一种基于IgY抗体的新型冠状病毒免疫荧光检测试剂的制备、使用方法及包含其的试剂盒与流程

本发明涉及检验检疫技术领域，特别涉及一种基于igy抗体的新型冠状病毒免疫荧光检测试剂的制备、使用方法及包含其的试剂盒。

背景技术：

新型冠状病毒(2019-ncov)是人类有史以来最严重的全球性传染病，目前已经迅速在全球所有国家流行，给人类生命安全和全球经济造成重大伤害和损失。

对该病进行及时有效治疗和预防首先要对其进行早期、快速、精准的诊断，新型冠状病毒检测试剂是对该病早期诊断的重要科学依据。目前我国已有多个该病毒的检测试剂盒面市，对我国迅速控制该病的流行起到了重要作用。但该病在全球范围仍在疯狂流行着，这和许多患者未得到及时检测诊断和及时隔离治疗有关。面对该病在全球大流行的形势，检测试剂仍存在非常大的缺口。目前面市的检测试剂主要有以下两种类型：核酸检测试剂盒、抗体检测试剂盒。核酸检测试剂盒是用pcr方法，扩增病毒的mrna，进行电泳，把mrna条带显示出来。病毒感染机体后，会刺激机体产生抗体，抗体检测试剂就利用抗原去检测待检者血清内是否存在病毒的抗体，如有病毒的抗体，说明他已被病毒感染。

但本申请发明人发现上述现有技术至少存在如下技术问题：

核酸检测试剂盒需要较洁净的检测环境、较昂贵的检测设备及训练有素的检测技术人员，不能做现场检测，否则容易产生假阴性和假阳性。患者被感染后，7～10天左右才能产生可检抗体，因此，抗体免疫检测试剂盒很难做到早期诊断，不能早期诊断就会耽误患者及时隔离治疗。

技术实现要素：

本发明提供了一种基于igy抗体的新型冠状病毒免疫荧光检测试剂的制备、使用方法及包含其的试剂盒，解决了现有技术中对新型冠状病毒的检测，对检验环境、检验设备、检验人员要求高，不能用于现场检测的技术问题，达到了对检验环境、检验设备、检验人员要求不高，可用于现场检测，且检测快速、准确的技术效果。

为解决上述问题，第一方面本发明实施例提供了一种基于igy抗体的新型冠状病毒免疫荧光检测试剂的制备方法，所述制备方法包括：步骤110：扩增培养新型冠状病毒n蛋白的表达菌株，获得菌液；其中，所述菌液内包含成熟的所述表达菌株；步骤120：用所述菌液制备n蛋白免疫原复合物；步骤130：将所述n蛋白免疫原复合物与生理盐水混合，形成具有第一浓度的混悬液；步骤140：用所述混悬液肌肉注射免疫产蛋鸡，对所述免疫产蛋鸡按照第一预定条件免疫第一预定次数；步骤150：判断所述免疫产蛋鸡是否满足第二预定条件，若满足所述第二预定条件，所述免疫产蛋鸡确定为高免鸡；步骤160：按照第三预定条件对所述高免鸡进行高免鸡蛋的采集；步骤170：对所述高免鸡蛋进行消毒、卵黄分离、卵黄组织破碎、稀释20-40倍后，获得第一卵黄液；步骤180：将所述第一卵黄液的ph值调至5.2-6.0，在4-8℃条件下静置第一时间段后吸取上清，获得第一上清；对底部浑浊部分进行离心处理后取上清，获得第二上清；将所述第一上清、所述第二上清混合、微孔过滤后，获得n蛋白卵黄抗体粗制品；步骤190：用冷酒精沉淀法对所述n蛋白卵黄抗体粗品进行纯化，获得n蛋白卵黄抗体精制品。

优选的，所述第一浓度具体为：每0.5ml含40μg-50μg所述n蛋白免疫原复合物。

优选的，所述第一预定次数为三次，所述第一预定条件为：每只所述免疫产蛋鸡每次免疫注射0.5ml所述混悬液，每隔一周免疫一次。

优选的，判断所述免疫产蛋鸡是否满足第二预定条件具体为：采集所述免疫产蛋鸡第三次免疫当天的鸡蛋，判断所述鸡蛋的卵黄是否含有n蛋白抗体；如果含有所述n蛋白抗体，判断所述n蛋白抗体的效价是否大于等于10^-4；如果所述n蛋白抗体的效价大于等于10^-4，则所述免疫产蛋鸡满足所述第二预定条件。

