一种以鲁米诺-铝为荧光纳米材料检测GSH的方法与流程

本发明涉及荧光检测技术领域，特别是涉及一种以鲁米诺-铝为荧光纳米材料检测gsh的方法。

背景技术：

谷胱甘肽是一种人类细胞中主要的非蛋白硫醇，具有还原性，所以作为一种具有还原性的物质，在细胞内具有多种功能，例如抗氧化性、与自由基反应等。在临床医学中，谷胱甘肽可以用于治疗多种疾病，包括阿尔兹海默氏病、酒精性肝病、肝炎等。因此，探索快速灵敏地检测谷胱甘肽的方法是很有意义的。迄今为止，文献报道检测谷胱甘肽的方法有很多，比如比色法、拉曼散射检测法、电化学法、电化学发光法和荧光检测法。相比而下，荧光检测法因为其简单快速、灵敏低消耗等优点更受欢迎，应用更多。对于荧光检测法检测谷胱甘肽，寻找一个合适的荧光探针显得尤为重要，例如碳量子点、氮掺杂的碳纳米片、近红外的石墨烯量子点都是已被文献报道地用于检测谷胱甘肽的荧光探针，这些荧光探针大部分为量子点，合成过程大部分需要很高的温度、很高的压强或者反应时间较长。因此，探索一个合成时间短、合成条件简单的荧光探针对于实际应用很有价值。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种以鲁米诺-铝为荧光纳米材料检测gsh的方法，用于解决现有技术中荧光探针合成时间长、合成条件复杂等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种以鲁米诺-铝为荧光纳米材料检测gsh的方法，所述方法以鲁米诺-铝为荧光纳米材料(luminol-alnps)为荧光纳米材料，以mno2纳米片为荧光淬灭剂来检测谷胱甘肽(gsh)。

进一步，所述鲁米诺-铝为荧光纳米材料由鲁米诺溶液与含al³⁺离子的溶液混合后经一步反应制得。

可选地，鲁米诺与al³⁺离子的摩尔用量比相等。

可选地，所述鲁米诺溶液的浓度为5～20mm，所述含al³⁺离子的溶液的浓度为5～20mm；优选地，所述鲁米诺溶液的浓度为10mm，所述含al³⁺离子的溶液的浓度为10mm。

可选地，所述含al³⁺离子的溶液为硝酸铝、氯化铝溶液中的一种，优选为硝酸铝溶液。

进一步，所述mno2纳米片的制备方法为：将mncl2·4h2o水溶液添加到四甲基氢氧化铵(tma·oh)和h2o2的混合溶液中，在室温下搅拌反应6～12h，通过离心获得mno2纳米片。

可选地，所述mncl2·4h2o水溶液的浓度为0.2～0.4m，mncl2·4h2o水溶液的用量为7.5～15ml；所述混合溶液中四甲基氢氧化铵(tma·oh)的浓度为0.5～0.8m，所述混合溶液中h2o2的浓度为3wt％，所述混合溶液的用量为15～30ml。

进一步，检测gsh时，鲁米诺-铝溶液的浓度为10～50μm；优选地，鲁米诺-铝溶液的浓度为50μm。

进一步，所述方法对gsh的检测范围为0.2～20μm，最低检测限为45nm。

进一步，检测gsh时，所述mno2纳米片的浓度为20～70μg/ml，优选为60μg/ml。

进一步，检测gsh时，反应温度为25～50℃，优选为25℃。

进一步，检测gsh时，反应时间为0～25min，优选为15min。

本发明第二方面提供一种用于检测gsh的荧光纳米材料的制备方法，所述荧光纳米材料为鲁米诺-铝为荧光纳米材料(luminol-alnps)，其制备方法为：所述鲁米诺-铝为荧光纳米材料由鲁米诺溶液与含al³⁺离子的溶液混合后经一步反应制得。

可选地，鲁米诺与al³⁺离子的摩尔用量比相等。

可选地，所述鲁米诺溶液的浓度为5～20mm，所述含al³⁺离子的溶液的浓度为5～20mm；优选地，所述鲁米诺溶液的浓度为10mm，所述含al³⁺离子的溶液的浓度为10mm。

