一种检测水中总汞及甲基汞的荧光探针试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及总汞及甲基汞检测的技术领域，尤其是涉及一种检测水中总汞及甲基汞的荧光探针试剂盒及检测方法。

背景技术：

在重金属的开采、冶炼和加工过程中，多种重金属如铅、汞、镉和钴等进入水体中可造成严重的环境污染。其中，汞造成的污染是最普遍的一种，水环境中的汞可在藻类和底泥中积累，被鱼和贝类体表吸附后通过食物链富集，进而存在有损害人类健康的风险。水体中汞的毒性不仅取决于其浓度，更与其存在的价态和形态密切相关。其中，甲基汞的毒性远大于汞离子，并且，汞离子在特定条件下也可转化为甲基汞，甲基汞相比汞离子更容易在人体内与蛋白质及各种酶发生强烈的相互作用，使蛋白质及酶失去活性；此外，甲基汞也可能在人体的某些器官中富集，造成人体急性中毒、亚急性中毒和慢性中毒等，对人体造成巨大危害。因此，对于水环境中总汞的检测以及甲基汞的独立检测已经成为一项重要议题。

荧光分子探针法是基于比色或荧光反应将分子识别信号转变为荧光信号的一种检测手段，在分析化学和水环境监测等方面具有广泛的应用。然而，能够有效检测并区分汞离子和甲基汞的荧光探针却很少。

萘酰亚胺类衍生物具有良好的光学性质，例如荧光量子产率高、斯托克斯位移大和光学稳定性好等优点，因此，经常被当做荧光基团广泛用于合成荧光探针分子。合成的探针具有灵敏度高、准确性好和成本低廉的优点，可用于实时检测重金属。

但是，如何基于萘酰亚胺荧光基团开发一种可同时检测并区分汞离子和甲基汞的荧光探针试剂盒，是目前本领域亟需解决的一项技术问题。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种检测水中总汞及甲基汞的荧光探针试剂盒，该荧光探针试剂盒能够同时对水环境中汞离子和甲基汞进行检测，并可准确判断总汞中是否有甲基汞的存在；

本发明的第二目的在于提供一种检测水中总汞及甲基汞的检测方法，旨在提高水环境中痕量汞的检测灵敏度和操作便捷性。

本发明提供一种检测水中总汞及甲基汞的荧光探针试剂盒，包括缓冲液试剂、探针溶液和dna试剂；

其中，所述缓冲液试剂为乙腈-hepes的缓冲液，且其浓度为8-12mm，ph为6-8；

所述探针的结构式如下：

其中，r为含氧长链结构；

所述dna的碱基序列为

5’-ttgtttgttggccccccttctttctt-3’。

本发明的荧光探针试剂盒中，包括缓冲液试剂、探针溶液和dna试剂，其中，缓冲液试剂为乙腈-hepes的缓冲液，且其浓度为8-12mm，ph为6-8，该缓冲液可为水环境中汞的检测提供适宜的检测环境；探针中含有萘酰亚胺结构、吡啶基团结构和含氧长链结构，其中，萘酰亚胺为荧光基团，吡啶基团为结合位点，探针中的四个萘酰亚胺荧光基团的自由旋转可以将激发能量非辐射湮灭，以致探针在溶液中无法被激发出强烈的荧光，当溶液中有汞离子或甲基汞存在时，汞离子或甲基汞可与探针发生配位结合，进而限制萘酰亚胺基团的转动，探针溶液则可以被紫外光激发产生强烈的荧光。探针分子中吡啶上的氮原子和萘酰亚胺上的羰基均可作为汞的结合位点，即当探针分子和汞离子和/或甲基汞结合后，可发射出肉眼可见的荧光，进而用于汞的定性检测。此外，荧光探针试剂盒中还包括碱基序列为5’-ttgtttgttggccccccttctttctt-3’的dna试剂，该dna试剂可用于掩蔽溶剂中的汞离子，这是因为，dna与汞离子的亲和力强，可以竞争性结合已经与探针络合的汞离子，从而将汞离子引起的探针的荧光响应完全猝灭，而甲基汞由于甲基的存在无法和dna结合，则dna的引入无法将甲基汞引起的荧光猝灭，因此，该dna可作为汞离子的掩蔽剂，用于汞离子和甲基汞同时存在时甲基汞的定性检测。而含氧长链结构保证了探针在水环境和有机溶剂中较好的溶解性，并且，含氧长链结构r优选为

