一种基于谱效关系的金银花质量检测方法与流程

本发明涉及一种金银花质量检测方法，特别是一种基于谱效关系的金银花质量检测方法。

背景技术：

金银花，中药名。为忍冬科忍冬属植物忍冬lonicerajaponicathunb、华南忍冬loniceraconfusa(sweet)dc、菰腺忍冬lonicerahypoglaucamiq、黄褐毛忍冬lonicerafulvotomentosahsuets.c.cheng的花蕾。植物忍冬多分布于华东、中南、西南及河北、山西、辽宁、陕西、甘肃等地；华南忍冬多分布于广东、广西、海南；菰腺忍冬分布于浙江、安徽、福建、江西、湖北、湖南、广东、广西、四川、贵州、云南、台湾等；黄褐毛忍冬分布于广西、贵州、云南。具有清热解毒之功效。主治外感风热或温病发热，中暑，热毒血痢，痈肿疔疮，喉痹，多种感染性疾病。同时,现有针对金银花质量检测众多,但这些质量标准大多仅着眼于金银花中金银绿原酸、异绿原酸等活性成分的定量检测。事实上,中药为多组分复杂体系,其疗效的发挥为多成分、多靶点、多途径协同作用的结果,化学成分的简单定量难以全面评价中药质量优劣。

中药谱效学是在中医药理论现代研究的基础上,以中药指纹图谱为基础,以药效研究为主要内容,应用生物信息学方法建立中药指纹图谱与中药质量疗效内在关系的一门学科。目前,针对金银花谱效关系的研究较少,而基于金银花谱效关系而制定的质量标准才更能全面说明金银花品质。故而,目前尚缺乏对金银花药材优劣性的有效科学的质量评估方法,尤其是检测金银花的优劣性的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种基于谱效关系的金银花质量检测方法。本发明具有将金银花的指纹图谱与其抗炎作用进行谱效相关性研究，获得可通过其指纹图谱以直接预测其抗炎活性，从而用于判断金银花质量优劣的特点。

本发明的技术方案：一种基于谱效关系的金银花质量检测方法，包括有以下步骤：

(1)金银花hplc指纹图谱的建立；

(2)金银花抗炎作用研究；

(3)金银花指纹图谱与抗炎谱效关系的建立；

(4)基于金银花的谱效关系建立质量评价标准检测金银花质量。

前述的基于谱效关系的金银花质量检测方法中，所述步骤(1)中，金银花hplc指纹图谱的建立包括以下步骤：

供试品溶液的制备为：精密称取金银花粗粉,加入蒸馏水中，回流提取，上清液过滤，即得分析样品溶液，备用；

混合对照品溶液的制备为：分别精密称取马钱苷、新绿原酸、木犀草苷、异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c、绿原酸、金丝桃苷对照品适量，加入甲醇中，制成混合对照品溶液，备用；

hplc色谱条件为：采用agilenteclipseplusc18色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.05-0.15％甲酸水(a)-乙腈(b)，其中乙腈(b)占比为7％-30％，进样量5-15μl，体积流量0.5-1.5ml/min；柱温28-32℃；检测波长：238nm。

前述的基于谱效关系的金银花质量检测方法中，所述步骤(1)中，供试品溶液的制备为：精密称取金银花粗粉1.0g，过四十目筛，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水25ml，称重，回流提取2h，放冷，称重，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，取上清液过0.45μm微孔滤膜，即得分析样品溶液，备用；

所述混合对照品溶液的制备为：分别精密称取马钱苷、新绿原酸、木犀草苷、异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c、绿原酸、金丝桃苷对照品适量，加甲醇分别制成单一对照品储备液；分别精密吸取各单一对照品储备液1ml，置10ml量瓶，加入甲醇，摇匀，定容后，即为混合对照品溶液；

前述的基于谱效关系的金银花质量检测方法中，所述步骤(1)中，金银花hplc指纹图谱的建立中hplc色谱条件为：采用agilenteclipseplusc18色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.1％甲酸水(a)-乙腈(b)；洗脱梯度0～18min，7％～8％b；18～30min，8％～12％b；30～50min，12％～20％b；50～60min，20％b；60～65min，20％～25％b；65～70min，25％～30％b；70～80min，30％～7％b，进样量10μl，体积流量1.0ml/min；柱温30℃；检测波长：238nm。

前述的基于谱效关系的金银花质量检测方法中，所述步骤(2)中，金银花抗炎作用研究，包括小鼠耳肿胀试验、角叉菜胶足肿胀试验、慢性棉球肉芽肿试验。

前述的基于谱效关系的金银花质量检测方法中，所述步骤(3)中，金银花指纹图谱与抗炎谱效关系的建立：采用灰色关联分析方法具体包括以下步骤：

确定分析数列：

把金银花各个药效指标作为参考数列，指纹图谱中的特征峰的峰面积作用比较数列，选择药效指标为参考数列，记为y(k),k＝1,2,3,...,m；选择特征峰的峰面积为比较数列，记为xi(k)，i＝1,2,3,...,n。

