一种硒单糖的酶催化检出方法与流程

本发明涉及硒单糖的检出方法，尤其涉及一种硒单糖的酶催化检出方法。

背景技术：

硒是人体必需的微量矿物质，硒缺乏所致“克山病”在我国北方和中西部偏远地区普遍发生；近现代临床医学进一步证实，人体硒含量与多种疾病相关分子(如心血管疾病的标志物-同型半胱氨酸)的代谢表达密切相关。因此，建立评价硒营养水平的生化指标极其必要。然而，根据已知的硒合成代谢，作为人血浆硒库的硒蛋白p结构保守性不佳并存在表达阈值，而其系列甲基化产物及硒取代含硫氨基酸在不同组织、细胞中的表达不一致且测量误差大，故都不适宜于作为健康监测的标志物。最新物种形成分析研究发现，人尿液中存在一种含量占绝对主导的硒排泄物，其学名为“1β-甲基硒-2-n-乙酰基-d-半乳糖胺”(1β-selenomethyl-2-n-acetyl-d-galactosamine，简称galnac1seme)，有望成为潜在的评估终点，这可为进一步阐明生物硒关联代谢提供有效的分析手段。1β-甲基硒-2-n-乙酰基-d-半乳糖胺对应的半缩醛结构如下：

目前，对特殊的硒掺杂化合物的检测一般采用高效液相色谱(或毛细管电泳)串联质谱这样的大型设备进行，这必然要求专人操作、测试周期较长，还须配制合适的流动相以实现特定组分的基线分离。另一方面，虽然凝集素lectin-dsa可识别细胞膜表面的蛋白糖基n-乙酰-d-半乳糖胺(简称galnac)，但也可与n-乙酰-d-葡糖胺(简称glcnac)识别，缺乏专一性；而筛选单糖多肽适配体的成本又极高，并且没有现成序列库可以借鉴，故都不适用于捕获游离的galnac单糖，更不用说这两类分子识体还需额外染料标记。所以，有必要为未来复杂生物试样中galnac1seme的快速、灵敏检出开发一种简易、温和而有效的分析手段。

最近，化学生物学家发现细菌的细胞色素p450单加氧酶(简称cyp450)在铁氧化还原蛋白(ferredoxin，简称fox)、铁氧还蛋白还原酶(ferredoxinreductase，简称for)以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotide，即nadh)辅酶的联合帮助下，可被改用作甲氧基保护多糖(如6-o-methyl-d-galactose，6-o-甲基-d-半乳糖)的去甲基化酶(demethylase)。考虑到硒亦属于氧族元素，且硒甲基的共价键(l[ch3-se]＝198pm)长于甲基醚(l[ch3-o]＝143pm)、前者键能更弱，因此可以尝试沿用类似的办法将其解离。但是如何利用上述反应检出硒单糖galnac1seme，目前人们还未开发出一种流程简单，检验效率高的检出方法。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种硒单糖的酶催化检出方法，本发明利用细胞色素p450单加氧酶对硒单糖中甲基硒官能团的识别，将该配基脱去，该过程伴随四甲基联苯胺的氧化，根据溶液颜色的转变实现硒单糖的灵敏指示。

本发明公开了细胞色素p450单加氧酶、铁氧化还原蛋白(fox)、铁氧还蛋白还原酶(for)和还原型四甲基联苯胺(tmbred)在检测硒单糖或制备硒单糖检出试剂中的应用，硒单糖为1β-甲基硒-2-n-乙酰基-d-半乳糖胺(galnac1seme)。

进一步地，细胞色素p450单加氧酶由大肠杆菌(escherichiacoli)重组表达，源于ncbi序列号为wp_038530297.1的细菌formosaagariphila，细胞色素p450单加氧酶代号为cyp236a20。

进一步地，cyp236a20、铁氧化还原蛋白、铁氧还蛋白还原酶和还原型四甲基联苯胺的浓度比为0.01～1.0:1.0～90.0:0.2～18.0:250～3000。

本发明中，硒单糖galnac1seme为人体尿液中的主要代谢排出物。细胞色素p450单加氧酶作为催化剂和硒单糖的受体使用；铁氧化还原蛋白和铁氧还蛋白还原酶作为电子传递媒介体；还原型四甲基联苯胺作为质子供体和显色剂使用。

