血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的萃取方法及检测方法与流程

本发明涉及一种生化检测方法，特别涉及一种血清中维生素d代谢物-25（oh）d3的萃取方法及检测方法。

背景技术：

维生素d(vitamind)为脂溶性的固醇类物质，简称vd，目前认为维生素d也是一种类固醇激素，维生素d家族成员中最重要的成员是vd2（麦角钙化醇）和vd3（胆钙化醇)。vd2和vd3在化学结构上存在侧链不同的差异，尚无明确证据证明两者生理功能存在不同。自然界中含维生素d的天然食物不多，野生鲑鱼和经紫外线照射的蘑菇中含有vd。vd也可以通过vd强化食物摄入，最常见vd强化食物是牛奶，其次还包括一些谷物、果汁和人造黄油等。

在vd代谢过程中，vd前体物分别以7-脱氢胆固醇(7-dehydrocholestero1)和麦角固醇的形式，存在于所有陆地脊椎动物(包括人类)的皮肤和植物中，经日光中高能量的b型紫外光照射激发后转化为vd，进而在人或动物肝脏和肾脏vd羟化酶的催化下先后形成25羟基维生素d(25（oh）d3)和l，25二羟维生素d(1,25[oh]2d)。而1,25(oh)2d是在体内产生生物学作用的活性形式，因而又称之为活性vd。1,25二羟维生素d的合成受血清钙、磷浓度和甲状旁腺素(parathyroidhormone-pth)的调节。当血钙浓度降低时，刺激甲状旁腺分泌甲状旁腺素，同时增强肾脏lα羟化酶的活性，使活性vd合成增加。后者又通过反馈调节机制抑制甲状旁腺素的分泌。形成vd和钙磷代谢的协调机制。除此之外，大量观察性研究数据支持血清中的25（oh）d3水平与慢性代谢性疾病、心血管疾病和肿瘤的发生均相关，因此维生素d的骨骼外作用引起了很大的关注。

针对中国成人骨骼健康，推荐维生素d参考值采用美国健康研究院、英国骨质疏松学会和澳大利亚骨质疏松学会（osteoporosisaustralia）的标准，即25（oh）d3≥50nmol/l并且≤150nmol/l，可以认为维生素d足够；

中国是一个幅员辽阔的多民族国家，近年来对维生素d状况逐渐关注，有不同地区和人群的维生素d状况报道，结果显示很大差异。可以发现，中国人群中维生素d缺乏症普遍存在，即使在日光充沛的南方地区也是如此；同时，老年人和孕妇是维生素d缺乏症高危人群。如果采用25（oh）d3<50nmol/l（20ng/ml）定义维生素d缺乏症，多数地区报道维生素d缺乏症发生率高于60%；如果采用25（oh）d3<75nmol/l（30ng/ml）定义维生素d缺乏症，则多数地区报道维生素d缺乏症发生率高于90%。

维生素d的推荐补充剂量和耐受上限随着年龄和特定环境的差异而不同，可采用日剂量、周剂量、月剂量或者每4个月一次口服以维持维生素d。

对于孕期妇女而言，25（oh）d3通过胎盘进入胎儿血液。由于25（oh）d3半衰期为2-3周，因此在母体25（oh）d3充足的情况下，胎儿出生后几周内维生素d水平将会维持在一个正常水平内。但是很多研究表明大多数孕妇和新生儿存在维生素d缺乏，孕期以2000-4000iu/d剂量补充维生素d可改善孕妇及新生儿的25（oh）d3水平。

特殊情况下，比如肥胖，需要正常剂量的2-5倍来治疗或者防止维生素d缺乏；服用抗惊厥药物、艾滋病药物及糖皮质激素的病人通常需要服用更高的维生素d剂量；肉芽肿性疾病，比如结节病和结核病在25（oh）d3水平超过30ng/ml（75nmol/l）情况下容易产生高钙尿症和高钙血症，原因是由于患者体内巨噬细胞和肉芽肿产生的活性维生素d（1,25[oh]2d）水平升高，因此，这类患者服用维生素d需要得到监控。