碱基序列为5’-ttgtttgttggccccccttctttctt-3’的dna可在试剂公司订购，该dna合成工艺成熟，制作周期短，价格普遍低廉。

进一步，还包括手提式紫外灯、移液枪和具塞石英比色皿。

本发明的荧光探针试剂盒还包括手提式紫外灯、移液枪和具塞石英比色皿，其中，手提式紫外灯用于提供激发光源，观察待测水样的荧光响应情况；移液枪用于精确吸取探针溶液和水样，保证试验的准确性、重复性；具塞石英比色皿用于观察紫外光激发下其内部溶液的荧光响应情况。

进一步，还包括枪头盒、擦镜纸、冰盒和洗瓶。

本发明的荧光探针试剂盒的盒体中还包括枪头盒、擦镜纸、冰盒和洗瓶，其中，枪头盒用于存放移液枪枪头；擦镜纸用于比色皿清洗后的初步擦拭；冰盒用于保存dna样品，市售的dna样品一般为固体粉末状态，样品瓶放在冰盒中保存，使用时，再加水配置成一定浓度的溶液；洗瓶用于盛装蒸馏水或去离子水。

本发明还公开了使用上述荧光探针试剂盒检测水中总汞及甲基汞的检测方法，包括以下步骤：

s1、将乙腈-hepes缓冲液和待测水样加入比色皿中，混匀后在暗处使用波长为365nm的紫外灯照射，得到参比；

s2、向所述参比中加入探针溶液，混匀后在暗处使用波长为365nm的紫外灯再次照射；

s3、继续向所述参比中加入dna溶液，混合后在暗处使用波长为365nm的紫外灯继续照射。

本发明使用上述荧光探针试剂盒检测水中总汞及甲基汞的检测方法，包括以下步骤：首先，将缓冲液和待测水样加入比色皿中，混匀后在暗处使用波长为365nm的紫外灯照射，并以此作为参比；其次，向上述参比中加入探针溶液，混匀后在暗处使用波长为365nm的紫外灯再次照射，观察对比加入前后溶液的荧光变化情况，若比色皿中含汞离子和/或甲基汞则可以产生蓝色荧光响应，实现总汞的定性检测；若需进一步考察样品中是否有甲基汞的存在，可引入特定碱基序列的dna片段，将汞离子引起的荧光完全猝灭，若比色皿中仍呈现出荧光，则表明有甲基汞的存在。因此，使用本方法能够同时对水环境中的汞离子和甲基汞进行检测，当利用探针检测出样品中含有汞存在时，可根据需要选择进一步加入dna片段，用于准确判定总汞中是否有甲基汞的存在。

进一步，步骤s1中，所述乙腈-hepes缓冲液与所述待测水样使用体积比为(2-3)：(2-3)。

进一步，步骤s2中，向所述参比中加入探针溶液后，探针的浓度为4-6μm。

为满足检测过程中对探针溶液的使用需求，可提前配制浓度为4-6μm的探针溶液。

进一步，所述探针溶液为乙腈-hepes缓冲液作为溶剂配制的0.2-0.3mm浓度的探针溶液。

本发明所使用的探针溶液为提前配制的探针乙腈-hepes溶液，其中，hepes缓冲液的主要成分是羟乙基哌嗪乙硫磺酸，其是一种非离子两性缓冲液，在ph7.2-7.4范围内具有较好的缓冲能力，可维持体系较为稳定的ph值。

进一步，步骤s3中，向所述参比中加入dna溶液后，dna的浓度为4-6μm。

为进一步确定待测样品中是否有甲基汞的存在，向参比中加入dna溶液，加入后dna的浓度在4-6μm之间，若此时溶液荧光不变，则待测水样中的汞全部为甲基汞；若溶液荧光完全猝灭至空白试样状态，则待测水样中的汞全部为汞离子；如果荧光强度有下降，但未完全猝灭，表明待测水样中含有部分甲基汞。此外，为保证汞离子荧光能够完全被猝灭，可继续多次向参比中加入dna溶液，若荧光强度不再继续变化，则说明dna结合了全部的汞离子，确保了全部汞离子的荧光已被猝灭，溶液中剩余的荧光全部由甲基汞引起。为进一步确认待测水样中甲基汞的准确浓度，可结合荧光光谱仪进行检测。