优选的，按照第三预定条件对所述高免鸡进行高免鸡蛋的采集，具体为：第三次免疫后第三天开始采集高免鸡蛋，连续采集20天。

优选的，将所述第一卵黄液的ph值调至5.2-6.0，具体为：用盐酸和氢氧化钠溶液将所述第一卵黄液的ph值调至5.2-6.0，使所述第一卵黄溶液产生沉淀。

优选的，对底部浑浊部分进行离心处理，具体为：采用3500-4000r/min的转速对所述底部浑浊液离心20-40分钟。

优选的，用冷酒精沉淀法对所述n蛋白卵黄抗体粗品进行纯化，具体为：取第一体积的所述n蛋白卵黄抗体粗制品；向所述n蛋白卵黄抗体粗制品中加入第二体积的冷酒精，获得第一混合液，其中，所述第二体积为所述第一体积的50％-60％；对所述第一混合液进行充分搅拌后，进行离心处理，获得第一沉淀物；向所述第一沉淀物中加入无菌蒸馏水，获得所述第二混合液，所述第二混合液的体积为第三体积；所述第三体积等于第一体积；向所述第二混合液中加入第四体积的冷酒精，获得第三混合液；其中，所述第四体积为所述第一体积的25％-30％；对所述第三混合液进行充分搅拌后，进行离心处理，获得第二沉淀物；向所述第二沉淀物中加入无菌蒸馏水，获得第四混合液，所述第三混合液的体积为第五体积，所述第五体积等于所述第一体积；向所述第三混合液中加入第六体积的冷酒精，获得第五混合液，所述第六体积为所述第一体积的20％-25％；对所述第五混合液进行充分搅拌后，进行离心处理，获得第三沉淀物；向所述第三沉淀物中加入无菌蒸馏水，使所述第三沉淀物溶解，获得n蛋白卵黄抗体精制品；其中，所述冷酒精为-20℃的无水乙醇。

第二方面，本发明实施例提供了一种基于igy抗体的新型冠状病毒免疫荧光检测试剂的使用方法，用于检测患者是否感染新型冠状病毒，所述使用方法包括：步骤210：将待检标本均匀涂抹在载玻片上；步骤220：待所述标本干燥后，向所述标本上滴加4％的多聚甲醛，并固定10-15分钟；步骤230：甩掉所述标本上的多聚甲醛，并用pbs对所述载玻片清洗三次；步骤240：将所述n蛋白卵黄抗体精制品按照1:500进行稀释，获得n蛋白卵黄抗体溶液；将fitc标记的抗igy抗体按照1:1000进行稀释，获得抗igy抗体溶液；将所述n蛋白卵黄抗体溶液与所述抗igy抗体溶液等体积混合，获得抗体混合物；步骤250：弃去所述标本上的所述抗体混合物，并用pbs对所述载玻片清洗三次；步骤260：用滤纸吸去所述载玻片上的多余水分，滴加甘油，加盖玻片，荧光显微镜下观察；步骤270：如果所述标本显示绿色荧光小点分布在细胞内或者细胞外时，则判定所述标本为阳性；如果所述标本中未发现绿色荧光小点，则判定所述标本阴性；其中，所述n蛋白卵黄抗体精制品采用权利要求1-8中任一权利要求所述的制备方法制得。

第三方面，本发明实施例提供了一种试剂盒，用于检测新型冠状病毒的n蛋白，所述试剂盒包括：n蛋白卵黄抗体，10ml；荧光(fitc)标记抗igy抗体，10ml；载玻片，100张；盖玻片，100张；咽拭子取样管，100支；4％多聚甲醛，10ml；甘油，15ml；10×pbs，30ml；其中，n蛋白卵黄抗体为n蛋白卵黄抗体精制品稀释500倍后制得，所述n蛋白卵黄抗体精制品由以上所述任一制备方法制得。