多种因素会导致维生素d水平下降，就人体自身合成而言，防晒措施能使维生素d3合成量降低95%-99%；也有研究显示，深色皮肤的人群维生素d合成能力相较白人低。除此之外，空气污染导致臭氧和二氧化氮上升进而吸收紫外线辐射引起维生素d缺乏症。季节变化也会影响维生素d水平。冬春季节维生素d缺乏或不足流行程度大于夏季。

老年人群尤其存在与维生素d缺乏相关临床症状的风险，随着年龄的增长，穿着方式改变、户外活动减少等因素通常会使日光暴露减少引起维生素d合成下降。有研究显示，与8-18岁青少年相比，77-82岁老年人的维生素d合成能力下降两倍，因此老年人常常存在维生素d缺乏风险。

由于母体是新生儿维生素d需求的唯一来源，孕妇孕期缺乏维生素d通常导致新生儿维生素d缺乏，增大儿童佝偻病发病风险。据统计，美国、加拿大、欧洲、新西兰分别有27%-91%、39%-65%、19%-96%和25%-87%孕妇存在维生素d缺乏或者不足。

肥胖人群由于体脂会截留维生素d，需要正常剂量的2-5倍来治疗或者防止维生素d缺乏。服用抗癫痫药物、抗惊厥药物、艾滋病药物及糖皮质激素的病人。

维生素d与健康的关系：1、骨质疏松症，vd最早名为抗佝偻病维生素,就是由于能够预防佝偻病和软骨病而得名，其原理是vd对钙磷代谢和骨钙化的作用；2、肌无力和肌痛，跌跤引起骨折是老年人的常见病，其原因主要有三：骨质疏松症、肌无力、共济失调，这三个因素都与vd缺乏有关。冰岛对5461位66-96岁老年人做了5.4年的随访调查，发现相对于50-75nmol/l（20-30ng/ml）组，血清vd水平小于30nmol/l（12ng/ml）组股骨折风险上升2.08倍；癌症，vd与癌症的关系是最引人关注，也是最具争议的焦点问题之一，大量流行病学研究发现，vd缺乏或不足时，即25（oh）d3低于20ng/ml(50nmol/l)时，多种癌症发病风险上升，在体外实验中，也确定1,25（oh）d3可以抑制癌细胞的生长，促进癌细胞的分化和凋亡；4、其他疾病大量流行病学和临床资料表明，血液中25（oh）d3水平低可明显增加心脏病(心肌梗死、心力衰竭等)死亡率，糖尿病患者也普遍缺乏vd(达91%)，病情恶化也和血液中25（oh）d3降低相关。综合分析世界上各国流行病学研究资料，同样发现25（oh）d3低下患者还易患各种自身免疫性疾病，如类风湿关节炎、多发性硬化症、红斑狼疮等。在动物实验和少数临床预防性试验中发现，vd可以预防自身变态反应性疾病的发生。

维生素d不仅在维护骨骼健康中起作用，而且在非骨骼疾病中起潜在作用，如自体免疫疾病、癌症、心理健康问题和心血管疾病等。当需要快速矫正维生素d缺乏，如患者有疾病症状、或准备开始高效抗吸收药物治疗（唑来膦酸zoledronate或狄诺塞麦denosumab），推荐的治疗方案是在固定负荷剂量的基础上，随后规则维持治疗。

在我国，维生素d缺乏性佝偻病目前仍是婴幼儿的常见病，因维生素d缺乏引起体内钙、磷代谢失常，导致长骨干骺端和骨组织矿化不全，以致骨骼发生病变。维生素d缺乏还可影响神经、肌肉、造血、免疫等组织器官的功能对小儿的健康危害较大。因此，积极预防维生素d缺乏及维生素d缺乏性佝偻病，是儿科医疗保健工作者的重要任务。为了更好地开展维生素d缺乏及维生素d缺乏性佝偻病的防治工作，全国佝偻病防治科研协作组和中国优生科学协会小儿营养专业委员会拟定了维生素d缺乏及维生素d缺乏性佝偻病防治建议，治疗方案如下：a、一般疗法加强护理，合理饮食，坚持经常晒太阳(6个月以下避免直晒)；b、药物疗法；c、其他疗法：1，补充钙剂：适量补充钙制剂，特别是膳食钙，会有益于骨骼健康，2，微量营养元素补充：维生素d缺乏性佝偻病多伴有锌、铁降低，及时补充有利于骨骼成长，3，外科手术。