可选地，所述含al³⁺离子的溶液为硝酸铝、氯化铝溶液中的一种，优选为硝酸铝溶液。

本发明第三方面提供一种采用上述制备方法制得用于检测gsh的荧光纳米材料。

进一步，所述荧光纳米材料在mno2纳米片存在下选择性地检测gsh。

本发明第四方面提供上述荧光纳米材料在检测gsh上的应用。

进一步，所述荧光纳米材料对gsh的检测范围为0.2～20μm，最低检测限(lod)为45nm。

如上所述，本发明的以鲁米诺-铝为荧光纳米材料检测gsh的方法，具有以下有益效果：

本发明利用聚集诱导荧光原理(aie)，室温下，用铝离子作为配位中心离子，将鲁米诺聚集在一起形成鲁米诺-铝荧光纳米材料(luminol-alnps)，合成方式简单，合成时间短。由于luminol-alnps的发射光谱与二氧化锰(mno2)纳米片的吸收光谱重叠，因此mno2纳米片可以通过荧光共振能量转移(fret)原理猝灭luminol-alnps的荧光强度。在还原性谷胱甘肽存在的条件下，mno2纳米片被还原成mn²⁺，使得被猝灭的荧光强度随着谷胱甘肽浓度的增加而增强。因此，基于fret与氧化还原反应，luminol-alnps可以用于检测谷胱甘肽，检测范围从0.2μm到20μm，最低检测限(lod)为45nm，其他金属离子和生物小分子(例如l-赖氨酸、l-苏氨酸、l-缬氨酸)对谷胱甘肽的检测无干扰，可见本方法对谷胱甘肽的检测具有较高的灵敏度和选择性。本方法被用于检测血清样品中的谷胱甘肽，回收率为101.48％到103.23％之间，可见本荧光增强法在生物分析中的具有比较好的准确性。

附图说明

图1显示为本发明luminol-alnps的合成及其基于fret通过荧光增强法检测gsh的原理图。

图2显示为本发明实施例1中luminol-alnps的tem图(a)和荧光光谱图(b)及mno2纳米片的tem图(c)和sem图(d)。

图3显示为本发明实施例2中luminol-alnps体系的荧光谱图(上图)和样品照片图(下图)。

图4显示为本发明实施例3中mno2纳米片浓度对luminol-alnps检测谷胱甘肽的影响结果图。

图5显示为本发明实施例3中谷胱甘肽和mno2纳米片的反应温度对谷胱甘肽检测的影响结果图。

图6显示为本发明实施例3中谷胱甘肽和和mno2纳米片的反应时间对谷胱甘肽检测的影响结果图。

图7显示为本发明实施例4中不同浓度的谷胱甘肽条件下体系的荧光光谱图(a)和线性工作曲线图(b)。

图8显示为本发明实施例4中使用luminol-alnps对谷胱甘肽进行荧光检测的选择性结果图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

如图1所示，本发明利用鲁米诺-铝荧光纳米材料(luminol-alnps)与mno2纳米片，通过荧光共振能量转移(fret)，检测谷胱甘肽。本发明所运用的鲁米诺-铝荧光纳米材料(luminol-alnps)是基于聚集诱导发光(aie)原理，在室温条件下，两分钟内就能完成得到具有稳定荧光的luminol-alnps。

aie材料被广泛应用于生物成像、环境监测、有机发光二极管等领域，相比于其他材料，aie材料有着背景低和光稳定性高的特点，很适合做荧光探针，因为其合成原理的不同，aie材料有很多种，其中一种是利用金属离子的螯合作用将发光物质聚集在一起减少了分子间振动而使荧光强度增强。本发明合成的luminol-alnps是以铝离子作为配位中心离子，luminol常作为发光底物。

mno2纳米片，是一种二维纳米材料，常被作为光电材料、能量储存和转换材料、催化材料等，作为一种具有氧化纳米材料，mno2纳米片可以将3，3，5，5-四甲基联苯胺(tmb)氧化，它也可以与还原性谷胱甘肽反应生成mn²⁺，所以可以利用mno2纳米片来检测谷胱甘肽。mno2米片在波长范围250nm-600nm有吸收，luminol-alnps的发射波长在430nm左右，mno2纳米片的紫外吸收光谱与luminol-alnps的发射光谱有重叠，mno2纳米片可以与luminol-alnps形成荧光共振能量转移，猝灭luminol-alnps的荧光强度。谷胱甘肽可以将mno2纳米片分解为二价锰离子，从而被猝灭的荧光强度随着mno2纳米片被谷胱甘肽分解而逐渐恢复。