本发明实施例中的上述一个或多个技术方案，至少具有如下一种或多种技术效果：

本发明实施例提供了一种基于igy抗体的新型冠状病毒免疫荧光检测试剂的制备方法，所述制备方法包括：步骤110：扩增培养新型冠状病毒n蛋白的表达菌株，获得菌液；其中，所述菌液内包含成熟的所述表达菌株；步骤120：用所述菌液制备n蛋白免疫原复合物；步骤130：将所述n蛋白免疫原复合物与生理盐水混合，形成具有第一浓度的混悬液；步骤140：用所述混悬液肌肉注射免疫产蛋鸡，对所述免疫产蛋鸡按照第一预定条件免疫第一预定次数；步骤150：判断所述免疫产蛋鸡是否满足第二预定条件，若满足所述第二预定条件，所述免疫产蛋鸡确定为高免鸡；步骤160：按照第三预定条件对所述高免鸡进行高免鸡蛋的采集；步骤170：对所述高免鸡蛋进行消毒、卵黄分离、卵黄组织破碎、稀释20-40倍后，获得第一卵黄液；步骤180：将所述第一卵黄液的ph值调至5.2-6.0，在4-8℃条件下静置第一时间段后吸取上清，获得第一上清；对底部浑浊部分进行离心处理后取上清，获得第二上清；将所述第一上清、所述第二上清混合、微孔过滤后，获得n蛋白卵黄抗体粗制品；步骤190：用冷酒精沉淀法对所述n蛋白卵黄抗体粗品进行纯化，获得n蛋白卵黄抗体精制品。通过所述制备方法解决了现有技术中对新型冠状病毒的检测，对检验环境、检验设备、检验人员要求高，不能用于现场检测的技术问题，达到了对检验环境、检验设备、检验人员要求不高，可用于现场检测，且检测快速、准确的技术效果。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。

附图说明

图1为本发明实施例中一种基于igy抗体的新型冠状病毒免疫荧光检测试剂的制备方法的流程图；

图2为本发明实施例中一种基于igy抗体的新型冠状病毒免疫荧光检测试剂的使用方法的流程图。

具体实施方式

本发明实施例提供了一种基于igy抗体的新型冠状病毒免疫荧光检测试剂的制备、使用方法及包含其的试剂盒，解决了现有技术中对新型冠状病毒的检测，对检验环境、检验设备、检验人员要求高，不能用于现场检测的技术问题，达到了对检验环境、检验设备、检验人员要求不高，可用于现场检测，且检测快速、准确的技术效果。

本发明实施例中的技术方案，总体结构如下：

一种基于igy抗体的新型冠状病毒免疫荧光检测试剂的制备方法，所述制备方法包括：步骤110：扩增培养新型冠状病毒n蛋白的表达菌株，获得菌液；其中，所述菌液内包含成熟的所述表达菌株；步骤120：用所述菌液制备n蛋白免疫原复合物；步骤130：将所述n蛋白免疫原复合物与生理盐水混合，形成具有第一浓度的混悬液；步骤140：用所述混悬液肌肉注射免疫产蛋鸡，对所述免疫产蛋鸡按照第一预定条件免疫第一预定次数；步骤150：判断所述免疫产蛋鸡是否满足第二预定条件，若满足所述第二预定条件，所述免疫产蛋鸡确定为高免鸡；步骤160：按照第三预定条件对所述高免鸡进行高免鸡蛋的采集；步骤170：对所述高免鸡蛋进行消毒、卵黄分离、卵黄组织破碎、稀释20-40倍后，获得第一卵黄液；步骤180：将所述第一卵黄液的ph值调至5.2-6.0，在4-8℃条件下静置第一时间段后吸取上清，获得第一上清；对底部浑浊部分进行离心处理后取上清，获得第二上清；将所述第一上清、所述第二上清混合、微孔过滤后，获得n蛋白卵黄抗体粗制品；步骤190：用冷酒精沉淀法对所述n蛋白卵黄抗体粗品进行纯化，获得n蛋白卵黄抗体精制品。通过上述制备方法解决了现有技术中对新型冠状病毒的检测，对检验环境、检验设备、检验人员要求高，不能用于现场检测的技术问题，达到了对检验环境、检验设备、检验人员要求不高，可用于现场检测，且检测快速、准确的技术效果。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