本发明还公开了一种硒单糖的酶催化检出方法，硒单糖为1β-甲基硒-2-n-乙酰基-d-半乳糖胺，包括以下步骤：

提供含有细胞色素p450单加氧酶、铁氧化还原蛋白和铁氧还蛋白还原酶的待测溶液；

向待测溶液中加入还原型四甲基联苯胺溶液，根据待测溶液的颜色变化判断待测溶液中是否含有硒单糖。

进一步地，含有细胞色素p450单加氧酶来源于细菌(formosaagariphila)，细菌(formosaagariphila)的ncbi序列号为wp_038530297.1，代号cyp236a20；待测溶液中cyp236a20的浓度为0.01～1.0μm。

进一步地，待测溶液中铁氧化还原蛋白的浓度为1.0～90.0μm。

进一步地，待测溶液中铁氧还蛋白还原酶的浓度为0.2～18.0μm。铁氧化还原蛋白和铁氧还蛋白还原酶是cyp超家族中细菌亚类所必需的蛋白，作为cyp236a20所主导酶催化反应的电子传递媒介配对使用，表达自与cyp236a20保守序列共定位的多糖利用基因位点(ncbi序列号分别是wp_038530300.1和wp_038530304.1)。

进一步地，待测溶液中还原型四甲基联苯胺的浓度为0.25～3.0mm。还原型四甲基联苯胺充当cyp236a20主导的酶催化反应的质子给体和指示剂。本发明为了肉眼辨别反应的发生而选择了有变色性质的质子给体。

进一步地，待测溶液的ph值为7.0～8.0。

进一步地，待测溶液中的溶剂包括磷酸钠缓冲液、莰酮、巯基乙醇和氯化钠。

进一步地，待测溶液中还溶解有氧气。

进一步地，判断待测溶液中是否含有硒单糖的方法如下：当待测溶液中含有硒单糖galnac1seme时，在细胞色素p450单加氧酶的作用下，硒单糖脱去甲基硒，铁氧化还原蛋白和铁氧还蛋白还原酶将电子传递给还原型四甲基联苯胺，还原型四甲基联苯胺发生氧化(tmbox)，溶液颜色由无色透明转变为蓝紫色。只有当硒单糖、细胞色素p450单加氧酶、铁氧化还原蛋白和铁氧还蛋白还原酶共存时，还原型四甲基联苯胺才会被氧化而变色，任一单组分或双组分都不能启动以上酶催化反应链。以上反应原理如下：

当待测溶液中不含有硒单糖galnac1seme时，则不发生上述变化，溶液颜色一直保持无色透明。

还原型tmbred与其氧化型tmbox之间的形态转换与伴随的质子得失反应原理如下：

进一步地，还可以通过紫外-可见分光光度法记录420nm处吸光度测试溶液颜色变化过程，当在420nm处存在吸收时，溶液中含有硒单糖，反之则不含硒单糖。

基于上述原理，本发明还提供了一种1β-甲基硒-2-n-乙酰基-d-半乳糖胺的指示剂，其包括细胞色素p450单加氧酶、铁氧化还原蛋白、铁氧还蛋白还原酶和还原型四甲基联苯胺。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明提供了一种基于cyp450催化系统检出1β-甲基硒-2-n-乙酰基-d-半乳糖胺的新方法，以细胞色素p450单加氧酶作为催化剂和该底物的受体，以铁氧化还原蛋白和铁氧还蛋白还原酶为电子传递媒介体，以四甲基联苯胺为质子供体和显色剂；利用酶与待测物中甲基硒官能团的识别与转化，将该配基脱去。该过程伴随四甲基联苯胺的氧化，使溶液颜色由无色透明向蓝紫色转变，从而实现该硒单糖的灵敏指示。

本发明不仅简化了硒单糖代谢标志物的鉴定流程，节约了人力成本与硬件设备，还提升了检验效率，有助于推动相关即时检验产品的设计和开发。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

图1是本发明不同试验组中硒单糖的分析结果定性照片比较结果；

图2是本发明不同试验组在420nm波长处的紫外吸收动力学曲线。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例

为了验证细胞色素p450单加氧酶、铁氧化还原蛋白、铁氧还蛋白还原酶和还原型四甲基联苯胺检出硒单糖galnac1seme的能力，以下以硒单糖galnac1seme溶液为底物，向溶液中加入细胞色素p450单加氧酶、铁氧化还原蛋白、铁氧还蛋白还原酶和还原型四甲基联苯胺，若溶液发生变色，则表明可以检出硒单糖。

