SARS-COV-2Spike蛋白在新冠肺炎检测中的应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
领域，更具体地，涉及sars-cov-2spike蛋白在新冠肺炎检测中的应用。
背景技术：
：冠状病毒粒子呈不规则形状，直径约60-220nm。病毒粒子外包脂肪膜(膜表面有三种糖蛋白)，小包膜糖蛋白(envelopeprotein，较小，与包膜结合的蛋白)和膜糖蛋白(membraneprotein，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成)。病毒的膜蛋白主要有表面的棘突蛋白(spike蛋白，s)和膜(membrane，m)，spike蛋白是一种糖蛋白，主要作用于细胞粘附和细胞膜融合，在许多哺乳动物体内，s被furin酶或其他酶酶解为s1和s2。其中s1上有受体附着位点，s2主要体现融合活性。冠状病毒可以结合多种细胞受体，其中血管紧张素转换酶2(ace2)作为一种肽酶是细胞表面冠状病毒的受体之一，sars-cov-2(2019-ncov)的spike蛋白(结构如图1所示)与人ace2相互作用来感染人的呼吸道上皮细胞。s1内有一部分区域与ace2紧密结合，被称之为受体结合域(rbd)，是病毒和受体相互作用的关键因素。spike蛋白可通过rbd的基因重组或突变可以实现不同宿主间传播，并导致较高致死率。且rbd包含重要的病毒中和表位，对提高免于抗体应答十分关键。对rbd及s1区的研究，有助于设计病毒疫苗和开发新的抗冠状病毒药物。技术实现要素：本发明的目的在于提供sars-cov-2spike蛋白在新冠肺炎检测中的应用。本发明建立了重组sars-cov-2spike(s1)蛋白hek293细胞，制备了重组sars-cov-2spike(s1)蛋白，进一步将构建的sars-cov-2spike(s1)基因的真核表达载体pcdna3.1(+)-sars-cov-2spike(s1)转染hek293细胞，获得稳定、高表达sars-cov-2spike(s1)分子的hek293细胞株，并将sars-cov-2spike(s1)重组蛋白应用于免疫层析检测试剂的研制。本发明使用sars-cov-2spike(s1)重组抗原作为标记材料，并应用于金标免疫层析系统，该检测体系为直接标记捕获，与以原核表达的sars-cov-2np重组蛋白为包被的igm/igg检测产品相比较，灵敏度和特异性均较大幅度的提高。本发明的第一目的在于提供sars-cov-2的spike蛋白在制备新冠肺炎检测试剂盒中的应用。本发明的第二目的在于提供sars-cov-2的spike蛋白的s1蛋白亚基在制备新冠肺炎检测试剂盒中的应用。本发明的第三目的在于提供一种新冠肺炎检测试剂盒。本发明的第四目的在于提供所述的试剂盒的制备方法。本发明的第五目的在于提供所述的编码基因、重组载体、和/或重组细胞在制备新冠肺炎检测试剂盒中的应用。本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：本发明在哺乳动物hek293细胞表达重组sars-cov-2(2019-ncov)的spike蛋白确保蛋白properfolding、充分的糖基化，适用于基础研究、诊断和疫苗的开发。重组sars-cov-2(2019-ncov)的spike(s1)蛋白antigen，包括2019-ncovspike蛋白的n-末端(残基3-687)。这个抗原包含一个histag标签为了方便表达和纯化，为后续开展的诊断、疫苗以及抗病毒抗体和药物的研究奠定了基础。本发明要求保护以下内容：sars-cov-2的spike蛋白在制备新冠肺炎检测试剂盒中的应用。优选地，所述试剂盒为免疫检测试剂盒，sars-cov-2的spike蛋白为捕获抗原。sars-cov-2的spike蛋白的s1蛋白亚基(sars-cov-2spike(s1))在制备新冠肺炎检测试剂盒中的应用。优选地，所述试剂盒为免疫检测试剂盒，sars-cov-2的的s1蛋白亚基为捕获抗原。一种新冠肺炎检测试剂盒，所述试剂盒为胶体金检测试纸，由吸水垫3、nc膜2、金标结合垫4、样品垫5和pc衬板1组成；所述nc膜包被有质控线c线和检测线t1线、t2线，c线为兔抗sars-cov-2spike(s1)重组抗原抗体，t1线为抗人igg单抗，t2线为抗人igm单抗；所述nc为sartoriuscn140；所述金标结合垫为吸附有胶体金标记的sars-cov-2的spike蛋白的s1蛋白亚基；所述胶体金标记的sars-cov-2的spike蛋白的s1蛋白亚基，胶体金颗粒平均直径为40nm。