当维生素d持续到达高水平，如25（oh）d3>150nmol/l（>60ng/ml），有可能出现潜在副作用；持续血清25（oh）d3>500nmol/l（>200ng/ml）可认为是潜在维生素d中毒。维生素d中毒可引起非特异性症状，如食欲不振、体重减轻、多尿、心律失常等；同时，明显症状包括因慢性持续血钙水平升高导致血管和组织钙化，影响心脏、血管和肾脏。不适当的大剂量治疗或意外过量可导致维生素d中毒。维生素d2和维生素d3的过多摄入均可因高钙血症导致毒性。血清钙过高可能导致软组织钙化，并由此导致肾脏和心血管的损害。

美国医学研究院的食品和营养委员会总结了一些补充维生素d的研究证据，涵盖了不同剂量范围（800-300000iu/日）和持续时间（几个月到几年），结论认为补充维生素d低于10000iu/日（250μg/d），常不导致中毒；而剂量等于或高于50000iu/日，持续数周或数月常导致中毒，包括高血钙症。

欧洲食品安全局（efsa）审查了相关证据并得出结论：成年人和11岁以上儿童摄入维生素d上限4000iu/日（100μg/日）是安全的。

25-羟基维生素d（25（oh）d3）是反映人体内维生素d状态的最佳指标，但检测方法间较大的结果差异影响了维生素d缺乏的临床诊断和治疗。临床和科研实验室检测方法的标准化是建立循证医学导则的必要基础。2010年，美国国立卫生研究院营养健康办公室（nih-ods）启动了维生素d标准化计划。

目前有很多不同的分析技术和方法可用于分析人体内的25（oh）d3浓度，其中免疫分析法曾经是检测血清中25（oh）d3浓度的最主要方法，且至今仍在被广泛应用，免疫分析法包括放射免疫法(ria)、酶联免疫吸附法(elisa)、化学发光免疫测定法(clia)、电化学发光免疫测定法(eclia)、全自动生化分析法等。免疫分析法的主要缺陷是抗体之间的交叉反应导致的方法特异性不足，而色谱分析法可对这些分析物进行有效分离，从而获得足够的特异性。在这一方面，液相色谱-质谱联用(lc-ms/ms)法有很大的优势，由于lc-ms/ms法的高选择性、特异性和灵敏度，目前该分析技术已越来越广泛地用于临床检验实验室中对25（oh）d3的分析。目前液相色谱-质谱联用(lc-ms/ms)法已被美国医学研究院（iom）认定为维生素d检测的“金标准”。

目前，血清中的25（oh）d3的提取方法多半为液液萃取法，该方法为：1、混合：溶液和萃取液分别倒入分液漏斗；2、振荡：把分液漏斗倒转过来用力振荡；3、静置：将分液漏斗放在铁架台上静置；4、分液：待液体分层后,将漏斗上端玻璃塞打开,从下端放出下层液体,上端倒出上层液体（萃取剂种类不同，25（oh）d3或在上层或在下层）然而，上述的液液萃取法具有一定的缺陷：1、操作繁琐，费时。2、需要耗费大量的有机溶剂，导致高成本和对环境的污染；3、难以从水中提取高水溶性物质。

技术实现要素：

为克服现有技术的不足，本发明公开了一种血清中维生素d代谢物-25（oh）d3的萃取方法及检测方法。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

本发明公开了一种血清中维生素d代谢物-25（oh）d3的萃取方法，包括以下步骤：

步骤1）样品提取：取设定量的血清放置于离心管中，再向离心管中加入沉淀蛋白破坏剂以破坏血清中的沉淀蛋白从而使得25（oh）d3从沉淀蛋白中释放出，将血清样品与沉淀蛋白破坏剂混合均匀后再瞬离至少一次，从而获得含有25（oh）d3、磷脂和蛋白质的混合物样品；

