一种灵敏检新型冠状病毒抗体的增敏型免疫层析试剂盒的制作方法

本发明涉及免疫层析分析技术领域，具体涉及一种灵敏检新型冠状病毒抗体的增敏型免疫层析试剂盒，其技术原理为双抗原夹心法。

背景技术：

胶体金免疫层析试纸条因其简单、快速、方便以及裸眼检测已被广泛应用于临床诊断、食品安全检测以及环境监控等领域。传统胶体金免疫层析试纸条主要采用粒径为20～40nm胶体金作为信号探针，然而由于其较小的粒径导致其比色信号强度相对偏弱，进而导致其检测灵敏度偏低。相对较低的检测灵敏度在一定程度上局限了其在超灵敏检测中的应用。近些年，随着纳米科学和技术的快速发展，各种各样的新型纳米材料如荧光微球、量子点、量子点微球、上转换荧光纳米粒子、碳纳米材料以及磁性材料已经被报道可用于替代胶体金作为检测探针提高传统免疫层析试纸条的检测灵敏度，但这些纳米探针的合成相对复杂，价格昂贵很难被市场推广使用。相对于这些新型纳米材料，胶体金因其合成简单、易修饰、生物相容性好、光学性质稳定以及易读取等优势一直以来在免疫层析试纸条占据主要的位置，特别是在商业化生产中，其市场占有率达90％以上。因此，如何提高传统胶体金免疫层析试纸条的检测灵敏度对于进一步拓展其在超灵敏检测中的应用具有重要意义。

基于试纸条检测线信号放大策略因无需合成额外的辅助信号放大材料，因而得到了科研工作者的广泛关注。该类策略主要包括以下几类：1)双金信号放大技术：在传统胶体金免疫层析试纸条的基础上，通过引入信号扩增金标垫，其可以借助抗原抗体反应和生物素-链霉亲和素系统等特异性地在检测线结合金标抗体偶联物，导致胶体金纳米粒子的进一步聚集，从而放大胶体金的比色信号，如专利cn102507929a；2)酶增强技术：在传统胶体金免疫层析试纸条的基础上，通过引入辣根过氧化物酶或具有过氧化物酶活性的纳米酶催化氧化相应的底物如四甲基联苯胺(tmb)等生成有色的沉淀物沉积于检测线，从而使胶体金的比色信号得到放大；3)金或银染增强技术：在传统胶体金免疫层析试纸条的基础上，当还原剂存在的情况下，金或银离子容易以胶体金为核心，聚集在胶体金表面还原成金或银原子，使纳米级大小的胶体金通过金或银离子的聚集和还原生长为更大的颗粒，从而使胶体金的比色信号得到放大，如专利cn102135536a。前两种方法由于需要对胶体金探针进行双标记，往往容易影响胶体金探针的免疫性能，导致方法学稳定性差。金或银染增强技术中金属纳米壳层的生长属于层层生长模式，其生长速率不仅与试纸条t、c线上金纳米粒子数量有关，而且与生长液的浓度以及生长时间密切相关，导致生长过程不可控，检测结果的稳定性和重现性差，大大限制了该方法在实践中的推广应用。此外这些方法提高检测灵敏度的能力是有限的，仅为1～2个数量级。因此增敏后的胶体金免疫层析试纸条依然无法实现低浓度待检物的超灵敏检测。本发明提出使用聚合物介导可控铜生长技术显著增强试纸条检测线上胶体金探针的光学信号强度，条带颜色呈现从无到有、从弱到强的变化，可实现超低目标物浓度下的裸眼定性检测。经检索未见有采用可控铜生长技术增敏传统胶体金免疫层析试纸条检测灵敏度的公开文献报道。