本发明实施例提供了一种基于igy抗体的新型冠状病毒免疫荧光检测试剂的制备方法，请参考附图1，所述制备方法包括：

步骤110：扩增培养新型冠状病毒n蛋白的表达菌株，获得菌液；其中，所述菌液内包含成熟的所述表达菌株；

具体而言，所述n蛋白(nucleocapsidprotein)为核衣壳蛋白的简称，n蛋白是公认的新型冠状病毒较稳定、抗原性较强的蛋白，比较适合用作免疫检测的抗原，n蛋白抗体较适合用作免疫检测新型冠状病毒的抗体。所述表达菌株为表达新型冠状病毒n蛋白的大肠杆菌，将所述表达菌株接种到装有液体培养基的玻璃试管中，然后将所述玻璃试管放置在摇床进行培养，待所述表达菌株生长至所述液体培养基变浑浊后，将所述玻璃试管内的所述液体培养基、所述表达菌株倒到培养瓶内进行扩增培养，待所述表达菌株生长成熟后收获所述菌液。

步骤120：用所述菌液制备n蛋白免疫原复合物；

具体而言，将所述菌液置于小烧杯内，用超声粉碎机粉碎所述菌液内的细菌；对粉碎后的所述菌液进行凝胶电泳，然后切下含n蛋白的条带，将所述含n蛋白的条带研磨粉碎，即获得所述n蛋白免疫原复合物。

步骤130：将所述n蛋白免疫原复合物与生理盐水混合，形成具有第一浓度的混悬液；

进一步的，所述第一浓度具体为：每0.5ml含40μg-50μg所述n蛋白免疫原复合物。

具体而言，将步骤120中获得的所述n蛋白免疫原复合物与生理盐水混合，形成混悬液，每0.5ml所述混悬液中含40μg-50μg所述n蛋白免疫原复合物。

步骤140：用所述混悬液肌肉注射免疫产蛋鸡，对所述免疫产蛋鸡按照第一预定条件免疫第一预定次数；

进一步的，所述第一预定次数为三次；所述第一预定条件为：每只所述免疫产蛋鸡每次免疫注射0.5ml所述混悬液，每隔一周免疫一次。

具体而言，选取体重为1kg左右，且产蛋率大于80％的健康母鸡作为免疫产蛋鸡，每只所述免疫产蛋鸡每次免疫注射0.5ml所述混悬液，即每次向每只所述免疫产蛋鸡体内注射40μg-50μg所述n蛋白免疫原复合物。需要对所述免疫产蛋鸡进行三次免疫注射，相邻两次免疫注射之间间隔一周。

步骤150：判断所述免疫产蛋鸡是否满足第二预定条件，若满足所述第二预定条件，所述免疫产蛋鸡确定为高免鸡；

进一步的，判断所述免疫产蛋鸡是否满足第二预定条件具体为：

采集所述免疫产蛋鸡第三次免疫当天的鸡蛋，判断所述鸡蛋的卵黄是否含有n蛋白抗体；

如果含有所述n蛋白抗体，判断所述n蛋白抗体的效价是否大于等于10^-4；

如果所述n蛋白抗体的效价大于等于10^-4，则所述免疫产蛋鸡满足所述第二预定条件。

具体而言，只有高免鸡产的鸡蛋才是高免鸡蛋，只有高免鸡蛋才能用来制作所述卵黄抗体。在对所述免疫产蛋鸡进行第三次免疫注射当天，采集所述免疫产蛋鸡生产的鸡蛋。然后用elisa(enzymelinkedimmunosorbentassay，酶联免疫吸附试验)法检测所述鸡蛋的卵黄内是否含有n蛋白的抗体以及所述n蛋白抗体的效价，如果所述鸡蛋内含有所述n蛋白抗体，且所述n蛋白抗体的效价大于等于10^-4，则生产所述鸡蛋的所述免疫产蛋鸡被确定为高免鸡，被列为采蛋对象。

步骤160：按照第三预定条件对所述高免鸡进行高免鸡蛋的采集；

进一步的，按照第三预定条件对所述高免鸡进行高免鸡蛋的采集，具体为：第三次免疫后第三天开始采集高免鸡蛋，连续采集20天。

具体而言，从所述高免鸡进行第三次免疫注射后的第三天开始，采集所述高免鸡生产的鸡蛋，即所述高免鸡蛋，连续对所述高免鸡采集20天所述高免鸡蛋。如果还需要所述高免鸡蛋，需要对所述高免鸡追加一次免疫注射，然后继续对所述高免鸡采集20天所述高免鸡蛋。也就是说，每隔20天对所述高免鸡追加一次免疫注射，直至所述高免鸡被淘汰。

