d-吡喃葡萄糖苷、1a，2a-二醇-4a-乙氧基-1，2，3，4-四氢化萘、1a，2a，4b-三醇-1，2，3，4-四氢化萘化合物、双萘醌2，2′-亚乙基(3-羟基-1，4-萘醌^[6]、亚甲基-3,3′-双指甲花醌^[1]、5，8-二羟基萘醌、2,5,7,8-四羟基萘醌^[13]。

1.2黄酮类

凤仙花中含有的黄铜类有山柰酚-3-o-芸香糖苷、山柰酚-3-o-2″-o-α-l-吡喃鼠李糖-3″-o-β-d-吡喃葡萄糖苷、山柰酚葡萄糖苷、山柰酚葡萄糖鼠李糖苷^[8]、山柰酚-3-(p-香豆酰)葡萄糖苷、4′-oh黄芩素、槲皮素^[13]、芦丁、山奈酚^[10，13]。

1.3香豆素类

凤仙花中含有的香豆素类有七叶亭、4，4-双相豆素、莨宕亭^[3,13]、异秦皮素^[1]、异白蜡树亭、东莨菪素、6-甲氧基-7-羟基香豆素^[11]。

1.4甾醇类

凤仙花中含有的甾醇类有谷甾醇、豆甾醇^[12]、凤仙四萜醇苷a-o^[1]。

1.5有机酸类

凤仙花中含有的有机酸类有阿魏酸、对羟基苯甲^[13]、芥子酸、咖啡酸、香草酸^[1]棕椰酸、脂肪酸^[14]、亚油酸^[15]。

2药理作用

2.1抗真菌作用

危建安^[29]等研究凤仙草不同提取物对皮肤真菌(红色廯菌，石膏样毛廯菌，白色念珠菌)的抑制作用实验中，用试管法求35％的乙酸冷浸药液抑菌的mbc,结果显示对三种皮肤真菌的抑制均有显著的效果。

2.2抗镇痛、抗炎作用

王旋^[16]等在研究透骨草类药材抗炎镇痛作用的比较的研究中，在抗炎实验中用醋酸诱发小鼠腹腔毛细血管通透性增高和用巴豆诱发小鼠耳肿胀，在抗镇痛实验中采用醋酸诱发小鼠腹痛和用热板诱发小鼠足痛，再给小鼠用透骨草类药物的水煎液，结果显示凤仙花对小鼠有抗炎镇痛作用。

2.3抗氧化作用

通过对急性子清楚氧自由基活性测、还原力测定、急性子抗卵黄脂质过氧化活性的测定^[17]。采用不同的溶剂和不同提取方法对凤仙花红色花瓣进行活性成分提取，采用试剂盒法对提取物进行抗氧化活性测定，结果显示不同提取物都具有抗氧化作用，且凤仙花水提取物的抗氧化活性作用最强^[20]。

2.4抗过敏作用

凤仙花白色花瓣用35％乙醇提取物(bi)对组织胺对小鼠血压的影响及bi对其影响的作用机制研究，表明凤仙花提取物(bi)可明显抑制paf依赖性低血压化合物48/80所致的低血压作用，因此证明凤仙花具有抗过敏作用^[18,19,30]。

2.5促进盐酸达克罗宁透皮的作用

刘景东^[21]等采用导数分光光度法和体外透皮吸收实验方法测定透过液中盐酸达克罗宁的震幅d值。结果急性子乙醇提取液组d值与空白对照组比较有显著性差异(p<0.05)，急性子乙醇提取液组与标准对照组比较无显著性差异(p>0.05)，空白组与标准对照组比较有显著性差异(p<0.05)。其结果表明急性子乙醇提取液具有促进盐酸达克罗宁透皮吸收作用。