技术实现要素：

本发明的目的是本发明旨在针对现有胶体金免疫层析试纸条因其20～40nm胶体金探针信号强度偏弱导致检测灵敏度偏低的现状缺陷，使用聚合物介导胶体金探针表面可控铜生长沉积显著放大试纸条检测线上胶体金探针的光学信号强度，提供了一种提高传统胶体金免疫层析方法检测灵敏度的新技术，实现对超低浓度目标检测物进行现场快速检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种灵敏检新型冠状病毒抗体的增敏型免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括胶体金免疫层析试纸条和铜生长液，胶体金免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次固定于pvc塑料底板上，所述结合垫为喷涂有胶体金标记的新型冠状病毒(sars-cov-2)重组抗原和胶体金标记的兔igg抗体的玻璃纤维膜，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，检测线上包被有sars-cov-2重组抗原，质控线上包被有抗兔二抗溶液；所述铜生长液包括铜生长a液和铜生长b液，铜生长a液为聚合物和二价铜离子预先形成铜离子配位生长液，铜生长b液为抗坏血酸钠和柠檬酸三钠混合溶液。

本发明还提供了一种灵敏检新型冠状病毒抗体的增敏型免疫层析试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)胶体金标记的重组抗原的制备：取1ml粒径为30～40nm柠檬酸包被胶体金溶液，用浓度0.2m的碳酸钾溶液调节该溶液的ph值至7.0～8.0；向溶液加入5μl浓度为1～2mg/mlsars-cov-2重组抗原溶液，室温下振荡反应30min；然后再将100μl1～2mg/ml牛血清白蛋白溶液加至上述混合溶液中继续于室温下振荡反应30min；在4℃条件下，于10000rpm离心20min，弃上清，沉淀物复溶于0.01mph7.4磷酸盐缓冲溶液(pbs)，得终产物胶体金标记的重组抗原；胶体金标记兔igg抗体采用相同的方法完成，将sars-cov-2重组抗原溶液替换成兔igg抗体溶液。

2)胶体金免疫层析试纸条的制备：a)结合垫的制备是将胶体金标记的重组抗原和胶体金标记的兔igg抗体喷涂于玻璃纤维膜上；b)具有检测线和质控线的硝酸纤维膜的制备是将浓度为1～2mg/mlsars-cov-2重组抗原和浓度为1～2mg/ml抗兔二抗溶液分别喷涂硝酸纤维膜上绘制两条线平行线，sars-cov-2重组抗原溶液划线作为检测线(t线)，抗兔二抗溶液划线为质控线(c线)；c)胶体金免疫层析试纸条组装：将样品垫、具有金标检测抗体的结合垫、具有t和c线的硝酸纤维膜和吸水纸分别依次粘贴到塑料衬板上，相邻重叠部分的长度为2mm，切割成4mm宽的试纸条，密封干燥，于温度保存；

3)铜生长液的配置：a)铜生长a液：准确称取200～400mg氯化铜和100～200mg聚合物分别溶解于10ml超纯水中，然后将二者混均制备得铜生长a液；b)铜生长b液：准确称取1～2g抗坏血酸钠和1mg柠檬酸三钠分别溶解于10ml和1ml超纯水中，然后将二者混均制备得铜生长b液。

进一步地，所述聚合物为聚乙烯亚胺pei、聚丙烯酸paa、聚乙烯吡咯烷酮pvp或聚赖氨酸pl。

本发明还提供了一种灵敏检新型冠状病毒抗体的增敏型免疫层析试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)取100～120μl待测样品溶液加入到试纸条的检测卡加样孔中，于室温反应5～10min；