步骤2）上样：将步骤1）中所获得混合物样品上样到活性炭萃取板，待全部的混合物样品浸入至活性炭萃取板后静置，该活性炭萃取板至少吸附混合物样品中的磷脂和蛋白质；

步骤3）洗脱：对活性炭萃取板进行至少一次的洗脱处理，洗脱结束后，将活性炭萃取板与收集板整体上下叠合，然后压合活性炭萃取板和收集板从而使得收集板收集含有25（oh）d3的洗脱液；

步骤4）复溶：以气体吹收集板至洗脱液的溶剂蒸发而剩下存留在收集板的孔内的25（oh）d3的萃取物，向收集板的孔内加入复溶剂对萃取物进行复溶，从而获得25（oh）d3的复溶液。

作为本发明的优选方案之一，所述步骤1）中，取100-200μl血清样品加入至离心管中，再向离心管中加入100-300μl体积比为50:50的水/异丙醇混合液作为沉淀蛋白破坏剂破坏血清中的沉淀蛋白，在2500-3000rpm转速下涡旋混合均匀，并且以7000-12000rpm转速瞬离10-50s；

进一步优选的，在第一次瞬离结束后，至少再向离心管内再加入100-300μl50:50的水/异丙醇混合液，并且在2500-3000rpm转速下涡旋至少1min，而后均匀混合后在7000-12000rpm转速下瞬离10-50s。

作为本发明的优选方案之一，所述步骤2）中，将所述步骤1）中所获得混合物样品上样到400-500μl/ml的活性炭萃取板中，待全部的混合物样品浸入至活性炭萃取板后静置3-6min。

作为本发明的优选方案之一，所述步骤3）中，用异辛烷或正己烷对活性炭萃取板进行洗脱处理，分三次进行洗脱，最后一次洗脱结束后，以正压装置压合上下叠合的活性炭萃取板和收集板。

进一步优选的，正压装置的开启压力为10-15psi，压合时间为5-8s。

进一步优选的，采用1.2-2.1ml异辛烷或正己烷对活性炭萃取板进行洗脱处理。

作为本发明的优选方案之一，所述步骤4）中，采用氮气仪制造氮气吹干收集板。

作为本发明的优选方案之一，采用100-200μl体积比为70:30的甲醇/水混合液作为用以溶解维生素d的复溶剂。

进一步优选的，将维生素d的复溶液以2000-4000rpm转速涡旋至少3min，再于4-8℃的温度下以2500-3000rpm转速下离心至少1min。

作为本发明的优选方案之一，所述活性炭萃取板采用多孔板，所述多孔板的每个孔内填装有活性炭，所述收集板采用多孔的塑料板，所述收集板具有与所述活性炭萃取板相同数量的孔；优选的，所述塑料板采用聚乙烯板。

作为本发明的优选方案之一，所述活性炭的制备方法包括以下步骤：

将至少由果壳、果核、煤、木材组成的有机原料在隔绝空气的条件下经600～900℃高温炭化，从而获得炭化物；将炭化物与空气中反应，使得其表面被侵蚀而产生多微孔结构。

本发明还公开了一种血清中维生素d代谢物的检测方法，包括：采用上述血清中维生素d代谢物-25（oh）d3的萃取方法所获得的25（oh）d3的复溶液作为待检测物；将所述待检测物上样至液相色谱串联质谱仪，采用液相色谱串联质谱法进行检测。

与现有技术相比，本发明的至少具有以下优点：

1)本发明提供的血清中维生素d代谢物-25（oh）d3的萃取方法可同时完成样品富集与净化，能够大大提高后续进行检测的检测灵敏度。

2）本发明提供的血清中维生素d代谢物-25（oh）d3的萃取方法即一种固相萃取方法，该萃取方法具有更高的萃取效率和回收率。

3）本发明提供的血清中维生素d代谢物-25（oh）d3的萃取方法即一种固相萃取方法，该萃取方法操作简单，省时省力，相较于传统的液液萃取方法，萃取时间缩短一半以上。