步骤170：对所述高免鸡蛋进行消毒、卵黄分离、卵黄组织破碎、稀释20-40倍后，获得第一卵黄液；

具体而言，所述消毒具体为：用自来水将所述高免鸡蛋的蛋壳清洗干净，然后放入70％的酒精中浸泡10分钟，对所述高免鸡蛋进行消毒杀菌，最后将所述高免鸡蛋放入清洁间晾干。

可用人工或者机器对所述高免鸡蛋进行卵黄分离，获得蛋黄。所述蛋黄如果不需要马上制备所述卵黄抗体，可放置在-20℃的环境下保存6个月。

可使用60pa的高压均质机对所述蛋黄进行破碎，也可以使用破壁机对所述蛋黄进行破碎。向破碎后的所述蛋黄中加入无菌蒸馏水，将所述破碎后的蛋黄稀释20-40倍，搅拌均匀后，获得所述第一卵黄液。

步骤180：将所述第一卵黄液的ph值调至5.2-6.0，在4-8℃条件下静置第一时间段后吸取上清，获得第一上清；对底部浑浊液进行离心处理后取上清，获得第二上清；将所述第一上清、所述第二上清混合、微孔过滤后，获得n蛋白卵黄抗体粗制品；

进一步的，将所述第一卵黄液的ph值调至5.2-6.0，具体为：用盐酸和氢氧化钠溶液将所述第一卵黄液的ph值调至5.2-6.0，使所述第一卵黄溶液产生沉淀；

进一步的，对底部浑浊液进行离心处理，具体为，采用3500-4000r/min的转速对所述底部浑浊液离心20-40分钟。

具体而言，向所述第一卵黄液中加入盐酸和氢氧化钠溶液，将所述第一卵黄液的ph值调至5.2-6.0，使所述第一卵黄液浑浊，所述第一卵黄液内的杂质蛋白产生沉淀。然后将所述第一卵黄液在4-8℃条件下，静置14-18小时，使所述第一卵黄液内的杂质蛋白继续沉淀。接着，用吸管吸取所述第一卵黄液内的上部清液，获得第一上清。然后对所述第一卵黄液底部的浑浊液体进行离心处理，达到去除所述底部浑浊液内的杂质蛋白的技术效果。其中所述离心处理的转速为3500-4000r/min，离心时间为20-40分钟。

对所述底部浑浊液进行离心处理后，用吸管吸取上部清液，获得第二上清。将所述第一上清、所述第二上清混合后，获得上清混合液。然后对所述上清混合液进行微孔过滤，取过滤后的滤液，所述滤液即为n蛋白卵黄抗体粗制品。其中，所述微孔过滤中微孔的孔径为0.22μm，所述微孔过滤的目的是去除所述上清混合液中的脂蛋白和脂肪。

步骤190：用冷酒精沉淀法对所述n蛋白卵黄抗体粗品进行纯化，获得n蛋白卵黄抗体精制品。

进一步的，用冷酒精沉淀法对所述n蛋白卵黄抗体粗品进行纯化，具体为：

取第一体积的所述n蛋白卵黄抗体粗制品；

向所述n蛋白卵黄抗体粗制品中加入第二体积的冷酒精，获得第一混合液，其中，所述第二体积为所述第一体积的50％-60％，

对所述第一混合液进行充分搅拌后，进行离心处理，获得第一沉淀物；

向所述第一沉淀物中加入无菌蒸馏水，获得所述第二混合液，所述第二混合液的体积为第三体积；其中，所述第三体积等于第一体积；

向所述第二混合液中加入第四体积的冷酒精，获得第三混合液；其中，所述第四体积为所述第一体积的25％-30％；

对所述第三混合液进行充分搅拌后，进行离心处理，获得第二沉淀物；

向所述第二沉淀物中加入无菌蒸馏水，获得第四混合液，所述第三混合液的体积为第五体积，所述第五体积等于所述第一体积；

向所述第三混合液中加入第六体积的冷酒精，获得第五混合液，所述第六体积为所述第一体积的20％-25％；

对所述第五混合液进行充分搅拌后，进行离心处理，获得第三沉淀物；

向所述第三沉淀物中加入无菌蒸馏水，使所述第三沉淀物溶解，获得n蛋白卵黄抗体精制品。

进一步的，所述离心处理的转速为4000r/min，离心时间为20-30min。

具体而言，取体积为第一体积的所述n蛋白卵黄抗体粗制品，向所n蛋白述卵黄抗体粗制品中加入体积为第二体积的冷酒精，获得第一混合液，其中，所述第二体积为所述第一体积的50％-60％。