2.6避孕作用

李悦，郭文扬等^[7]用雌性小鼠口服急性子煎剂10天，能明显抑制小鼠发情，且减轻卵巢及子宫的重量，表明急性子有避孕的作用。

总结：凤仙花的药用部位较多，包括花、全草、果皮、种子及根均可药用，只是由于研究还不够成熟的原因，只有其种子(急性子)被药典收载，其他药用部位还有待进行深入的研究。另外，凤仙花的化学成分较复杂，大多数成分药理作用尚不明确，作用机制及有效成分研究相对滞后，从而使得凤仙花质量标准还不够完善，因而没有具体的质量控制和完整的评价体系。因此，有必要对其质量标准进行详细研究。

凤仙花为传统苗药之一，对真菌感染性皮肤性疾病有显著的治疗作用。而现今对其抗真菌作用的研究越来越深入，可为开发抗真菌类处方提供科学依据。而质量标准的完善正是为凤仙花的科学运用提供充足的科学依据。

3实验部分

3.1仪器与试剂、试药

3.1.1仪器：岛津lc-2030c高效液相色谱仪(津岛制作所)、cosmosilcholester色谱柱、vwd-3400紫外检测器、圆底烧瓶250ml、冷凝管400mm、恒温水浴锅(型号：hws-24型厂家：上海一恒科学仪器有限公司)、打粉机(型号：cs-700厂家：永康市天祺盛世有限公司)、超声机、注射器1ml、微孔滤膜0.45ul、蒸发皿、移液管、点样毛细管0.3mm，薄层板10×20cm(厂家：青岛海洋化工厂分厂)、显微镜olympus、电子天平(型号：fa1004n厂家：上海菁海仪器有限公司)、电热鼓风干燥箱(型号：gzx-9070mbe厂家：上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、马弗炉(型号：sx-2.5-12厂家：北京科伟永兴仪器有限公司)、称量瓶、坩埚、量筒。

3.1.2试剂：2-甲氧基-1，4-萘醌对照品(批号：s20f719925厂家：上海原叶生物科技有限公司含量以98％计)、哇哈哈饮用纯净水，乙腈为色谱醇、无水乙醇、乙酸乙酯、正庚烷(天津市科密欧化学试剂有限公司)，苯、甲醇为分析醇(重庆川东化工集团有限公司)，甲酸(成都市科隆化学品有限公司)，三氯甲烷(西陇科学股份有限公司)，正己烷(天津市富宇精细化工有限公司)

3.1.3试药：凤仙花药材均采字贵州省的贵阳市、遵义市、黔南市、毕节市、安顺市、黔东南、六盘水、铜仁市、黔西南十个产地；并由我校药学院标本馆胡成刚教授鉴定为凤仙花科凤仙花属凤仙花。

3.2粉末显微鉴定

水装片：取少许粉末，置载玻片上，滴加稀甘油，用解剖针轻轻搅拌使粉末均匀分散于稀甘油中，盖上盖玻片，在显微镜下观察。

透化片：取少许粉末，置载玻片上，滴加水合氯醛溶液，在酒精灯火焰上微微加热透化，透化后滴加少许稀甘油，再加盖玻片，在显微镜下观察。

黄绿色：可见少量单细胞和多细胞的非腺毛，有较多的草酸钙针晶及晶鞘纤维，多见的草酸钙方晶及簇晶，各种导管及纤维束多见，有少量椭圆形的花粉粒，表面可见网状雕纹；叶碎片少许，表面可见平轴式气孔。结果见图1。

3.32-甲氧基-1,4-萘醌薄层鉴别

3.3.1供试品溶液的制备：

称取十个产地凤仙花药材粉末各约5g，加入95％的乙醇50ml回流提取两次，每次1h，即得10个产地的供试样品提取液。

3.3.2对照品溶液的制备：

取2-甲氧基-1,4-萘醌对照品5mg，加入95％的甲醇制成约0.5mg/ml的对照品溶液，即得对照品溶液。

3.3.3展开剂类型的考察：

分别以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(7：5：0.8)、苯-甲醇(9：1)、庚烷-苯-三氯甲烷(1：1：1)为展开剂、以磷酸目为显色剂进行试验。结果显示以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(7：5：0.8)展开剂的薄层板分离度好但对照品斑点不清晰，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(7：5：0.8)的为展开剂薄层板分离度很差，以苯-甲醇(9：1)为展开剂的薄层板分离度且对照品的斑点也清晰，因此选择以苯-甲醇(9：1)为展开剂作后续样品的鉴定，结果见图2、图3、图4。