2)将上述反应后的试纸条依次使用磷酸盐缓冲液和超纯水洗涤后，浸泡于铜生长a液中室温反应5min；

3)接着将试纸条转移至铜生长b液中继续反应2min，使聚合物介导铜纳米壳层可控生长沉积至胶体金表面，显著增强胶体金的光学信号强度，肉眼观察实验结果。

本发明适用于疾病相关抗原及抗体标志物的超灵敏检测，所述的疾病相关标志物包括：肿瘤标志物如癌胚抗原、前列腺特异性抗原、甲胎蛋白；炎症标志物如c反应蛋白、降钙素原、白介素6；心肌标志物如肌钙蛋白、肌红蛋白、n末端心房利钠肽及n末端脑利钠肽；传染病标志物如新型冠状病毒抗原及抗体、艾滋病病毒抗原及抗体、埃博拉病毒抗原及抗体、中东呼吸综合征冠状病毒抗原及抗体、乙肝病毒相关抗原及抗体；病原体如病毒、致病菌等，特别是适合于待检物的现场快速超灵敏检测。样品处理按照常规处理方法即可。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明是在传统胶体金免疫层析试纸条的基础上，采用聚合物介导可控铜生长信号放大技术既提高了胶体金免疫层析试纸条的检测灵敏度，也保留了其特异性强的特点。

2、本发明所采用的聚合物介导可控铜生长信号放大技术涉及胶体金探针表面聚合物介导下抗坏血酸钠诱导二价铜离子的可控还原沉积。其原理为将完成常规检测后的胶体金试纸条依次浸泡于铜生长a液和b液，此时预吸附的铜离子被还原成铜单质沉积在胶体金探针表面并实现信号增强。该方案中被还原沉积在检测区域的铜纳米粒子数量与预吸附的铜离子数量有关，而预吸附的铜离子数量只与试纸条检测区域的胶体金探针数目有关，因而可实现铜纳米粒子可控生长。相较于传统的金银生长增敏型试纸条，该方法灵敏度更高、检测结果的准确性和可靠性更好。此外信号放大体系中所涉及的氯化铜、聚合物、抗坏血酸钠及柠檬酸三钠均已实现商业化大规模生产，因此本方法试剂成本低、稳定性高以及重现性好，具有较好的商业化前景。

3、本发明所使用聚合物介导可控铜生长信号放大技术可适用于所有胶体金免疫层析试纸条。

4、本发明所构建的增敏型免疫层析试纸条特别适用于痕量目标分析物的超灵敏检测，在临床和突发事件的现场检测中具有广泛的应用前景，如传染病的早期筛查等。

附图说明

图1为试纸条结构示意图，为(a)是传统胶体金免疫层析试纸条结构图，(b)是本发明方法的原理示意图；

图2为对新型冠状病毒感染者血清中抗体检测的示意图：传统胶体金免疫层析试纸条(上)和本发明所构建的增敏型试纸条(下)。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

在以下试验中，磷酸盐缓冲液(pbs，0.05m，ph7.4)的配置方法如下：nacl40g，na2hpo413.5g，kh2po41.0g，kcl1.0g溶于1l超纯水中。用0.1mnaoh调ph值至7.4。

试验中所涉及的新型冠状病毒(sars-cov-2)重组抗原购于江西业力医疗器械有限公司。兔igg抗体以及抗兔二抗均由北京热景生物技术股份有限公司提供。所述氯化铜、聚乙烯亚胺pei、抗坏血酸钠及柠檬酸三钠均可自市面购得。

实施例1

一种用于增敏型胶体金免疫层析试纸条的检测试剂盒，它包括胶体金免疫层析试纸条和铜生长液；如图1中a所示，胶体金免疫层析试纸条包括样本垫、结合垫、nc膜和吸水纸，结合垫上设有用胶体金标记的新型冠状病毒重组抗原，硝酸纤维素膜上设有检测线(t线)和质控线(c线)；铜生长液包括铜生长a液和b液。

所述的试剂盒按以下方法制备得到：

一、胶体金免疫层析试纸条的制备

1、胶体金标记的重组抗原的制备：

取1ml粒径为35nm柠檬酸包被胶体金溶液，用浓度0.2m的碳酸钾溶液调节该溶液的ph值至7.4；向溶液加入5μl浓度为1.5mg/ml新型冠状病毒(sars-cov-2)重组抗原溶液，室温下振荡反应30min；然后再将100μl1.5mg/ml牛血清白蛋白溶液加至上述混合溶液中继续于室温下振荡反应30min；在4℃条件下，于10000rpm离心20min，弃上清，沉淀物复溶于0.01mph7.4磷酸盐缓冲溶液(pbs)，得终产物胶体金标记的重组抗原。胶体金标记兔igg抗体采用类似方法完成。