4）相对于传统的液液萃取法，本发明提供的血清维生素d代谢物-25（oh）d3的萃取方法节约溶剂和时间，易于实现自动化，可自动化批量处理。

5）本发明提供的血清中维生素d代谢物-25（oh）d3的萃取方法重现性好。

6）本发明中采用固相柱（活性炭填料）具有发达的微孔结构，填料对水性样品吸收更快速，更完全，减少上样后的等待时间；

7）生物体液的萃取体积可低至100μl，因萃取的过程是一个提纯浓缩富集的过程，所以萃取体积越少越好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例公开的血清中维生素d代谢物-25（oh）d3的检测方法所检测的血清中25（oh）d3的色谱图；

图2为本发明实施例公开的血清中维生素d代谢物-25（oh）d3的检测方法所检测的血清中25（oh）d3检测的离子谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

本发明公开了一种血清中维生素d代谢物-25（oh）d3的萃取方法，包括以下步骤：

步骤1）样品提取：取设定量的血清放置于离心管中，再向离心管中加入沉淀蛋白破坏剂以破坏血清中的沉淀蛋白从而使得25（oh）d3从沉淀蛋白中释放出，将血清样品与沉淀蛋白破坏剂混合均匀后再瞬离至少一次，从而获得含有25（oh）d3、磷脂和蛋白质的混合物样品；

步骤2）上样：将步骤1）中所获得混合物样品上样到活性炭萃取板，待全部的混合物样品浸入至活性炭萃取板后静置，该活性炭萃取板至少吸附混合物样品中的磷脂和蛋白质；

步骤3）洗脱：对活性炭萃取板进行至少一次的洗脱处理，洗脱结束后，将活性炭萃取板与收集板整体上下叠合，然后压合活性炭萃取板和收集板从而使得收集板收集含有25（oh）d3的洗脱液；

步骤4）复溶：以气体吹收集板至洗脱液的溶剂蒸发而剩下存留在收集板的孔内的25（oh）d3的萃取物，向收集板的孔内加入复溶剂对萃取物进行复溶，从而获得25（oh）d3的复溶液。

作为本发明的优选方案之一，本发明所公开了一种血清中维生素d代谢物-25（oh）d3的萃取方法，包括以下步骤：

步骤1）：取100-200μl血清样品加入至离心管(1.5ml无菌离心管)中，再向离心管中加入100-300μl体积比为50:50的水/异丙醇混合液作为沉淀蛋白破坏剂破坏血清中的沉淀蛋白，在2500-3000rpm转速下涡旋混合均匀，并且以7000-12000rpm转速瞬离10-50s；

在第一次瞬离结束后，至少再向离心管内再加入100-300μl50:50的水/异丙醇混合液，并且在2500-3000rpm转速下涡旋至少1min，而后均匀混合后在7000-12000rpm转速下瞬离10-50s。

步骤2）：将所述步骤1）中所获得混合物样品上样到400-500μl/ml的活性炭萃取板中，待全部的混合物样品浸入至活性炭萃取板后静置3-6min。

步骤3）：采用1.2-2.1ml异辛烷或正己烷对活性炭萃取板进行洗脱处理，分三次进行洗脱，最后一次洗脱结束后，以正压装置压合上下叠合的活性炭萃取板和收集板，收集板收集含有25（oh）d3的洗脱液,正压装置的开启压力为10-15psi，压合时间为5-8s。

步骤4）：采用氮气仪制造氮气吹收集板至洗脱液的溶剂蒸发而剩下存留在收集板的孔内的25（oh）d3的萃取物，接着，采用100-200μl体积比为70:30的甲醇/水混合液作为用以溶解25（oh）d3的复溶剂；将25（oh）d3的复溶液以2000-4000rpm转速涡旋至少3min，再于4-8℃的温度下以2500-3000rpm转速下离心至少1min(此处也可以选择不离心，若肉眼可见复溶液内有杂质，则需要离心，否则则不需要离心，因步骤（1）中已离心多次，杂质几乎去除殆尽)。

其中，所述活性炭萃取板采用多孔板（如采用96孔板），所述多孔板的每个孔内填装有活性炭，从而形成96个萃取柱，所述收集板采用多孔的塑料板（如采用96孔板），所述收集板具有与所述活性炭萃取板相同数量的孔，所述塑料板采用聚乙烯板。相应的，正压装置采用与96萃取柱稳稳结合的一种装置-commavac®96孔正压提取装置。在进行收集时，将96孔的收集板放于96孔的活性炭萃取板的下面，正压装置压合96孔的活性炭萃取板，收集板收集含有25（oh）d3的萃取液。