以下实施例中运用的材料和试剂来源如下：

鲁米诺、氯化锰、双氧水(30％)、五水合四甲基氢氧化铵(tma·oh)和谷胱甘肽(还原型)、牛血清样本购自sigma-aldrich(中国北京)。l-缬氨酸、l-苏氨酸、l-赖氨酸购自国药控股化学试剂公司(中国上海)。冰醋酸、醋酸钠、氯化钙、氯化铁、氯化钾、硝酸铝购自成都科龙化学试剂有限公司(中国成都)。实验期间使用水和0.2mhac-nahac缓冲溶液(ph7.0)进行稀释。在所有实验中均使用超纯水。

以下实施例中运用的仪器如下：

荧光光谱是在perkinelmerls55发光光谱仪(perkinelmerinstruments，u.k)上获得的。紫外-可见(uv-vis)吸收光谱是在uv2550紫外-可见分光光度计(日本岛津市)上获得的。透射电子显微镜(tem)图像是在jem-2100f透射电子显微镜(jeol，日本)上获得的。使用来自巩义市雨花仪器有限公司(中国巩义)的zf-20d紫外分析设备在365nm紫外线下拍摄荧光照片。s-25数字式ph计(上海精科工业公司，中国上海)用于检测溶液的ph。

具体实施过程如下：

实施例1

1、luminol-alnps的制备

在室温条件下，将1ml10mm的鲁米诺溶液和1ml10mm的硝酸铝混合，两分钟后，直接一步合成luminol-alnps。将luminol-alnps溶液稀释100倍，置于4℃冰箱中，进行谷胱甘肽检测。

2、mno2纳米片的制备

首先，在15s内，将10ml0.3mmncl2·4h2o水溶液加入20ml0.6mtma·oh和3wt％h2o2的混合物中。第二步，将反应溶液在室温下搅拌一夜，然后用超纯水和甲醇离心去除沉淀，并洗涤三次，在10000rpm下离心10分钟。最后，沉淀物在50℃的真空烤箱中干燥。在使用之前，将mno2纳米片溶于水中，获得1mg/ml的mno2纳米片溶液，用于随后的谷胱甘肽检测。

3、检测谷胱甘肽的步骤

首先，70μl的1mg/mlmno2纳米片与不同浓度的谷胱甘肽在20μlph为5.8的hac-naac缓冲溶液中反应15分钟；然后加入40μl的50μmluminol-alnps的溶液；加入200μl0.2m(ph7.0)hac-naac缓冲液和适量水，使整个溶液的最终体积保持在1ml，激发波长为290nm检测其发射光谱。

4、血清样本中谷胱甘肽的检测步骤

牛血清样本是购自sigma-aldrich(中国北京)，不含谷胱甘肽。使用标准添加物的回收方法来研究这种检测谷胱甘肽的方法的准确性。为了获得回收率，分别将三种不同浓度的谷胱甘肽(5mm，10mm和30mm)添加到100ml的10倍血清样品中。类似于上面的谷胱甘肽检测步骤，完成了其他步骤。

5、luminol-alnps与mno2纳米片的合成与表征

图2显示为luminol-alnps的tem图(a)和荧光光谱图(b)、mno2纳米片的tem图(c)和图sem(d)。其中，c(al³⁺，μm)：0、40、60、80、100和200；c(luminol，mm)：0.8；hac-naac缓冲溶液ph7.0；温度(℃)：25(室温)；激发波长：290nm；发射波长：430nm；反应时间(分钟)：2。

从图2可知，在鲁米诺溶液中加入al³⁺后，形成了luminol-alnps，其具有聚集小颗粒的网络结构(图2a)。同时，luminol-alnps的荧光随着al³⁺浓度的增加而增强(图2b)，这证实了aie的合成原理。合成的luminol-alnps溶液通过测量荧光强度发现，其可在4℃冰箱中保存两周，荧光强度变化不大。合成的mno2纳米片呈片状结构(图2c-d)，在300-650nm处具有较宽的吸收范围，与luminol-alnps的发射光谱在400～500nm处的荧光重叠。