2、胶体金免疫层析试纸条的制备：

a)结合垫的制备是将胶体金标记的重组抗原和胶体金标记的兔igg抗体喷涂于玻璃纤维膜上；

b)具有检测线和质控线的硝酸纤维(nc)膜的制备是将浓度为1.5mg/mlsars-cov-2重组抗原和浓度为1.5mg/ml抗兔二抗溶液分别喷涂nc膜上绘制两条线平行线，sars-cov-2重组抗原溶液划线作为检测线(t线)，抗兔二抗溶液划线为质控线(c线)；

c)胶体金免疫层析试纸条组装：将样品垫、具有金标检测抗体的结合垫、具有t和c线的nc膜和吸水纸分别依次粘贴到塑料衬板上，相邻重叠部分的长度为2mm，切割成4mm宽的试纸条，密封干燥，于温度保存。

二、比色信号放大试剂的制备

3、铜生长液的配置：

a)铜生长a液：准确称取300mg氯化铜和150mg聚乙烯亚胺pei分别溶解于10ml超纯水中，然后将二者混均制备a液；

b)铜生长b液：准确称取1.5g抗坏血酸钠和1mg柠檬酸三钠分别溶解于10和1ml超纯水中，然后将二者混均制备b液。

实施例2

应用实施例1所述的试剂盒执行本发明方法，用以验证该方法对新型冠状病毒(sars-cov-2)抗体的检测效果。

参照图1中b所示流程，用移液器准确取120μl含不同浓度抗体的血清样品溶液加入到试纸条检测卡加样孔中，于室温反应10min；将上述反应后的试纸条依次使用磷酸盐缓冲液和超纯水洗涤后，浸泡于铜生长a液中室温反应5min；接着将试纸条转移至铜生长b液中继续反应2min，肉眼判读实验结果。

如图2所示，当使用由江西业力医疗有限公司购买商业化胶体金试纸条检测10份由南昌大学第一附属医院收集的病人临床血清样本时，我们发现所有试纸条均只有质控线(c线)出现明显的红色条带，而检测线(t线)未见红色条带。然而执行本发明方法后，其中7份检测样本(编号：27、30、31、32、40、41、43)t线出现肉眼可见的红色条带，表明待测血清中含有新型冠状病毒抗体。

进一步与临床核酸检测结果进行比对分析显示上述7份血清样本所对应患者的核酸检测呈现阳性结果，表明本发明所建立的方法具有更高的检测灵敏度，能够检测出传统胶体金免疫层析试纸条未能成功检测的“假阴性”样本，有效地避免了漏检。此外，3份临床核酸确证阴性的血清样本(编号：17、60、61)放大后其t线未见肉眼可见的条带，表明该放大方法具有良好的特异性。

结论：经实施例2所述的检测试验发现，本发明中所提到的新方法对临床新型冠状病毒感染者血清样本中抗体检测较传统胶体金免疫层析试纸条具有更高的检测灵敏度，更适合用于临床血清样本中痕量抗体的超灵敏检测，进一步证明本发明所提供的基于聚合物介导可控铜生长技术增敏传统胶体金免疫层析试纸条的新方法是可行的。

尽管本发明以新型冠状病毒(sars-cov-2)抗体作为模式分析物在双抗原夹心免疫层析平台上探讨聚合物介导可控铜生长技术增强免疫层析试纸条检测灵敏度的可行性，但是本发明所限定的内容并不局限于新型冠状病毒(sars-cov-2)抗体，其他所有使用本发明方法检测其他的目标分析物如生物大分子、核酸以及病原体等均在本专利的保护范围之内。此外，除了使用传统抗原抗体反应，本发明还可以采用近些年出现的新型生物识别反应如核酸杂交、核酸适配体、配受体等构建相应超灵敏的分析方法用于目标分析物的检测。因此，基于这些识别分子对本发明的拓展和延伸也在本发明所保护的范围之内。