进一步，所述dna溶液为水作为溶剂配制的4-6mm浓度的dna溶液。

为满足检测过程中对dna溶液的使用需求，可提前配制4-6mm浓度的dna溶液。

本发明检测水中总汞及甲基汞的荧光探针试剂盒，与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明的荧光探针试剂盒中，荧光探针分子中氮原子和两个羰基氧原子作为汞离子和甲基汞的特异性识别位点，保证了汞检测选择特异性，保证了汞检测的选择特异性，避免了除汞离子和甲基汞以外其他种类金属引起的荧光响应。因此，本发明的荧光探针试剂盒能够同时对水环境中的汞离子和甲基汞进行检测。

2、本发明的荧光探针试剂盒中，还包括dna试剂，在本发明中汞离子和甲基汞与荧光探针的结合具有可逆性，可被本发明中特定碱基序列的dna竞争性结合取代，使被激发出的荧光被猝灭。因此，本发明的荧光探针试剂盒能够同时对水环境中的汞离子和甲基汞进行检测，并且，当利用该探针检测出水样中有汞存在时，可根据需要选择进一步加入dna片段，用于精确判定总汞中是否有甲基汞的存在。

3、本发明的荧光探针试剂盒能够检测出水环境中痕量汞的存在，检测方法灵敏度高，对汞离子和甲基汞的检测限分别为20nm和50nm。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明检测水中总汞及甲基汞的荧光探针试剂盒的示意图；

图2为本发明检测水中总汞及甲基汞的检测方法流程图。

附图标记说明：

1：盒体；2：缓冲液试剂；3：具塞石英比色皿；4：探针溶液；5：洗瓶；6：手提式紫外灯；7：枪头盒；8：擦镜纸；9：移液枪；10：dna试剂；11：冰盒。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语"中心"、"纵向"、"横向"、"长度"、"宽度"、"厚度"、"上"、"下"、"前"、"后"、"左"、"右"、"坚直"、"水平"、"顶"、"底"、"内"、"外"、"顺时针"、"逆时针"等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语"第一"、"第二"仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有"第一"、"第二"的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个所述特征。在本发明的描述中，"多个"的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。此外，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

使用本发明的荧光探针试剂盒检测提前配制的标准样品by-1、by-2、by-3、by-4、by-5和by-6，其中，by-1为汞离子浓度为20nm的标准水样；by-2为甲基汞浓度为50nm的标准水样；by-3为汞离子浓度和甲基汞浓度分别为20nm和50nm的标准水样；by-4为汞离子浓度为50nm的标准水样；by-5为甲基汞浓度为100nm的标准水样；by-6为汞离子浓度和甲基汞浓度分别为50nm和100nm的标准水样。

本发明所使用的缓冲液试剂为乙腈-hepes的缓冲液，且其浓度为10mm，ph为7；探针溶液为乙腈-hepes缓冲液作为溶剂配制的0.25mm浓度的探针溶液；dna溶液为水作为溶剂配制的5mm浓度的dna溶液，并且dna的碱基序列为5’-ttgtttgttggccccccttctttctt-3’。

实施例1

s11、使用移液枪吸取2.5ml的乙腈-hepes缓冲液和2.5ml的标准水样by-1加入比色皿中，混匀后在暗处使用波长为365nm的紫外灯照射，得到参比；

s12、向上述参比中加入0.1ml的探针溶液，混匀后在暗处使用波长为365nm的紫外灯再次照射，可观察到比色皿中有肉眼可见的蓝色荧光；

s13、继续向步骤s12参比中加入4μl的dna溶液，混合后在暗处使用波长为365nm的紫外灯继续照射，可观察到比色皿中的蓝色荧光消失，溶液呈现出与参比类似的性状。

由上述试验现象可知，标准水样by-1中只含有汞离子。

实施例2

s21、使用移液枪吸取2.0ml的乙腈-hepes缓冲液和3.0ml的标准水样by-2加入比色皿中，混匀后在暗处使用波长为365nm的紫外灯照射，得到参比；

s22、向上述参比中加入0.1ml的探针溶液，混匀后在暗处使用波长为365nm的紫外灯再次照射，可观察到比色皿中有肉眼可见的蓝色荧光；

s23、继续向步骤s22参比中加入5μl的dna溶液，混合后在暗处使用波长为365nm的紫外灯继续照射，可观察到比色皿中的蓝色荧光未消失，并且强度无任何变化。

由上述试验现象可知，标准水样by-2中只含有甲基汞。

实施例3

s31、使用移液枪吸取3.0ml的乙腈-hepes缓冲液和2.0ml的标准水样by-3加入比色皿中，混匀后在暗处使用波长为365nm的紫外灯照射，得到参比；

s32、向上述参比中加入0.1ml的探针溶液，混匀后在暗处使用波长为365nm的紫外灯再次照射，可观察到比色皿中有肉眼可见的蓝色荧光；

s33、继续向步骤s32参比中加入5μl的dna溶液，混合后在暗处使用波长为365nm的紫外灯继续照射，可观察到比色皿中的蓝色荧光强度有下降，但未完全猝灭，表明标准水样by-3中含有汞离子和部分甲基汞，为保证汞离子荧光能够完全被猝灭，继续加入5μl的dna溶液，荧光强度未发生变化，表明dna结合了水样中所有的汞离子。