活性炭的制备方法包括以下步骤：

将至少由果壳、果核、煤、木材组成的有机原料在隔绝空气的条件下经600～900℃高温炭化，从而获得炭化物，以减少非碳成分，氧元素如h2o、co、co2等气体析出（此过程称为炭化）；将炭化物与空气反应，使得其表面被侵蚀，产生多微孔结构。活性炭在市面上可以买到，或者经过委托厂商特制可以获得。

活性炭可以有效吸附或去除血清样品中的磷脂，此外，活性炭由于具有发达的微孔结构，质轻、孔隙率高、吸附液体能力强等特性，因此它还能够吸附很多其他物质。本申请中，着重强调活性炭能更有效地吸附血清样本中的磷脂，因为血清中的磷脂是基质效应的主要来源，可造成分析结果的差异性，并导致无法预测的质谱结果。活性炭能选择性地捕获导致离子抑制作用的磷脂类干扰物，而不影响目标物（25（oh）d3）的损失，因此为含脂样品提供了极佳的净化效果，从而能够有效地提高仪器检测25（oh）d3的灵敏度。

以下结合具体实施例1-3对本发明的技术方案作进一步的解释说明。

实施例1：

本发明实施例1公开了一种血清中维生素d代谢物-25（oh）d3的萃取方法，包括以下步骤：

步骤1）样品提取：取100μl血清样品加入至离心管(1.5ml无菌离心管)中，再向离心管中加入100μl体积比为50:50的水/异丙醇混合液作为沉淀蛋白破坏剂破坏血清中的沉淀蛋白，从而使得25（oh）d3从沉淀蛋白中释放出，将血清样品与沉淀蛋白破坏剂在2500rpm转速下涡旋混合均匀后，并且以7000rpm转速瞬离10s；

在第一次瞬离结束后，至少再向离心管内再加入100μl50:50的水/异丙醇混合液，并且在2500rpm转速下涡旋1min，而后均匀混合后在7000rpm转速下瞬离10s，从而最终获得含有25（oh）d3、磷脂和蛋白质的混合物样品；

步骤2）上样：将步骤1）中所获得混合物样品上样到400μl/ml的活性炭萃取板，待全部的混合物样品浸入至活性炭萃取板后静置3min，该活性炭萃取板至少吸附混合物样品中的磷脂和蛋白质；

步骤3）洗脱：采用1.2ml异辛烷或正己烷对活性炭萃取板进行洗脱处理，分三次进行洗脱，最后一次洗脱结束后，以正压装置压合上下叠合的活性炭萃取板和收集板，从而使得收集板收集含有25（oh）d3的洗脱液，其中，正压装置的开启压力为10psi，压合时间为5s。

步骤4）复溶：采用氮气仪制造氮气吹收集板至洗脱液的溶剂蒸发而剩下存留在收集板的孔内的25（oh）d3的萃取物，接着，采用100μl体积比为70:30的甲醇/水混合液作为用以溶解25（oh）d3的复溶剂对萃取物进行复溶，从而获得25（oh）d3的复溶液；将25（oh）d3的复溶液以2000rpm转速涡旋3min，再于4℃的温度下以2500rpm转速下离心1min(此处也可以选择不离心，若肉眼可见复溶液内有杂质，则需要离心，否则则不需要离心，因步骤（1）中已离心多次，杂质几乎去除殆尽)。

其中，所述活性炭萃取板采用多孔板（如采用96孔板），所述多孔板的每个孔内填装有活性炭，从而形成96个萃取柱，所述收集板采用多孔的塑料板（如采用96孔板），所述收集板具有与所述活性炭萃取板相同数量的孔，所述塑料板采用聚乙烯板。相应的，正压装置采用与96萃取柱稳稳结合的一种装置-commavac®96孔正压提取装置。在进行收集时，将96孔的收集板放于96孔的活性炭萃取板的下面，正压装置压合96孔的活性炭萃取板，收集板收集含有25（oh）d3的萃取液。

