液相色谱串联质谱定量检测纳米材料表面脂多糖的方法与流程

本发明涉及一种液相色谱串联质谱定量检测纳米材料表面脂多糖的方法，属于分析化学技术领域。

背景技术：

纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺寸(0.1-100nm)或由它们作为基本单元构成的材料。目前，多种多样的纳米材料，例如sio2，ag，tio2等已经被广泛应用于食品添加剂，储存材料，护肤品，医疗器械等。这一类产品通称为纳米产品，可以通过呼吸系统，胃肠道系统，皮肤接触，血液接触等方式暴露于人体，可能对人体造成潜在的危害。美国fda在2018年颁布了纳米技术指导文件，提出了纳米产品的安全性检测的指导原则(https://www.fda.gov/scienceresearch/specialtopics/nanotechnology/ucm602536.htm)。脂多糖是革兰氏阴性菌的主要成分之一，在传统概念中，又称为内毒素，在体内可引起发热、休克，甚至导致死亡。脂多糖是食品、护肤品、医疗产品等与人体密切接触的工业产品安全性是否达标的重要生物指标。

目前，内毒素检测的国标方法为鲎试剂法[gb/t14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法，第二部分：生物学试验方法]，鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素。在传统工业产品的安全性检测中，该方法具有简单、易操作、适合高通量检测等优点。然而，纳米材料由于其高表面活性及类生物分子活性，鲎试剂法在检测纳米材料的内毒素含量时往往存在假阳性的数据(lietal,nanotoxicology，2015，462-473)，影响对纳米产品安全性的准确评估。例如，氧化石墨烯纳米材料具有类内毒素的亲和性能与细胞toll样受体结合(quetal,acsnano,2013，5732；chenetal,advancedhealthcarematerials，2014，1486)。此外，尽管市场上还有酶联免疫法，即利用试剂盒中的脂多糖抗体与脂多糖中的o-抗原反应而实现对脂多糖进行检测，但是由于脂多糖是胸腺非依赖性抗原(ti抗原)，不能诱导产生高亲和力的抗体，所以该方法存在特异性差，抗干扰能力弱等缺陷，也很难应用于纳米产品的内毒素检测。

技术实现要素：

为了解决纳米材料内毒素检测结果不准确的问题，本发明提供一种液相色谱串联质谱定量检测纳米材料表面细菌脂多糖的方法。

本发明的第一个目的是提供一种液相色谱串联质谱定量检测纳米材料表面脂多糖的方法，包括如下步骤：

s1、采用酚水提取纳米材料表面脂多糖得到脂多糖提取液；

s2、将脂多糖提取液进行酸水解处理得到含有3-脱氧-d-甘露-2-辛酮糖酸的检测液；

s3、采用液相色谱串联质谱对检测液进行检测；

s4、以3-脱氧-d-甘露-2-辛酮糖酸作为标准品，采用外标法进行脂多糖定量。

进一步地，s1步骤中，纳米材料表面脂多糖提取具体是将0.01-100g纳米材料，用水清洗后分散在1-90％的酚水中，在20-50℃超声0.1-100h后，30-100℃加热1-48h，冷却后离心取上清液，下层酚相加0.1-100ml水，振摇0.5-50min，涡旋0.5-50min，离心后取上清液，合并上清液得到所述的脂多糖提取液。

进一步地，所述的超声的功率为1-100w。

进一步地，所述的水清洗是将纳米材料分散在0.1-1000ml水中，振摇0.5-50min，涡旋0.5-50min，再离心去除上清液，重复清洗2～4次。

进一步地，s2步骤中，酸水解处理具体是：向s1步骤得到的脂多糖提取液中加入0.01％～90％乙酸0.04-400ml，60-200℃水解0.1-48h，离心取上清液(水解脂多糖，得到寡糖链)，向上清液中加入0.1-10mol/l盐酸-甲醇0.04-400ml，40-100℃密封水解2-48h(水解寡糖链，得到kdo)，离心取上清液，氮气吹干，加入甲醇后再次采用氮气吹干(去除盐酸)，复溶于5-15％乙腈-水溶液中得到检测液。

进一步地，s3步骤中，液相色谱的条件为：色谱柱为亲水作用色谱柱，柱温为20-40℃；流速0.05-0.5ml/min；流动相a相为1-100mm甲酸铵水，b相为乙腈。

进一步地，液相色谱的洗脱条件为：洗脱时间0-3min，流动相a保持10％；3-10min，流动相a从10％到50％；10-12min，流动相a保持50％；12-13min，流动相a从50％到10％，13-25min，流动相a保持10％。

进一步地，s3步骤中，质谱的条件为采用电喷雾离子源负离子扫描模式，选择反应监测扫描模式；离子源压力1000-10000v；离子源温度100-500℃；气帘气压力5.0-100.0psi；雾化气压力5.0-100.0psi；辅助加热气压力5.0-100.0psi。

进一步地，所述的反应监测所选择的检测信号的母离子具有262.0-262.2的质荷比，子离子的质荷比为87.0-87.2。

进一步地，s4步骤中，脂多糖定量的具体步骤是：以3-脱氧-d-甘露-2-辛酮糖酸的标准溶液浓度与峰面积线性关系作标准曲线；根据检测液样品测得的峰面积代入标准曲线中，求得3-脱氧-d-甘露-2-辛酮糖酸含量，根据3-脱氧-d-甘露-2-辛酮糖酸含量计算纳米材料表面脂多糖的含量。