由上述试验现象可知，标准水样by-3中含有汞离子和部分甲基汞。

实施例4

s41、使用移液枪吸取2.5ml的乙腈-hepes缓冲液和2.5ml的标准水样by-4加入比色皿中，混匀后在暗处使用波长为365nm的紫外灯照射，得到参比；

s42、向上述参比中加入0.1ml的探针溶液，混匀后在暗处使用波长为365nm的紫外灯再次照射，可观察到比色皿中有肉眼可见的蓝色荧光；

s43、继续向步骤s42参比中加入6μl的dna溶液，混合后在暗处使用波长为365nm的紫外灯继续照射，可观察到比色皿中的蓝色荧光消失，溶液呈现出与参比类似的性状。

由上述试验现象可知，标准水样by-4中只含有汞离子。

实施例5

s51、使用移液枪吸取2.5ml的乙腈-hepes缓冲液和2.5ml的标准水样by-5加入比色皿中，混匀后在暗处使用波长为365nm的紫外灯照射，得到参比；

s52、向上述参比中加入0.1ml的探针溶液，混匀后在暗处使用波长为365nm的紫外灯再次照射，可观察到比色皿中有肉眼可见的蓝色荧光；

s53、继续向步骤s52参比中加入6μl的dna溶液，混合后在暗处使用波长为365nm的紫外灯继续照射，可观察到比色皿中的蓝色荧光未消失，并且强度无任何变化。

由上述试验现象可知，标准水样by-5中只含有甲基汞。

实施例6

s61、使用移液枪吸取3.0ml的乙腈-hepes缓冲液和2.0ml的标准水样by-6加入比色皿中，混匀后在暗处使用波长为365nm的紫外灯照射，得到参比；

s62、向上述参比中加入0.12ml的探针溶液，混匀后在暗处使用波长为365nm的紫外灯再次照射，可观察到比色皿中有肉眼可见的蓝色荧光；

s63、继续向步骤s62参比中加入6μl的dna溶液，混合后在暗处使用波长为365nm的紫外灯继续照射，可观察到比色皿中的蓝色荧光强度有下降，但未完全猝灭，表明标准水样by-6中含有汞离子和部分甲基汞，为保证汞离子荧光能够完全被猝灭，继续加入6μl的dna溶液，荧光强度未发生变化，表明dna结合了水样中所有的汞离子。

由上述试验现象可知，标准水样by-6中含有汞离子和甲基汞。

由实施例1-6试验现象可知，本发明的荧光探针试剂盒能够同时对水环境中汞离子的甲基汞的检测，并可准确判断总汞中是否有甲基汞的存在。

综上，本发明利用络合作用使荧光基团的分子内旋转受限的方法，以吡啶作为识别位点，以1,8-萘酰亚胺作为荧光发射基团，当探针单独存在于溶液中时，分子内荧光基团的自由转动可以导致激发能量的湮灭，使探针只能被激发出微弱的荧光，然而，当探针分子与汞离子和/或甲基汞结合时，由于荧光基团1,8-萘酰亚胺与汞离子和/或甲基汞的配位作用限制了其在分子内以单键为轴的旋转运动，避免了能量损失，从而使激发后的荧光发射强度显著增大，实现溶液中总汞的检测。而本发明中含有胸腺嘧啶的dna片段(5’-ttgtttgttggccccccttctttctt-3’)可与汞离子牢固结合形成t-hg²⁺-t的稳定的双链结构，将汞离子与探针的结合破坏，但甲基汞与胸腺嘧啶的作用十分微弱，无法与汞离子相比，即溶液中汞离子引起的荧光被屏蔽，溶液中的荧光只能由甲基汞引起，成功实现了在检测总汞的同时还可以进一步检测出甲基汞的存在。在本发明中探针的荧光强度与汞离子或甲基汞的浓度在一定范围内具体良好的线性关系，可用于定量检测，检测灵敏度高，对汞离子和甲基汞的检测限分别为20nm和50nm。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。