硒单糖galnac1seme溶液的配制方法如下：

将galnac1seme的粉末样标准品用50mmph7.4磷酸钠缓冲溶液涡旋溶解，并配制成100μm储备液于4℃冰箱中静置变旋过夜，得到底物溶液。

细胞色素p450单加氧酶由大肠杆菌(escherichiacoli，简称e.coli)重组表达，源于细菌formosaagariphila，在ncbi数据库中对应的基因检索序列号是wp_038530297.1，重组蛋白代号cyp236a20。使用前，将cyp236a20用含100μm莰酮的50mmph7.4磷酸钠缓冲溶液涡旋分散，配制成0.1μm储备液，并置于4℃下保存待用。

fox和for是cyp超家族中细菌亚类发生单氧化反应所必需的电子传递蛋白对，本发明中用作cyp236a20主导的酶催化反应的电子传导媒介体；其对应序列遴选自与cyp236a20保守序列共定位的多糖利用基因位点(polysaccharide-utilizationloci，简称pul)，ncbi数据库中对应的基因检索序列号分别是wp_038530300.1和wp_038530304.1，同样由标准的e.coli系统表达生产。使用前，fox用含10mm巯基乙醇的50mmph7.4磷酸钠缓冲液涡旋分散，配制成5μm储备液；for则用含100mm氯化钠的50mmph7.4磷酸钠缓冲液涡旋分散，配制成1μm储备液，都保存在4℃备用。

还原型四甲基联苯胺(tmbred)，其特征在于，它充当cyp236a20主导的酶催化反应的质子给体和指示剂。使用前，将tmbred涡旋溶解于50mmph7.4磷酸钠缓冲溶液中，配制成浓度为1mm的溶液。

为了作为对照，同时做几组平行试验：

(a)组包括cyp236a20(0.01μm)、fox(2.5μm)、for(0.5μm)和tmbred(1mm)；

(b)组包括galnac1seme(3μm)、fox(2.5μm)、for(0.5μm)和tmbred(1mm)；

(c)组包括galnac1seme(3μm)、cyp236a20(0.01μm)和tmbred(1mm)；

(d)组包括galnac1seme(3μm)、cyp236a20(0.01μm)、fox(2.5μm)和for(0.5μm)；

(e)组包括galnac1seme(3μm)、cyp236a20(0.01μm)、fox(2.5μm)、for(0.5μm)和tmbox(1mm)。

按照以上试验组各组分的浓度配制各溶液，溶液均采用50mmph7.4磷酸钠为溶剂与不同体积的各母液共同混合后得到。(e)组配制方法如下：

用微量移液器吸取1mmtmbred储备液200μl作母液，向其中按顺序添加以上配制的cyp236a20、fox和for的储备液，每次移入都在室温下涡旋30秒以充分混匀，最后加入底物溶液，配制成混合液。加入底物galnac1seme后，用移液器反复抽吸释放5秒以混合均匀。

所有试验组的溶液混合完毕，将所得混合液转入总体积320μl的微量比色皿中，以50mmph7.4磷酸钠缓冲液为参比，用日本岛津公司生产的uv-3600紫外-可见-近红外分光光度计搭载的uvprobe软件中的动力学模块，扫描420nm波长处的吸光率的变化，连续记录至120秒。

图1为以上不同试验组中硒单糖的分析结果定性照片比较结果。从左到右并排摆放的烧杯依次对应(a)、(b)、(c)、(d)、(e)组。可以看出，只有(e)组溶液显色，其他试验组的溶液均呈无色透明状，这说明，本发明的酶催化体系可以检出硒单糖。

图2为以上不同试验组在420nm波长处的紫外吸收动力学曲线，图(a)、(b)、(c)、(d)、(e)依次对应以上试验组(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的紫外吸收动力学曲线。结果表明，(a)、(b)、(c)、(d)组在整个测试过程中，紫外吸收信号均没有发生变化，四组的紫外吸收曲线相互重合，而只有(e)组产生了紫外吸收信号，且随时间发生变化，这说明，只有同时含有硒单糖、细胞色素p450单加氧酶、铁氧化还原蛋白、铁氧还蛋白还原酶和还原型四甲基联苯胺酶时，溶液才有紫外吸收信号。联立该动力学曲线和紫外-可见吸收光谱可计算出cyp236a20催化galnac1seme脱甲基的michaelis-menten系数km＝(0.63±0.16)mm，催化反应速率常数kcat＝(43.4±0.5)s^-1。

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。