所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：核苷酸序列seqidno图3所示编码基因连接入表达载体得到重组载体，重组载体转染细胞德奥重组细胞，重组细胞表达得到sars-cov-2的spike蛋白的s1蛋白亚基；sars-cov-2的spike蛋白的s1蛋白亚基与40nm胶体金偶联后吸附于金标结合垫；nc膜包被c线包被兔抗sars-cov-2spike(s1)重组抗原抗体，t1线包被抗人igg单抗，t2线包被抗人igm单抗；吸水垫3、nc膜2、金标结合垫4和样品垫5依次固定于pc衬板1表面。优选地，所述表达载体为pcdna3.1(+)，所述细胞为hek293，插入片段的核苷酸序列seqidno:2所示。前文中所述的编码基因、重组载体、和/或重组细胞在制备新冠肺炎检测试剂盒中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1、本发明构建了sars-cov-2spike(s1)的真核表达载体pcdna3.1(+)-sars-cov-2spike(s1)，蛋白序列与sars-cov-2s(genbank:mn908947.3)的sars-cov-2spike(s1)除c端添加四个作为linker的柔性氨基酸和6个组氨酸、n端删除一个苯丙氨酸外，其余的氨基酸完全一致，氨基酸序列seqidno:1所示；pcdna3.1(+)-sars-cov-2spike(s1)载体脂质体法转染hek293细胞，经过筛选获得了获得稳定、高表达sars-cov-2spike(s1)蛋白的重组hek293细胞株。2、hek293细胞为原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(ad5)dna的永生化细胞，是载体构建理想的工具细胞；所得重组hek293-sars-cov-2spike(s1)细胞经过检测sars-cov-2spike(s1)得到稳定高表达。3、选择sars-cov-2spike(s1)重组抗原作为标记材料，并应用于金标免疫层析系统，该检测体系为直接标记捕获，与以原核表达的sars-cov-2np重组蛋白为包被的igm/igg检测产品相比较，灵敏度和特异性均较大幅度的提高，为临床提供一种既快速又能准确检测新冠肺炎igm/igg的新方法，为诊断新冠肺炎感染提供帮助，具有良好的市场前景。本发明建立了重组sars-cov-2spike(s1)蛋白hek293细胞，制备了重组sars-cov-2spike(s1)蛋白，进一步将构建的sars-cov-2spike(s1)基因的真核表达载体pcdna3.1(+)-sars-cov-2spike(s1)转染hek293细胞，获得稳定、高表达sars-cov-2spike(s1)分子的hek293细胞株，并将sars-cov-2spike(s1)重组蛋白应用于免疫层析检测试剂的研制。本发明使用sars-cov-2spike(s1)重组抗原作为标记材料，并应用于金标免疫层析系统，该检测体系为直接标记捕获，与以原核表达的sars-cov-2np重组蛋白为包被的igm/igg检测产品相比较，灵敏度和特异性均较大幅度的提高。附图说明图1为sars-cov-2spike蛋白结构。图2为表达的sars-cov-2spike(s1)蛋白氨基酸序列。图3为全合成的密码子优后的sars-cov-2spike(s1)基因序列。图4为pcdna3.1(+)载体的质粒图谱。图5为pcdna3.1(+)-sars-cov-2spike(s1)载体kpni和xbai酶切产物进行琼脂糖电泳检测结果，结果显示2道为重组表达载体pcdna3.1(+)-sars-cov-2spike(s1)经酶切后可以看到两条带，上面一条为5400bp的pcdna3.1(+)，下面一条是大小为2100bp的sars-cov-2spike(s1)基因，而3道对照的空载体pcdna3.1(+)经酶切后只看见一条5400bp的条带。图6为经质粒pcdna3.1(+)-sars-cov-2spike(s1)转化hek293-sars-cov-2spike(s1)细胞的sars-cov-2spike(s1)表达平的westernblot印迹检测图，结果显示质粒pcdna3.1(+)-sars-cov-2spike(s1)转化的四个阳性克隆1、2、3、5道在特定位置都有强的显色，4道的对照空白质粒转化的克隆未见显色.图7为重组sars-cov-2spike(s1)经纯化收集样品的sds-page电泳图。图8为组装好的新冠肺炎igm/igg金标层析检测试剂。图9为新冠肺炎抗体免疫层析试剂检测示意图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1真核表达载体pcdna3.1(+)-sars-cov-2spike(s1)的构建a、密码子优化，基因合成及克隆载体构建采用哺乳动物细胞优势密码子反向翻译sars-cov-2spike(s1)的氨基酸序列图2，获得由哺乳动物细胞优势密码子组成的sars-cov-2spike(s1)基因序列，其核苷酸序列seqidno:2所示。