对所述第一混合液进行充分搅拌，使其浑浊并产生沉淀。然后采用转速为4000r/min的转速对所述第一混合液进行离心处理20-30分钟，接着取所述第一混合液内的沉淀物，获得第一沉淀物；

向所述第一沉淀物中加入无菌蒸馏水，使所述第一沉淀物溶解，获得所述第二混合液，所述第二混合液的体积为第三体积，所述第三体积等于第一体积；

向所述第二混合液中加入体积为第四体积的冷酒精，获得第三混合液；其中，所述第四体积为所述第一体积的25％-30％；

对所述第三混合液进行充分搅拌，使其浑浊并产生沉淀。然后采用转速为4000r/min的转速对所述第三混合液进行离心处理20-30分钟，接着取所述第三混合液内的沉淀物，获得第二沉淀物；

向所述第二沉淀物中加入无菌蒸馏水，获得第四混合液，所述第三混合液的体积为第五体积，所述第五体积等于所述第一体积；

向所述第三混合液中加入体积为第六体积的冷酒精，获得第五混合液，所述第六体积为所述第一体积的20％-25％；

对所述第五混合液进行充分搅拌，使其浑浊并产生沉淀。然后采用转速为4000r/min的转速对所述第五混合液进行离心处理20-30分钟，取所述第五混合液内的沉淀物，获得第三沉淀物；

最后，向所述第三沉淀物中加入无菌蒸馏水，使所述第三沉淀物溶解，也就是说，所述无菌蒸馏水的加入量使所述第三沉淀物刚好溶解即可，获得所述n蛋白卵黄抗体精制品，即所述荧光检测试剂。

通过本实施例中的基于igy抗体的新型冠状病毒免疫荧光检测试剂的制备方法，解决了现有技术中对新型冠状病毒的检测，对检验环境、检验设备、检验人员要求高，不能用于现场检测的技术问题，达到了对检验环境、检验设备、检验人员要求不高，可用于现场检测，且检测快速、准确的技术效果。

实施例二

本实施例还提供了一种基于igy抗体的新型冠状病毒免疫荧光检测试剂的使用方法，用于检测患者是否感染新型冠状病毒，所述使用方法包括：

步骤210：将待检标本均匀涂抹在载玻片上；

具体而言，用咽拭子取样管采集患者的唾液标本，将所述标本均匀涂抹在载玻片上。

步骤220：待所述标本干燥后，向所述标本上滴加4％的多聚甲醛，并固定10-15分钟；

具体而言，待所述载玻片上的所述标本干燥后，所述标本上滴加4％的多聚甲醛，且多聚甲醛完全覆盖所述标本。多聚甲醛在所述标本上停留10-15分钟，达到将所述标本充分固定于载玻片上的技术效果。

步骤230：甩掉所述标本上的多聚甲醛，并用pbs对所述载玻片清洗三次；

具体而言，甩掉所述标本上的多聚甲醛，并用pbs(phosphatebuffersaline，磷酸盐缓冲液)对所述载玻片清洗三次，达到彻底清除所述标本上的多聚甲醛的技术效果。