实施例2

luminol-alnps与mno2纳米片用于测定谷胱甘肽的可行性表征

图3显示为luminol-alnps体系的荧光谱图(上图)和样品照片图(下图)。红线代表luminol-alnps的荧光光谱；紫线代表mno2纳米片存在下，luminol-alnps的荧光光谱；绿线代表谷胱甘肽存在下，luminol-alnps的荧光光谱；蓝线代表在mno2纳米片和谷胱甘肽共同存在的条件下，luminol-alnps的荧光光谱。测试条件为：c(luminol-alnps，μm)：2；c(谷胱甘肽，μm)：20；c(mno2纳米片，μg/ml)：60；40mmhac-naac缓冲溶液：ph7.0；温度(℃)：25(室温)；谷胱甘肽与mno2纳米片反应时间为：10分钟；激发波长：290nm；发射波长：430nm。样片照片图是在365nm紫外灯照射下得到的，其中，luminol-alnps溶液的照片(a)，luminol-alnps溶液与谷胱甘肽混合物的照片(b)，luminol-alnps溶液与mno2纳米片的照片(c)luminol-alnps溶液与mno2纳米片和谷胱甘肽混合物(d)的照片。测试条件为：c(luminol-alnps，mm)：0.2；c(mno2纳米片，mg/ml)：0.33；c(谷胱甘肽，mm)：2。

图3的荧光光谱显示，加了mno2纳米片后，luminol-alnps在430nm处的荧光强度降低了77％，说明了luminol-alnps与mno2纳米片之间fret的可行性。由于谷胱甘肽将mno2纳米片还原为mn²⁺，在图3的荧光光谱显示，在谷胱甘肽(20μm)存在的情况下，luminol-alnps与mno2纳米片混合物的荧光得以增强。从荧光猝灭和增强结果可以看出，luminol-alnps可以作为检测谷胱甘肽的荧光探针。

实施例3

luminol-alnps检测谷胱甘肽的条件优化

首先，本实施例探索了mno2纳米片浓度对luminol-alnps检测谷胱甘肽的影响。结果如图4所示。红色柱代表luminol-alnps的荧光强度；绿色柱代表luminol-alnps与mno2纳米片混合溶液的荧光强度；蓝色柱代表luminol-alnps与mno2纳米片与谷胱甘肽的荧光。测试条件为：c(mno2纳米片，μg/ml)：20、30、40、50、60和70。c(luminol-alnps,μm)：2；谷胱甘肽与mno2纳米片反应时间为：10分钟；c(gsh，μm):20；温度(℃)：25℃(室温)。40mmhac-naac缓冲液：ph7.0。激发波长：290nm；发射光谱：430nm。所有数据均来自于三次测定结果。

从图4可知，mno2纳米片的浓度从20μg/ml至70μg/ml，luminol-alnps的荧光猝灭效率逐渐增加，加入20μm的谷胱甘肽，荧光强度增强，考虑到荧光猝灭和增加效果，达到最佳的信噪比，mno2纳米片最佳的浓度选择为60μg/ml。

其次，本实施例探索了谷胱甘肽和mno2纳米片的不同反应温度下对谷胱甘肽检测的影响。结果如图5所示。测试条件为：温度(℃)：25(室温)、37、50。c(luminol-alnps，μm)：2；c(谷胱甘肽，μm)：20；c(mno2纳米片，μg/ml)：60；谷胱甘肽与mno2纳米片反应时间为：10分钟；40mmhac-naac缓冲液：ph7.0。激发波长：290nm；发射波长：430nm；所有数据均来自于三次测定结果。

如图5所示，本实施例探索了三种不同的反应温度：25℃、37℃、50℃，考虑到荧光猝灭和增加效应并达到较大的信噪比，选择25℃(室温)作为谷胱甘肽和mno2纳米片最佳反应温度。