根据sars-cov-2s基因(genbank:mn908947.3)，采取全基因合成方法，委托通用生物系统(安徽)有限公司合成全基因，并在其5′和3′端分别加上ggtacc和tctaga以分别获得内切酶kpnⅰ和xbai的酶切识别位点，序列长度2112bp，将密码子替换成上面获得的哺乳动物细胞偏爱密码子，其核苷酸序列seqidno:2所示，连接在pgem-tvector(promega公司产品)载体上，获得了sars-cov-2spike(s1)和histag融合蛋白全基因序列，其基因序列如图3所示。b、重组表达载体构建以pcdna3.1(+)(invitrogen公司产品，其质粒图谱，如图4所示)为基础载体，选择kpni和xbai酶切位点作为连接外源基因的多克隆位点和表达克隆载体酶切鉴定位点，制备重组表达载体构建。具体步骤为：将上述步骤获得的含了sars-cov-2spike(s1)基因质粒载体1μg用限制性内切酶kpni/xbai进行双酶切，酶切产物与用同样酶切的1μg载体pcdna3.1(+)，经1％琼脂糖电泳，且胶回收目的片段和载体片段。1％琼脂糖电泳检测回收片段的量，按相对分子数目的片段：载体片段＝4:1混合，加入5μt4连接酶16℃连接过夜。取5μl连接产物转化100μl预制好的dh5α感受态细胞，涂布抗性lb平板，37℃倒置培养过夜。挑选含有阳性质粒的克隆，将得到的含有sars-cov-2spike(s1)的重组表达载体对的克隆命名为pcdna3.1(+)-sars-cov-2spike(s1)。c、重组表达载体的酶切鉴定将待鉴定含重组表达载体pcdna3.1(+)-sars-cov-2spike(s1)克隆小量培养，碱法快速抽提质粒，用限制性内切酶kpni/xbai进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳检测，结果如图5所示。其中泳道2为重组表达载体pcdna3.1(+)-sars-cov-2spike(s1)酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果，说明真核表达载体pcdna3.1(+)-sars-cov-2spike(s1)构建成功。实施例2pcdna3.1(+)-sars-cov-2spike(s1)表达载体转染hek293细胞及培养a、采用脂质体2000将质粒转入hek293细胞(脂质体2000购自美国gibco，invitrogen公司，按照脂质体2000试剂盒说明书操作)，dmem培养基(dulbecco′smodifiedeaglemedia)加g418浓度600ng/ml筛选14天，挑取g418抗性单克隆传代培养，将调整g418浓度调整为300ng/ml，dmem培养基筛选培养，得到pcdna3.1(+)-sars-cov-2spike(s1)阳性转染的克隆。b、重组蛋白的western印迹鉴定收集阳性克隆细胞用sds-pageloadingbuffer重悬后，开水煮10min，10000rpm离心10min，上清经sds-page电泳分离，用半干转移系统将蛋白转印到pvdf膜上，依次经10g/lbsa封闭，4℃过夜，加入rabbitantisarsspiken-term(meridianlifescience公司产品，1:2000)，37℃作用1h，pbs彻底洗涤后，再与hrp标记的羊抗兔igm/igg(二抗，1:2000)相互作用，37℃，1h，pbs充分洗涤后经dab显色。以空载体转染的细胞作为阴性对照，对表达产物进行western印迹鉴定。结果如图6所示：泳道1、2、3和5为随机挑选的4个pcdna3.1(+)-sars-cov-2spike(s1)转化hek293的阳性克隆，3道为对照质粒pcdna3.1(+)转化hek293细胞的阳性克隆。取上述实施的、经western印迹鉴定阳性的细胞克隆，用胰酶消化，加入新鲜的dmem培养基制成细胞悬液后细胞计数。根据细胞计数结果稀释细胞悬液至浓度为1×104/ml，每25ml小瓶接种1ml细胞悬液，共接种30瓶细胞。5％co2，37℃培养箱培养48h，3000g，5min离心收获细胞，放于-80℃保存。实施例3hek293-sars-cov-2spike(s1)蛋白的分离纯化a、由于实施例1构建的重组表达载体pcdna3.1(+)-sars-cov-2spike(s1)上带有融合标签(his·tag)的基因序列，所以表达出的目的蛋白上也带有his·tag标签。因此，利用络合ni的琼脂糖通过亲和层析法可以进行目的蛋白的纯化，亲和层析柱购于gehealthcare公司。取实施例2制备的收获的冻存细胞，用预冷的细胞裂解液裂解用buffera(20mmtris，0.5mnaclph8.0)重悬，150w超声裂解10次，每次5s，间歇10s，4℃条件下12000rpm/min离心20min收集上清准备上样。