步骤240：将所述n蛋白卵黄抗体精制品按照1:500进行稀释，获得n蛋白卵黄抗体溶液；

将fitc标记的抗igy抗体按照1:1000进行稀释，获得抗igy抗体溶液；

将所述n蛋白卵黄抗体溶液与所述抗igy抗体溶液等体积混合，获得抗体混合物；

将所述抗体混合物滴加到所述标本上后，将所述标本放置在37℃湿盒内静置20min；

具体而言，用抗体稀释液按照1:500对所述n蛋白卵黄抗体精制品进行稀释，获得所述n蛋白卵黄抗体溶液。用fitc(fluoresceinisothiocyanate，异硫氰酸荧光素)标记的抗igy(immunoglobulinofyolk，卵黄抗体)抗体，然后用抗体稀释液按照1:1000对所述抗igy抗体进行稀释，获得所述抗igy抗体溶液。将所述n蛋白卵黄抗体溶液与所述抗igy抗体溶液等体积混合后，获得抗体混合物。将所述抗体混合物滴加到所述标本上后，将所述标本放置在37℃的湿盒内静置20分钟，使所述标本与所述抗体混合物充分发生反应。

步骤250：弃去所述标本上的所述抗体混合物，并用pbs对所述载玻片清洗三次；

具体而言，去除所述标本上的所述抗体混合物，并用pbs对所述载玻片清洗三次，达到彻底去除所述标本上的所述抗体混合物的技术效果。

步骤260：用滤纸吸去所述载玻片上的多余水分，滴加甘油，加盖玻片，荧光显微镜下观察；

步骤270：如果有绿色荧光小点分布在所述标本的细胞内或者细胞外时，则判定所述标本为阳性；如果在所述标本中未发现绿色荧光小点，则判定所述标本为阴性。

具体而言，在荧光显微镜下观察所述标本，如果有绿色荧光小点分布在所述标本的细胞内或者细胞外时，判定所述标本为阳性，即所述患者感染了新型冠状病毒；如果在所述标本中为发现绿色荧光小点，则判定所述标本为阴性，即所述患者未感染新型冠状病毒。

通过本实施例中的使用方法，解决了现有技术中对新型冠状病毒的检测，对检验环境、检验设备、检验人员要求高，不能用于现场检测的技术问题，达到了对检验环境、检验设备、检验人员要求不高，可用于现场检测，且检测快速、准确的技术效果。

实时例三

本实施例还提供了一种试剂盒，用于检测新型冠状病毒的n蛋白，一个所述试剂盒为100人份，所述试剂盒包括：

n蛋白卵黄抗体溶液，10ml；

荧光(fitc)标记抗igy抗体溶液，10ml；

载玻片100张；

盖玻片100张；

咽拭子取样管100支；

4％多聚甲醛10ml；

甘油15ml；

10×pbs，30ml。

其中，所述n蛋白卵黄抗体溶液由所述n蛋白卵黄抗体精制品按照1:500稀释后获得；荧光(fitc)标记抗igy抗体溶液由荧光(fitc)标记抗igy抗体按照1:1000稀释后获得；所述稀释具体为采用抗体稀释液进行稀释。

10×pbs为pbs工作液的10倍浓缩液。

所述试剂盒的使用方法如实施例二所述，本实施例在此不做赘述。

实施例四

为了检测所述n蛋白卵黄抗体精制品的效价和特异性，本实施例对所述n蛋白卵黄抗体精制品进行了效价检测和特异性检测。

1、效价检测

本实施例采用elisa法对上所述n蛋白卵黄抗体精制品进行效价检测，具体为：

步骤310：取适量的实施例一的步骤110中获得的所述菌液，然后用超生粉碎机粉碎所述菌液；

步骤320：用包被缓冲液将所述菌液按照1:1000进行稀释后，将稀释后的菌液包被8个反应孔内，常温静置1小时；

步骤330：弃去8个所述反应孔内的所述菌液，用pbs清洗三次8个所述反应孔，每次清洗3分钟；

步骤340：将所述n蛋白卵黄抗体精制品分别稀释10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸倍，然后向分别添加到8个所述反应孔内，即每个所述反应孔内添加一种浓度的n蛋白卵黄抗体精制品，每个所述反应空内添加100μl；

步骤350：常温静置30分钟后，弃去8个所述反应孔内的稀释后的所述n蛋白卵黄抗体精制品，并用pbs清洗三次8个所述反应孔，每次清洗3分钟；

步骤360：采用抗体稀释液按照1:1000对酶标抗igy抗体进行稀释后，获得所述酶标抗igy抗体溶液；

向8个所述反应孔内添加所述酶标抗igy抗体溶液；

步骤370：常温静置30分钟后，弃去8个所述反应孔内的所述酶标抗igy抗体溶液，并用pbs清洗三次8个所述反应孔，每次清洗3分钟；

步骤380：向8个所述反应孔内添加显色剂，常温避光显色10-15分钟后，向8个所述反应孔内添加终止液；

步骤390：用酶联免疫检测仪检测各所述反应孔的od(opticaldensity，光密度)值，如果所述反应孔的od值大于、等于阴性对照孔2.1倍，则判定所述反应孔为阳性反应。