3.3.4温湿度的考察的考察：

以苯-甲醇(9：1)为展开剂，分别在温湿度为21℃和76％，27℃和49％，22℃和79％，30℃和59％的条件下进行试验，结果没有明显的现象差异。

3.3.5样品的鉴定：

分别吸取上述十个产地样品溶液及对照品溶液点与薄层板上，以苯-甲醇(9：1)为展开剂进行展开，后续操作与3.1相同进行试验，结果显示在凤仙花样品色谱中与对照品2-甲氧基-1，4-萘醌的色谱在相应位置上均显相同的斑点。结果见附图5。

3.4检查

3.4.1水分测定

精密称取十个产地凤仙花药材粉末(过二号筛)约2-5g，根据《中国药典》2015版第四部通则0832下的第二方法(烘干法)测定，结果表明水分测定值在5.9-14.1％之间，结果见表1。

表1凤仙花药材水分测定结果(n＝3)

3.4.2浸出物测定

精密称取十个产地凤仙花药材粉末(过2号筛)约2-4g,用40％的乙醇按照《中国药典》2015版(四部)通则2201浸出物测定醇溶浸出物，结果表明浸出物测定值在21.5-42.3％之间，结果见表2。

表2浸出物测定结果(n＝3)

3.4.3总灰分及酸不溶性灰分的测定

3.4.3.1总灰分的测定：精密称取十个产地凤仙花药材粉末(过2号筛)约3g,按照《中国药典》2015版(四部)通则2302项下总灰分测定的方法测定，结果表明总灰分测定值在11.3-18.5％之间，结果见表3。

表3总灰的测定结果(n＝3)

3.4.3.2酸不溶性灰分的测定:取5.1下所得的总灰分，根据2015版《中国药典》第四部通则2302项中酸不溶性灰分的测定方法测定，结果显示其含0.064-0.267％之间，具体结果见表4。

表4酸不溶性的测定结果(n＝3)

3.5凤仙花药材中2-甲氧基-1,4-萘醌的含量检测方法学考察

3.5.1检测波长的选择

3.5.1.1对照品溶液的制备

精密称定2-甲氧基-1,4-萘醌对照品3mg，加甲醇溶液制成每1ml中含3.0ug2-甲氧基-1,4-萘醌对照品溶液。

3.5.1.2供试品溶液的制备

精密称取凤仙花粉末1g，加入甲醇溶液100ml在90℃下回流提取1h，冷却补重，过滤，既得到供试品溶液。

3.5.1.3测定法

按紫外分光光度计(《中国药典》2015年版第四部)在400～700nm范围内扫描，绘制吸收图谱，结果显示在278.5nm处有相同的吸收峰。见附图6、图7。

结果：在280nm左右，凤仙花药材和2-甲氧基-1，4-萘醌对照品可以检测到的色谱峰较多，色谱峰的峰面积较大，基线平稳，因此选择280nm为凤仙花药材图谱检测波长。

3.5.2色谱条件

cosmosilcholester色谱柱,(4.6×250mm，5ul)流动相：a相为水，b相为乙腈；检测波长：280nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：10ul,进行梯度洗脱见表5。

2-甲氧基-1，4-萘醌对照品的制备：精密称取2-甲氧基-1，4-萘醌对照品5mg，加入甲醇100ml配成0.05mg.ml-1的2-甲氧基-1，4-萘醌的对照品溶液。

表5梯度洗脱程序表

3.5.3正交实验

精密称取凤仙花药材粉末约1.000g，以回流提取甲醇的浓度(％)，甲醇的用量(ml)，提取时间(h)为考察因素按正交表进行实验，按上述色谱条件测定2-甲氧基-1，4-萘醌的风面积，结果见表6、表7、表8。