实施例2：

本发明实施例2公开了一种血清中维生素d代谢物-25（oh）d3的萃取方法，包括以下步骤：

步骤1）样品提取：取150μl血清样品加入至离心管(1.5ml无菌离心管)中，再向离心管中加入200μl体积比为50:50的水/异丙醇混合液作为沉淀蛋白破坏剂破坏血清中的沉淀蛋白，从而使得25（oh）d3从沉淀蛋白中释放出，将血清样品与沉淀蛋白破坏剂在2800rpm转速下涡旋混合均匀后，并且以10000rpm转速瞬离30s；

在第一次瞬离结束后，至少再向离心管内再加入200μl50:50的水/异丙醇混合液，并且在2800rpm转速下涡旋2min，而后均匀混合后在10000rpm转速下瞬离30s，从而最终获得含有25（oh）d3、磷脂和蛋白质的混合物样品；

步骤2）上样：将步骤1）中所获得混合物样品上样到450μl/ml的活性炭萃取板，待全部的混合物样品浸入至活性炭萃取板后静置4min，该活性炭萃取板至少吸附混合物样品中的磷脂和蛋白质；

步骤3）洗脱：采用1.7ml异辛烷或正己烷对活性炭萃取板进行洗脱处理，分三次进行洗脱，最后一次洗脱结束后，以正压装置压合上下叠合的活性炭萃取板和收集板，从而使得收集板收集含有25（oh）d3的洗脱液，其中，正压装置的开启压力为12psi，压合时间为7s。

步骤4）复溶：采用氮气仪制造氮气吹收集板至洗脱液的溶剂蒸发而剩下存留在收集板的孔内的25（oh）d3的萃取物，接着，采用150μl体积比为70:30的甲醇/水混合液作为用以溶解25（oh）d3的复溶剂对萃取物进行复溶，从而获得25（oh）d3的复溶液；将25（oh）d3的复溶液以3000rpm转速涡旋4min，再于6℃的温度下以2800rpm转速下离心2min(此处也可以选择不离心，若肉眼可见复溶液内有杂质，则需要离心，否则则不需要离心，因步骤（1）中已离心多次，杂质几乎去除殆尽)。

其中，所述活性炭萃取板采用多孔板（如采用96孔板），所述多孔板的每个孔内填装有活性炭，从而形成96个萃取柱，所述收集板采用多孔的塑料板（如采用96孔板），所述收集板具有与所述活性炭萃取板相同数量的孔，所述塑料板采用聚乙烯板。相应的，正压装置采用与96萃取柱稳稳结合的一种装置-commavac®96孔正压提取装置。在进行收集时，将96孔的收集板放于96孔的活性炭萃取板的下面，正压装置压合96孔的活性炭萃取板，收集板收集含有25（oh）d3的萃取液。

实施例3：

本发明实施例23公开了一种血清中维生素d代谢物-25（oh）d3的萃取方法，包括以下步骤：

步骤1）样品提取：取200μl血清样品加入至离心管(1.5ml无菌离心管)中，再向离心管中加入300μl体积比为50:50的水/异丙醇混合液作为沉淀蛋白破坏剂破坏血清中的沉淀蛋白，从而使得25（oh）d3从沉淀蛋白中释放出，将血清样品与沉淀蛋白破坏剂在2800rpm转速下涡旋混合均匀后，并且以12000rpm转速瞬离50s；

在第一次瞬离结束后，至少再向离心管内再加入300μl50:50的水/异丙醇混合液，并且在3000rpm转速下涡旋3min，而后均匀混合后在12000rpm转速下瞬离50s，从而最终获得含有25（oh）d3、磷脂和蛋白质的混合物样品；

步骤2）上样：将步骤1）中所获得混合物样品上样到500μl/ml的活性炭萃取板，待全部的混合物样品浸入至活性炭萃取板后静置6min，该活性炭萃取板至少吸附混合物样品中的磷脂和蛋白质；

步骤3）洗脱：采用2.1ml异辛烷或正己烷对活性炭萃取板进行洗脱处理，分三次进行洗脱，最后一次洗脱结束后，以正压装置压合上下叠合的活性炭萃取板和收集板，从而使得收集板收集含有25（oh）d3的洗脱液，其中，正压装置的开启压力为15psi，压合时间为8s。