各所述反应孔的检测结果如表1所示：

表1n蛋白卵黄抗体的效价检测结果

由表1知，本实施例中的n蛋白卵黄抗体的效价均为10^-5，具有较高效价，可用于新型冠状病毒n蛋白的检测。

2、特异性检测

本实施例中的特异性检测采用新型冠状病毒n蛋白、流感病毒、肺炎支原体、肺炎球菌进行检测，具体监测方法为：

步骤410：分别用新型冠状病毒n蛋白、流感病毒、肺炎支原体、肺炎球菌包被反应孔，即新型冠状病毒n蛋白和每种病原体各包被一个所述反应孔；

步骤420：常温静置1小时后，弃去所述反应孔内的液体，用pbs清洗三次所述反应孔，每次清洗3分钟；

步骤430：向每个所述反应孔内添加稀释1000倍后的所述n蛋白卵黄抗体精制品，每孔100μl；其中，使用抗体稀释液对所述n蛋白卵黄抗体精制品进行稀释；

步骤440：常温静置30分钟后，弃去所述反应孔内的所述n蛋白卵黄抗体精制品，并用pbs清洗三次所述反应孔，每次清洗3分钟；

步骤450：向各个所述反应孔内添加显色剂，常温避光显色10-15分钟后，向各个所述反应孔内添加终止液；

步骤460：用酶联免疫检测仪检测各所述反应孔的od(opticaldensity，光密度)值，如果所述反应孔的od值大于、等于阴性对照孔2.1倍，则判定所述反应孔为阳性反应。

各所述反应孔的特异性检测结果如表2所示：

表2n蛋白卵黄抗体特异性检测结果表

由表2知，本实施例中的n蛋白卵黄抗体只与n蛋白发生免疫反应，不和流感病毒、肺炎支原体、肺炎球菌发生免疫反应，说明所述n蛋白卵黄抗体是新型冠状病毒n蛋白特异性抗体。

本发明实施例中的上述一个或多个技术方案，至少具有如下一种或多种技术效果：

本发明实施例提供了一种基于igy抗体的新型冠状病毒免疫荧光检测试剂的制备方法，所述制备方法包括：步骤110：扩增培养新型冠状病毒n蛋白的表达菌株，获得菌液；其中，所述菌液内包含成熟的所述表达菌株；步骤120：用所述菌液制备n蛋白免疫原复合物；步骤130：将所述n蛋白免疫原复合物与生理盐水混合，形成具有第一浓度的混悬液；步骤140：用所述混悬液肌肉注射免疫产蛋鸡，对所述免疫产蛋鸡按照第一预定条件免疫第一预定次数；步骤150：判断所述免疫产蛋鸡是否满足第二预定条件，若满足所述第二预定条件，所述免疫产蛋鸡确定为高免鸡；步骤160：按照第三预定条件对所述高免鸡进行高免鸡蛋的采集；步骤170：对所述高免鸡蛋进行消毒、卵黄分离、卵黄组织破碎、稀释20-40倍后，获得第一卵黄液；步骤180：将所述第一卵黄液的ph值调至5.2-6.0，在4-8℃条件下静置第一时间段后吸取上清，获得第一上清；对底部浑浊部分进行离心处理后取上清，获得第二上清；将所述第一上清、所述第二上清混合、微孔过滤后，获得n蛋白卵黄抗体粗制品；步骤190：用冷酒精沉淀法对所述n蛋白卵黄抗体粗品进行纯化，获得n蛋白卵黄抗体精制品。通过上述基于igy抗体的新型冠状病毒免疫荧光检测试剂的制备方法解决了现有技术中对新型冠状病毒的检测，对检验环境、检验设备、检验人员要求高，不能用于现场检测的技术问题，达到了对检验环境、检验设备、检验人员要求不高，可用于现场检测，且检测快速、准确的技术效果。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。