最后，本实施例探索了谷胱甘肽和和mno2纳米片的反应时间对谷胱甘肽检测的影响。结果图图6所示。测试条件为：谷胱甘肽与mno2纳米片反应时间为(分钟)：瞬间、2、5、10、15、20、25；温度(℃)：25(室温)；c(luminol-alnps，μm)：2；c(谷胱甘肽，μm)：20；c(mno2纳米片，微克/毫升)：60；40mmhac-naac缓冲液：ph7.0。激发波长：290nm；发射波长：430nm；所有数据均来自于三次测定结果。如图6所示，本实施例探索了反应时间分别为瞬间、2、5、10、15、20、25分钟的影响，实验数据显示，15分钟后，谷胱甘肽与mno2纳米片的反应完全，对luminol-alnps的荧光恢复达到最大。考虑到荧光猝灭和增加效应并达到较大的信噪比，选择反应15分钟为作为谷胱甘肽和mno2纳米片最佳反应时间。

实施例4

luminol-alnps用于检测谷胱甘肽的灵敏度与选择性

在上述优化的实验条件下，本实施例研究了在不同浓度的谷胱甘肽对luminol-alnps与mno2纳米片混合溶液的荧光强度的影响。

图6显示了不同浓度的谷胱甘肽条件下体系的荧光光谱图(a)和线性工作曲线图(b)。测试条件为：c(谷胱甘肽，μm)：0、0.2、0.5、2、5、8、15、20；温度(℃)：25(室温)；谷胱甘肽与mno2纳米片反应时间为：15分钟；c(luminol-alnps，μm)：2；c(谷胱甘肽，μm)：20；c(mno2纳米片，微克/毫升)：60；40mmhac-naac缓冲液：ph7.0。激发波长：290nm；发射波长：430nm；所有数据均来自于三次测定结果。

如图7a所示，随着谷胱甘肽浓度从0到20μm的增加，luminol-alnps和mno2纳米片混合溶液的荧光强度逐渐增强。图7b显示了在430nm处的荧光强度和谷胱甘肽浓度之间的线性图。由图7b可得，luminol-alnps检测谷胱甘肽的线性关系良好，线性关系为i＝124.34+5.89c(μm)，相关系数(r)为0.9957，线性关系良好。

本实施例将本发明的检测谷胱甘肽的方法与其他检测谷胱甘肽的方法(表1)相比，发现本方法的检测限(lod，45nm)低于大多数其他文献中报道的方法。谷胱甘肽是体内最丰富的抗氧化小分子量硫醇之一，主要存在于细胞内，浓度为0.5mm～10mm，lod(45nm)可满足谷胱甘肽的临床分析需要。因此，本发明使用luminol-alnps检测谷胱甘肽的方法具有很高的灵敏度。

表1.与其他检测谷胱甘肽的方法相对比

表1中的方法1-10来自于以下文献：

1.liu,y.；zhou,m.；cao,w.；wang,x.；wang,q.；li,s.；wei,h.,light-responsivemetal-organicframeworkasanoxidasemimicforcellularglutathionedetection.anal.chem.2019,91(13),8170-8175.

2.peng,c.；xing,h.；fan,x.；xue,y.；li,j.；wang,e.,glutathioneregulatedinnerfiltereffectofmno2nanosheetsonboronnitridequantumdotsforsensitiveassay.anal.chem.2019,91(9),5762-5767.

3.jiao,y.；gao,y.；meng,y.；lu,w.；liu,y.；han,h.；shuang,s.；li,l.；dong,c.,one-stepsynthesisoflabel-freeratiometricfluorescencecarbondotsforthedetectionofsilverionsandglutathioneandcellularimagingapplications.acs.appl.mater.inter.2019,11(18),16822-16829.

4.meng,h.-m.；zhao,d.；li,n.；chang,j.,agraphenequantumdot-basedmultifunctionaltwo-photonnanoprobeforthedetectionandimagingofintracellularglutathioneandenhancedphotodynamictherapy.analyst2018,143(20),4967-4973.

5.yan,x.；song,y.；zhu,c.；song,j.；du,d.；su,x.；lin,y.,graphenequantumdot-mno2nanosheetbasedopticalsensingplatform:asensitivefluorescence“turnoff–on”nanosensorforglutathionedetectionandintracellularimaging.acs.appl.mater.inter.2016,8(34),21990-21996.