表6因素水平表

表7正交实验表

表8方差分析表

结果：通过直观分析，2-甲氧基-1，4-萘醌提取的最佳工艺为a3b3c2,经过方差分析，各因素无显著差异，最佳提取工艺为100％甲醇溶液100ml在90℃下回流提取1小时，该方法为本实验提取2-甲氧基-1，4-萘醌的最佳工艺。

3.5.4线性范围的考察

3.5.4.1对照品溶液的制备

精密称取2-甲氧基-1，4-萘醌对照品6mg，加入甲醇100ml配成0.06mg/ml的2-甲氧基-1，4-萘醌的对照品母液。

3.5.4.2线性范围考察

精密吸取上述对照品溶液0.5ml、3ml、5ml、7ml、9ml于10ml容量瓶中，按拟定的色谱条件测定峰面积，以峰面积对进样浓度进行线性回归，得回归方程y＝6×10⁷-16256(r²＝0.9997)。结果表明：2-甲氧基-1，4-萘醌质量浓度在0.0034mg/ml-0.054mg.ml范围内与峰面积呈现良好的线性关系。结果见表9、图8。

表9线性关系范围考察(n＝5)

3.5.5精密度实验

精密吸取2-甲氧基-1,4-萘醌对照品溶液(0.04mg/ml),按拟定的色谱条件，连续进样6次，每次进样10ul，测定2-甲氧基-1,4-萘醌成分峰面积，结果6次峰面积rsd％＝0.22％，符合质量标准技术要求(rsd在3％以内)，精密度良好。结果如表10所示。

表10精密度考察(n＝6)

3.5.6重复性实验

取同一批号药材，按拟定的制备方法制备供试品溶液6份，以拟定的色谱条件，每次10ul分别测定2-甲氧基-1,4-萘醌成分峰面积，计算得2-甲氧基-1,4-萘醌的含量平均值为0.497mg/g，rsd值＝0.55％，结果见表11，表明供试品溶液重复性较好。

表11重复性实验(n＝6)

3.5.7稳定性实验

按拟定方法制备供试品溶液1份，以拟定的色谱条件，按0h、2h、6h、4h、8h、10h、12h分别进样10ul，测定2-甲氧基-1,4-萘醌成分的峰面积，峰面积平均值为291735，rsd＝1.1％,结果见表12所示，表明供试品溶液在12小时内稳定。

表12稳定性实验(n＝7)

3.5.8加样回收率实验

取与重复性同一批号的凤仙花药材6份，每份0.5g精密称定，精密加入对照品0.3mg按拟定的制备方法制备供试品溶液，以拟定的色谱条件，每次10ul分别测定2-甲氧基-1,4-萘醌成分峰面积，按2015年版《中国药典》四部附录0.4939101计算出回收率。结果见表13所示，该加样回收平均值为100.05％，rsd＝0.73％，表明该加样回收率结果良好，符合定量分析要求。

表13加样回收率实验(n＝6)

3.5.9样品的测定

分别精密称取对照品与10个批次的凤仙花样品各1g，按拟定方法提取及配置，按拟定方法提取及配置，按拟定方法测定2-甲氧基-1,4-萘醌的含量取及配置，按拟定方法测定2-甲氧基-1,4-萘醌的含量。实验结果见表14、图9、图10、图11、图12、图13、图14、图15、图16、图17、图18、图19、图20、图21、图22、图23。

表14不同批次样品含量测定

由整个实验可知，所述一种凤仙花药材中2-甲氧基1,4-萘醌的测定方法，重复性好，灵敏度高，实验结果可靠。本发明以凤仙花药材中2-甲氧基1,4-萘醌的含量为测定指标，采用高效液相色谱法(hplc)的含量测定方法测定2-甲氧基1,4-萘醌，为凤仙花药材的质量标准研究提供了一定的实验依据，该方法可以为凤仙花药材中2-甲氧基1,4-萘醌的含量测定提供真实可靠的实验依据，进一步为研究凤仙花药材的质量标准提供可靠的实验方法。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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