具体纯化步骤如下：用buffera平衡ni柱至od280读数恒定；收集的样品滤过上清上柱；用含有40mm咪唑的buffera过柱淋洗去掉杂蛋白；d、用含有300mm咪唑的buffera缓慢过柱，将纯化的目的蛋白收集到离心管中；e、取纯化后的目的蛋白进行sds-page，观察，目的蛋白的纯化效果。图7为纯化的sars-cov-2spike(s1)sds-page蛋白电泳图；其中，泳道1为15.0kda～250.0kda的蛋白质分子量标准，泳道2为样品纯化后的sars-cov-2spike(s1)sds-page检测结果。实施例4新冠肺炎检测试剂制备使用实施例3制备的sars-cov-2spike(s1)重组蛋白抗原作为标记材料，并应用于金标免疫层析系统，该检测体系为直接标记捕获。一、胶体金的制备取1ml2％氯金酸(haucl4)溶液，加入到100ml水中，加热至沸，再加入1.5ml2％柠檬酸三钠，继续煮沸5分钟，直到颜色不再发生变化，此时制得的胶体金颗粒为40nm。二、金标制备1、抗原稀释取一定量的实施例3制备的sars-cov-2spike(s1)重组抗原，用ph值8.0，0.1m浓度的pb缓冲液稀释至1mg/ml，4℃保存备用。2、抗原偶联取250ml制备好的40nm胶体金，用0.2m的k2co3溶液调节ph至8.0，然后加入2.5ml上述稀释至1.0mg/ml的重组抗原，磁力搅拌器上搅拌0.5小时，然后按2％的比例加入10％bsa，继续搅拌0.5小时。3、金标工作液的制备将上述已经偶联好抗原的胶体金溶液离心(10000rpm，15分钟)，弃去上清液，保留沉淀。沉淀用含20％蔗糖的金标稀释液(0.02mtris+1％bsa，ph8.0)复溶至10ml，4℃保存备用。4、金标条的制备取上述金标工作液10ml，上样到喷金机，设定参数选取喷量为1.5μl/cm。打开气泵，待气压稳定后，启动喷金机，将金标工作液均匀喷到30cm×8.5cm的金标垫上。将喷好金标工作液的金标垫放入37℃恒温箱内干燥12～24小时后取出，按8mm宽度切好金标条放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋中，常温保存备用。三、nc膜的选择选取市场上使用率较高的三家公司的nc膜：pallvivid170、yn120b、sartoriuscn140，规格均为2.5×30cm，带背衬，孔径为8um，进行对比，要求膜各点的宽度与厚度均一；跑水性能符合要求：4cmnc膜层析的时间在100s～140s，且无倾斜和空白；性能测试符合要求：将三种nc膜分别包被1.0mg/ml的鼠抗人igg并配对相应的金标条，测试一份阴性样本、一份临界阴性样本(要求3～5分钟显色)以及一份临界阳性样本(要求5分钟之内显色)。表1(注：“-”表示阴性结果；“+”表示阳性结果；“+/-”表示不明显阴性结果)测试结果图如表1所示，结果显示：sartoriuscn140符合预期要求，因此选择sartoriuscn140作为新冠肺炎抗体检测试剂盒的生产用nc膜。四、nc膜的包被1、兔抗sars-cov-2spike(s1)重组抗原抗体、鼠抗人igm单抗与鼠抗人igg单抗稀释将一定量的抗sars-cov-2spike(s1)重组抗原抗体(北京义翘神州公司产品)，用0.01mpbs(含3％海藻糖，ph7.4)，稀释至终浓度1.0mg/ml，4℃保存备用。将一定量的鼠抗人igm单抗(igm-mab)(杭州隆基生物公司产品)，用0.01mpbs(含3％海藻糖，ph7.4)，稀释至终浓度1.0mg/ml，4℃保存备用。将一定量的鼠抗人igg单抗(igg-mab)(杭州隆基生物公司产品)，用0.01mpbs(含3％海藻糖，ph7.4)，稀释至终浓度1.0mg/ml，4℃保存备用。2、兔抗sars-cov-2spike(s1)重组抗原抗体、鼠抗人igm单抗与鼠抗人igg单抗包被将上述1.0mg/ml的兔抗sars-cov-2spike(s1)重组抗原抗体、鼠抗人igm单抗与鼠抗人igg单抗上样到点膜机的工作液柱中，设定参数，选择喷量为1.0μl/cm。调整划膜头的位置。启动点膜机，将溶液分别包被到nc膜上的c线、t1和t2的位置。将包被好点膜工作液的nc膜放入37℃恒温箱内干燥12～24小时后取出，放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋中，常温保存备用。五、样品垫的制备将玻璃纤维素膜切割成17×300mm的规格，按3.5ml/条用玻纤处理液(表2)处理，放入37℃恒温箱内干燥12～24小时后取出，放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋中，常温保存做样品垫备用。表2玻纤处理液配方物料含量tris10mmpvp-101％鼠抗rbc单抗0.1mg/ml六、试剂条的组装如图8所示，将制备好的nc膜2、金标条4、样品垫5以及吸水垫3分别粘贴到pvc板1上，然后切割成4.0mm条，该pvc板首尾两端为样品垫5及吸水垫3。