6.dong,z.-z.；lu,l.；ko,c.-n.；yang,c.；li,s.；lee,m.-y.；leung,c.-h.；ma,d.-l.,amno2nanosheet-assisted谷胱甘肽detectionplatformusinganiridium(iii)complexasaswitch-onluminescentprobe.nanoscale2017,9(14),4677-4682.

7.liu,z.；cai,x.；lin,x.；zheng,y.；wu,y.；chen,p.；weng,s.；lin,l.；lin,x.,signal-onfluorescentsensorbasedongqds-mno2compositeforglutathione.anal.methods2016,8(11),2366-2374.

8.zhang,r.；zhong,x.；chen,a.-y.；liu,j.-l.；li,s.-k.；chai,y.-q.；zhuo,y.；yuan,r.,novelru(bpy)2(cpaphen)2+/tpra/tio2ternaryeclsystem:anefficientplatformforthedetectionofglutathionewithmn2+assubstitutetarget.anal.chem.2019,91(5),3681-3686.

9.gao,w.；liu,z.；qi,l.；lai,j.；kitte,s.a.；xu,g.,ultrasensitiveglutathionedetectionbasedonlucigenincathodicelectrochemiluminescenceinthepresenceofmno2nanosheets.anal.chem.2016,88(15),7654-7659.

10.venkateswararaju,c.；senthilkumar,s.,highlysensitivenovelcathodicelectrochemiluminescenceoftris(2,2′-bipyridine)ruthenium(ii)usingglutathioneasaco-reactant.chem.commun.2017,53(49),6593-6596.

为了分析使用luminol-alnps对谷胱甘肽进行荧光检测的选择性，本实施例将本方法还同时用于检测其他常见离子和生物小分子，例如cacl2、fecl3、nacl、kcl、葡萄糖(glu)、l-缬氨酸、l-苏氨酸、l-赖氨酸等。结果如图8所示，其中，谷胱甘肽、cacl2、fecl3、nacl、kcl、葡萄糖(glu)、l-缬氨酸、l-苏氨酸、l-赖氨酸的浓度为20μm；温度(℃)：25(室温)；谷胱甘肽与mno2纳米片反应时间为：15分钟；c(luminol-alnps，μm)：2；c(mno2纳米片，微克/毫升)：60；40mmhac-naac缓冲液：ph7.0。激发波长：290nm；发射波长：430nm；所有数据均来自于三次测定结果。

由图8可知，cacl2、fecl3、nacl、kcl、葡萄糖、l-缬氨酸、l-苏氨酸和l-赖氨酸不影响luminol-alnps与mno2纳米片的荧光。没有显示出与谷胱甘肽类似地对luminol-alnps与mno2纳米片荧光增强作用。这种荧光增强作用归因于谷胱甘肽和mno2纳米片之间的反应。因此，使用luminol-alnps对检测谷胱甘肽对其他物质表现出很高的选择性。

为了评价luminol-alnps用于检测谷胱甘肽的准确性，我们采用测定加标回收率的方法，对血清样本中加入谷胱甘肽做了如下实验。分别在血清中加入5μm，10μm和15μm谷胱甘肽，血清样品的平均回收率如表2所示。所有相对标准差(rsd)均低于5％。由此可见，使用luminol-alnps对谷胱甘肽进行测定是准确和可靠的。

表2测定血清中谷胱甘肽的加标回收率结果

综上所述，本发明合成的luminol-alnps是通过在室温下，温和反应条件下低成本获得的。本发明利用了mno2纳米片的紫外吸收与luminol-alnps的荧光发射光谱重叠的原理，发展了以luminol-alnps为能量给体，mno2纳米片为受体的fret体系。基于mno2纳米片与谷胱甘肽的氧化还原反应，发展了荧光增强法检测谷胱甘肽。本方法对于谷胱甘肽的检测灵敏度高，线性范围为0.2～20μm，检测限为45nm；具有很高的选择性，其他金属离子、l-缬氨酸、l-苏氨酸、l赖氨酸等物质均不干扰；准确度高，对血清样品中谷胱甘肽的检测回收率为97.90～101.69％。因此，本发明对促进aie发光纳米材料的研究，对谷胱甘肽的生物分析和临床分析具有重要意义。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。