步骤4）复溶：采用氮气仪制造氮气吹收集板至洗脱液的溶剂蒸发而剩下存留在收集板的孔内的25（oh）d3的萃取物，接着，采用200μl体积比为70:30的甲醇/水混合液作为用以溶解25（oh）d3的复溶剂对萃取物进行复溶，从而获得25（oh）d3的复溶液；将25（oh）d3的复溶液以4000rpm转速涡旋5min，再于8℃的温度下以3000rpm转速下离心3min(此处也可以选择不离心，若肉眼可见复溶液内有杂质，则需要离心，否则则不需要离心，因步骤（1）中已离心多次，杂质几乎去除殆尽)。

其中，所述活性炭萃取板采用多孔板（如采用96孔板），所述多孔板的每个孔内填装有活性炭，从而形成96个萃取柱，所述收集板采用多孔的塑料板（如采用96孔板），所述收集板具有与所述活性炭萃取板相同数量的孔，所述塑料板采用聚乙烯板。相应的，正压装置采用与96萃取柱稳稳结合的一种装置-commavac®96孔正压提取装置。在进行收集时，将96孔的收集板放于96孔的活性炭萃取板的下面，正压装置压合96孔的活性炭萃取板，收集板收集含有25（oh）d3的萃取液。

本发明实施例4还公开了一种血清中维生素d代谢物-25（oh）d3的检测方法，包括：采用上述的一种血清中维生素d代谢物-25（oh）d3的萃取方法所获得的25（oh）d3的复溶液作为待检测物；将所述待检测物上样至液相色谱串联质谱仪，采用液相色谱串联质谱法进行检测，其中液相色谱串联质谱法检测是目前常规的检测方法，此处原理不作具体的赘述。本发明实施例4提供的血清中维生素d代谢物-25（oh）d3的检测方法的主要创新在于利用上述的固相萃取法萃取出25（oh）d3，固相萃取法萃取出25（oh）d3的过程此为样品前处理，而测定的过程则为常规的手段，以下通过图表和文字大致列出液相色谱串联质谱法进行检测的测定步骤：

a)液相色谱条件：

a1)色谱柱：watersxbridgec18(2.1mm×50mm,3.5μm)；

a2)柱温：40℃；

a3)进样量：5μl；

a4)流动相：含0.1%甲酸的甲醇、0.1%甲酸的水的流动相；

a5)洗脱方式：梯度洗脱。

表1流动相梯度洗脱条件：

b)质谱条件：

电喷雾电压：3500v鞘气压力：35arb辅气压力：2arb离子传输管：350℃辅气温度：340℃采集方式：多反应监测

表2各组分母离子和子离子检测的离子对参数：

c)结果

附图1是血清中25（oh）d3检测的色谱图，表明检测出的物质是25（oh）d3，横坐标1.41所在的峰图代表的是25（oh）d3；附图2是血清中25（oh）d3检测的离子谱图，液相色谱串联质谱仪检测25（oh）d3的检测峰面积结果图，该图的结果是对上述的固相萃取方法的一个验证，也就说，使用上述的固相萃取方法进行样品前处理以后再上机测定，能够测定出的25（oh）d3的含量；

表3为加标回收率结果：

表4为两种不同萃取方法的加标回收率结果对比：

通过表3能够看出固相萃取方法的回收率，通过表4能够看出固相萃取方法与传统的液液萃取方法的回收率的对照，而回收率能够体现萃取效率，因此可以明确地看出本发明实施例所公开的血清中25（oh）d3的萃取方法（固相萃取方法）的萃取效率高于传统的液液萃取方法，因此本发明实施例提供的血清中25（oh）d3的萃取方法（固相萃取方法）更加具有优势，能够提高后续进行液相色谱串联质谱检测的灵敏度。

此外，本发明提供的血清中25（oh）d3的萃取方法操作简单，省时省力，相较于传统的液液萃取方法，萃取时间缩短一半以上；相对于传统的液液萃取法，本发明提供的血清中25（oh）d3的萃取方法节约溶剂和时间，易于实现自动化，可自动化批量处理；萃取所采用的样品量少（可低至100μl）。

对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。