本发明的有益效果：

本发明选择细菌脂多糖的特异性水解产物3-脱氧-d-甘露-2-辛酮糖酸作为定量脂多糖的参考物质，采用亲水作用色谱(hilic)柱分离，三重四级杆质谱仪检测，可快速测定3-脱氧-d-甘露-2-辛酮糖酸的含量，进一步测定细菌脂多糖的含量，解决了纳米材料表面脂多糖检测存在假阳性、特异性差等问题，具有较高的准确性和稳定性，且方法简单便捷。

附图说明

图1为3-脱氧-d-甘露-2-辛酮糖酸总离子流图；

图2为本发明实施例1样品3-脱氧-d-甘露-2-辛酮糖酸质谱图；

图3为本发明实施例1样品3-脱氧-d-甘露-2-辛酮糖酸二级质谱图；

图4为3-脱氧-d-甘露-2-辛酮糖酸的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：利用液相色谱串联质谱定量检测脂多糖(lps)标准品

所有细菌的脂多糖都由o-多糖侧链、核心多糖和类脂a三部分组成。其中核心多糖由9-10个糖基组成，包含了lps特有的八碳糖酸(3-去氧-d-甘露-2-辛酮糖酸，kdo)，因此，选用3-去氧-d-甘露-2-辛酮糖酸作为标准品制备标准曲线，并通过将待测样品中的脂多糖提取出来，酸水解为3-去氧-d-甘露-2-辛酮糖酸，通过检测3-去氧-d-甘露-2-辛酮糖酸含量，进而计算纳米材料表面脂多糖的含量。

1.制作标准标准曲线

称取3-脱氧-d-甘露-2-辛酮糖酸标准物并将其配成标准储备液，再将标准储备液用5％的乙腈水逐级稀释，配制0.0764μmol/l、0.191μmol/l、0.382μmol/l、3.82μmol/l、19.1μmol/l、38.2μmol/l的标准溶液，亲水作用色谱串联质谱检测，测得谱图，以3-脱氧-d-甘露-2-辛酮糖酸标准溶液浓度与峰面积线性关系作标准曲线。线性方程为：y＝1×10⁶x-5510.6，相关系数为：r²＝0.9976；其中y为峰面积，x为标准溶液浓度。

2.lps标准品酸水解

取20μg脂多糖标准品(相当于10000eu)于圆底烧瓶中，加入1％～2％乙酸4ml,搭建冷凝装置，于加热套中100℃水解1h，10000r/min离心10min，取上清液(寡糖链)，加入2mol/l盐酸-甲醇4ml,加热85℃密封水解20h，10000r/min离心10min后取上清液，用氮气吹干，加入甲醇后再次氮吹干(去除盐酸)，复溶于400ul10％乙腈-水中。

3.亲水作用色谱串联质谱检测

(1)色谱条件：

色谱条件为：选用zic-hilic(150*2.1mm,5μm)色谱柱；进样量3μl；柱温30℃；流速0.3ml/min；流动相a相为25mm甲酸铵水，b相为乙腈；洗脱时间0-3min，流动相a保持10％；3-10min，流动相a从10％到50％；10-12min，流动相a保持50％；12-13min，流动相a从50％到10％，13-25min，流动相a保持10％。

(2)质谱条件：

采用电喷雾离子源负离子扫描模式(esi-)，选择反应监测扫描模式(srm)；离子源压力(is)5500v；离子源温度(tem)350℃；气帘气压力25.0psi；雾化气压力50.0psi；辅助加热气压力50.0psi。

4.外标法定量

测得样品质谱图峰面积为4106245，代入标准曲线y＝1×10⁶x-5510.6，计算得到3-脱氧-d-甘露-2-辛酮糖酸含量为4.11μmol/l，计算400μl水解液中kdo的总质量为0.4μg。

5.kdo含量与鲎试剂法测定的eu值的换算

鲎试剂法测定20μglps的eu值为10000，根据标准曲线测得20μglps水解后可得到0.4μg,计算得到1ngkdo相当于25eu。

实施例2：利用液相色谱串联质谱定量检测纳米材料表面细菌脂多糖

1.细菌脂多糖的提取

准确称量100mg纳米二氧化硅样品于离心管中，添加50000eu的lps标准品，加入2ml蒸馏水，振摇1min，涡旋3min，再8000r/min离心10min，去除上清液，重复3次，再分散在45％的酚水中30℃超声0.2h后，移入圆底烧瓶中，使用加热套65℃加热6h，冷却后移入离心管中，8000r/min离心10min，取上层清液，下层酚相加2ml蒸馏水，振摇1min，涡旋3min，80000r/min离心10min取上清液，合并上清液为细菌脂多糖的提取液。

2.细菌脂多糖提取液酸水解

取细菌脂多糖提取液于圆底烧瓶中，加入1％～2％乙酸4ml,搭建冷凝装置，于加热套中100℃水解1h，10000r/min离心10min，取上清液(寡糖链),加入2mol/l盐酸-甲醇4ml,加热85℃密封水解20h，10000r/min离心10min后取上清液，用氮气吹干，加入甲醇后再次氮吹干(去除盐酸)，复溶于400ul10％乙腈-水中。

3.亲水作用色谱串联质谱检测

色谱、质谱条件与实例1相同。

4.外标法定量

测得样品质谱图峰面积为12605681，代入标准曲线y＝1×10⁶x-5510.6，计算得到3-脱氧-d-甘露-2-辛酮糖酸含量为12.61μmol/l，400ul水解液中kdo的总量为1.227μg。

5.eu值换算

测得样品中kdo的量为1.227μg,而1ngkdo相当于25eu,由此计算得到纳米材料中lps的量为30675eu。

6.回收率计算

本实施例纳米材料中添加lps的量为50000eu,而通过我们的方法测得的值为30657eu，计算得到lps的回收率为61.31％。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。