如有需要，将图7的试剂条压入对应检测试剂模具即可用于检验。七、试纸条及其使用和结果判定方法1、组成由吸水垫3、nc膜2、金标结合垫4、样品垫5和pc衬板1组成；所述nc膜包被有质控线c线和检测线t1线、t2线，c线为兔抗sars-cov-2spike(s1)重组抗原抗体，t1线为抗人igg单抗，t2线为抗人igm单抗；所述nc为sartoriuscn140；所述金标结合垫为吸附有胶体金标记的sars-cov-2的spike蛋白的s1蛋白亚基(实施例3制备得到)；所述胶体金标记的sars-cov-2的spike蛋白的s1蛋白亚基，胶体金颗粒平均直径为40nm。2、使用方法将组装好的试纸条平放于工作台面，用一次性吸管吸取一滴全血/或血清/或血浆(约10μl)滴加到试剂条的样品孔中(样品垫上)(图9中s孔)，滴加两滴buffer(0.01mpbs+2％casein)，计时10～15分钟，进行检测结果判定：试剂条检测窗口的c线位置出现显色条带，t1线和t2线位置均未出现显色条带表示检测结果为阴性。c线位置出现显色条带，同时t1线位置出现显色条带表示新冠肺炎igm抗体阳性，t2线位置出现显色条带表示新冠肺炎igg抗体阳性。如果c线位置不出现条带，t1和/或t2线位置有条带出现/或无显色条带出现皆判定检测结果为无效检测。试剂条使用方法示意及结果判定如图9所示。实施例5新冠肺炎检测试剂的检测应用及结果实施例4制备的检测试剂盒(试纸条)适用于新冠肺炎抗体的检测，该试剂盒已进行了55例新冠肺炎确诊患者的临床检测。抗体(igm和/或igg)检测阳性率达到98.18％，而对398名健康人检测中无一阳性，显示出了良好的敏感性和特异性，并实现对新冠肺炎患者全周期管理。结果显示，该新冠肺炎igm/igg免疫层析试剂与其他病原微生物(肺炎衣原体、肺炎支原体、腺病毒等)引起的呼吸系统感染患者血清及高血压、糖尿病患者血清无交叉反应，与含有人冠状病毒229e、人冠状病毒nl63、人冠状病毒hku1抗体样本无交叉反应。与含有mers-cov抗体以及sars-cov抗体样本均可发生交叉反应，可以同时应用于sars和mers既往感染的筛查。对比例：使用原核表达的sars-cov-2np重组蛋白为包被的igm/igg检测产品与本实施例4制备的试剂盒检测同一批样本。检测结果如表3所示。注：自制的n蛋白为包被的新冠肺炎igg/igm检测试剂的制备步骤与实施例4相同，仅sars-cov-2spike(s1)重组抗原替换为重组sars-cov-2n蛋白(杭州博森生物公司产品)结果显示本发明制备得到的试剂盒与相比较，灵敏度和特异性均较大幅度的提高。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。序列表<110>杭州泰熙生物技术有限公司<120>sars-cov-2spike蛋白在新冠肺炎检测中的应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>696<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1metvalpheleuvalleuleuproleuvalserserglncysvalasn151015leuthrthrargthrglnleuproproalatyrthrasnserphethr202530argglyvaltyrtyrproasplysvalpheargserservalleuhis354045serthrglnaspleupheleuprophepheserasnvalthrtrpphe505560hisalailehisvalserglythrasnglythrlysargpheaspasn65707580provalleupropheasnaspglyvaltyrphealaserthrglulys859095serasnileileargglytrpilepheglythrthrleuaspserlys100105110thrglnserleuleuilevalasnasnalathrasnvalvalilelys115120125valcysglupheglnphecysasnasppropheleuglyvaltyrtyr130135140hislysasnasnlyssertrpmetgluserglupheargvaltyrser145150155160seralaasnasncysthrpheglutyrvalserglnpropheleumet165170175aspleugluglylysglnglyasnphelysasnleuargglupheval180185190phelysasnileaspglytyrphelysiletyrserlyshisthrpro195200205ileasnleuvalargaspleuproglnglypheseralaleuglupro210215220leuvalaspleuproileglyileasnilethrargpheglnthrleu225230235240leualaleuhisargsertyrleuthrproglyaspsersersergly245250255trpthralaglyalaalaalatyrtyrvalglytyrleuglnproarg260265270thrpheleuleulystyrasngluasnglythrilethraspalaval275280285aspcysalaleuaspproleusergluthrlyscysthrleulysser290295300phethrvalglulysglyiletyrglnthrserasnpheargvalgln305310315320prothrgluserilevalargpheproasnilethrasnleucyspro325330335pheglygluvalpheasnalathrargphealaservaltyralatrp340345350asnarglysargileserasncysvalalaasptyrservalleutyr355360365asnseralaserpheserthrphelyscystyrglyvalserprothr370375380lysleuasnaspleucysphethrasnvaltyralaaspserpheval385390395400ileargglyaspgluvalargglnilealaproglyglnthrglylys405410415ilealaasptyrasntyrlysleuproaspaspphethrglycysval420425430ilealatrpasnserasnasnleuaspserlysvalglyglyasntyr435440445asntyrleutyrargleuphearglysserasnleulyspropheglu450455460argaspileserthrgluiletyrglnalaglyserthrprocysasn465470475480glyvalgluglypheasncystyrpheproleuglnsertyrglyphe485490495glnprothrasnglyvalglytyrglnprotyrargvalvalvalleu500505510serphegluleuleuhisalaproalathrvalcysglyprolyslys515520525serthrasnleuvallysasnlyscysvalasnpheasnpheasngly530535540leuthrglythrglyvalleuthrgluserasnlyslyspheleupro545550555560pheglnglnpheglyargaspilealaaspthrthraspalavalarg565570575aspproglnthrleugluileleuaspilethrprocysserphegly580585590glyvalservalilethrproglythrasnthrserasnglnvalala595600605valleutyrglnaspvalasncysthrgluvalprovalalailehis610615620alaaspglnleuthrprothrtrpargvaltyrserthrglyserasn625630635640valpheglnthrargalaglycysleuileglyalagluhisvalasn645650655asnsertyrglucysaspileproileglyalaglyilecysalaser660665670tyrglnthrglnthrasnserproargargalaargservalglygly675680685serglyhishishishishishis690695<210>2<211>2112<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggtaccatggtgttcctggtgctgctgcccctggtgtcctcccagtgcgtgaacctgacc60acccgcacccagctgccccccgcctacaccaactccttcacccgcggcgtgtactacccc120gacaaggtgttccgctcctccgtgctgcactccacccaggacctgttcctgcccttcttc180tccaacgtgacctggttccacgccatccacgtgtccggcaccaacggcaccaagcgcttc240gacaaccccgtgctgcccttcaacgacggcgtgtacttcgcctccaccgagaagtccaac300atcatccgcggctggatcttcggcaccaccctggactccaagacccagtccctgctgatc360gtgaacaacgccaccaacgtggtgatcaaggtgtgcgagttccagttctgcaacgacccc420ttcctgggcgtgtactaccacaagaacaacaagtcctggatggagtccgagttccgcgtg480tactcctccgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtcccagcccttcctgatggacctg540gagggcaagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgttcaagaacatcgacggc600tacttcaagatctactccaagcacacccccatcaacctggtgcgcgacctgccccagggc660ttctccgccctggagcccctggtggacctgcccatcggcatcaacatcacccgcttccag720accctgctggccctgcaccgctcctacctgacccccggcgactcctcctccggctggacc780gccggcgccgccgcctactacgtgggctacctgcagccccgcaccttcctgctgaagtac840aacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggactgcgccctggaccccctgtccgagacc900aagtgcaccctgaagtccttcaccgtggagaagggcatctaccagacctccaacttccgc960gtgcagcccaccgagtccatcgtgcgcttccccaacatcaccaacctgtgccccttcggc1020gaggtgttcaacgccacccgcttcgcctccgtgtacgcctggaaccgcaagcgcatctcc1080aactgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgcctccttctccaccttcaagtgc1140tacggcgtgtcccccaccaagctgaacgacctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcc1200ttcgtgatccgcggcgacgaggtgcgccagatcgcccccggccagaccggcaagatcgcc1260gactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgcgtgatcgcctggaactccaac1320aacctggactccaaggtgggcggcaactacaactacctgtaccgcctgttccgcaagtcc1380aacctgaagcccttcgagcgcgacatctccaccgagatctaccaggccggctccaccccc1440tgcaacggcgtggagggcttcaactgctacttccccctgcagtcctacggcttccagccc1500accaacggcgtgggctaccagccctaccgcgtggtggtgctgtccttcgagctgctgcac1560gcccccgccaccgtgtgcggccccaagaagtccaccaacctggtgaagaacaagtgcgtg1620aacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgaccgagtccaacaagaagttc1680ctgcccttccagcagttcggccgcgacatcgccgacaccaccgacgccgtgcgcgacccc1740cagaccctggagatcctggacatcaccccctgctccttcggcggcgtgtccgtgatcacc1800cccggcaccaacacctccaaccaggtggccgtgctgtaccaggacgtgaactgcaccgag1860gtgcccgtggccatccacgccgaccagctgacccccacctggcgcgtgtactccaccggc1920tccaacgtgttccagacccgcgccggctgcctgatcggcgccgagcacgtgaacaactcc1980tacgagtgcgacatccccatcggcgccggcatctgcgcctcctaccagacccagaccaac2040tccccccgccgcgcccgctccgtgggcggctccggccaccaccaccaccaccactaatct2100agataatctaga2112当前第1页12