变量的无量纲化：

计算灰色关联系数：

i＝1,2,3,...,n；k＝1,2,3,...,m；ρ为分辨系数，一般取0.5；

△i(k)＝∣y(k)-χi(k)∣，母序列与子序列的绝对差值；

△min＝minmin△i(k)，两极最小差值；

△max＝maxmax△i(k)，两极最大差值；

计算关联度：

采用层次分析法，计算各药效指标的初始权重系数；

plsr分析金银花抗炎的谱效关系；

以指纹图谱中各共有峰的峰面积为x，以层次分析得到的金银花抗炎的总药效数据为y，采用软件simca14.1进行偏最小二乘回归法相关性分析；计算出各x对应y的回归系数，其中回归系数代表各x对y的贡献大小，以此回归系数建模，得回归方程：

y＝19.0325-0.0346x1+0.0645x2-0.0726x3+0.0401x4+0.1227x5-0.0108x6+0.0309x7+0.1406x8-0.0802x9+0.0903x10-0.0903x11+0.0661x12+0.0488x13+0.0378x14+0.0428x15+0.1264x16+0.0320x17+0.0736x18-0.0631x19+0.0985x20+0.0209x21+0.0240x22-0.0084x23+0.0614x24-0.0082x25。

前述的基于谱效关系的金银花质量检测方法中，所述步骤(4)中，基于金银花的谱效关系建立质量评价标准检测金银花质量：基于谱效关联的金银花多指标活性成分评价方法的建立，结合灰色关联度分析法及偏最小二乘分析法结果，选择灰色关联度分析中关联度大于0.7且偏最小二乘法分析中对金银花抗炎药效呈正相关的指纹峰为特征峰，通过计算选择特征峰占总峰面积的比例来制定金银花质量评价方法。

前述的基于谱效关系的金银花质量检测方法中，所述步骤(4)中，基于金银花的谱效关系建立质量评价标准检测金银花质量：金银花的质量评价方法为：采用agilenteclipseplusc18色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.05-0.15％甲酸水(a)-乙腈(b)；其中乙腈(b)占比为7％-30％，进样量5-15μl，体积流量0.5-1.5ml/min，柱温28-32℃，检测波长为238nm，采用高效液相色谱仪检测金银花水提液，其特征峰占比色谱峰2、4、5、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、24峰面积之和占色谱峰总面积的百分比不得低于72.0-74.0％。

前述的基于谱效关系的金银花质量检测方法中，所述步骤(4)中，基于金银花的谱效关系建立质量评价标准检测金银花质量：金银花的质量评价方法为：采用agilenteclipseplusc18色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.1％甲酸水(a)-乙腈(b)；梯度洗脱0～18min，7％～8％b；18～30min，8％～12％b；30～50min，12％～20％b；50～60min，20％b；60～65min，20％～25％b；65～70min，25％～30％b；70～80min，30％～7％b，进样量10μl，体积流量1.0ml/min，柱温30℃，检测波长为238nm，采用高效液相色谱仪检测金银花水提液，其特征峰占比色谱峰2、4、5、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、24峰面积之和占色谱峰总面积的百分比不得低于73.0％。

前述的基于谱效关系的金银花质量检测方法中，所述特征峰是以绿原酸作为参照峰，特征峰与参照峰的保留时间比值为相对保留时间，其中2、4、5、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、24号特征峰的相对保留时间分别为0.285、0.639、0.817、0.917、0.957、1.025、1.171、1.202、1.367、1.418、1.517、1.557、1.665、1.697、1.754、1.949、2.09。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以金银花指纹图谱为基础，以金银花抗炎作用主要内容，结合金银花抗炎作用的灰色关联度分析及偏最小二乘法分析结果分析金银花的谱效关系，并由此建立科学、完善的金银花质量标准。本发明具有方便简洁、客观性强、重现性强等优点，使金银花的质量控制更科学完善，建立与药效明显关联并具体量化的金银花质量评估方法。

发明人进行了大量的实验，以下是部分实验研究

实验例：一种基于谱效关系的金银花质量检测方法；

第一节金银花hplc指纹图谱的建立

1仪器与材料

1.1仪器

安捷伦1260高效液相色谱仪(美国agilent公司)；mettlerae240型电子分析天平(瑞士梅特勒)；sk8210lhc型超声波清洗仪(上海商信化玻仪器有限公司)；水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；8mm圆形打孔器；auw120d十万分之一电子天平(菲律宾制造)；aty224万分之一电子天平(型号：fa1004，上海西艾爱电子有限公司)。

1.2材料

乙腈(批号：20181205，国药集团化学试剂有限公司)；水合氯醛(批号：20160705，国药集团化学试剂有限公司)；二甲苯(重庆川东化工有限公司)；蒲地蓝消炎片(批号：20180514，安徽济人药业有限公司)；阿司匹林肠溶片(批号：180914，沈阳奥吉娜药业有限公司)；生理盐水(批号：180218142，安徽丰原药业股份有限公司淮海药厂)；卡拉胶(上海伊卡生物技术有限公司)；木犀草苷(111720-201609，中国食品药品检定研究所)；马钱苷(111640-201808，中国食品药品检定研究所)；绿原酸(110753-201817，中国食品药品检定研究所)；异绿原酸a(lot：181214，中草药标准物质研究中心，成都植标化纯生物技术有限公司)异绿原酸b(lot：181209，中草药标准物质研究中心，成都植标化纯生物技术有限公司)；异绿原酸c(lot：190102，中草药标准物质研究中心，成都植标化纯生物技术有限公司)；新绿原酸(lot：181209中草药标准物质研究中心，成都植标化纯生物技术有限公司)；昆明种小鼠(许可证号：scxk(湘)2014-0011，长沙市天勤生物技术股份有限公司)，清洁级，体重20±2g，雌性，每组12只；十批金银花药材经贵州中医药大学生药学教研室孙庆文教授鉴定为10个产地金银花药材均为忍冬科植物忍冬lonicerajaponicathunb的干燥花蕾或待初开的花。十个产地金银花药材信息见表1。

表1金银花药材来源

2金银花指纹图谱的建立

2.1溶液的制备

2.1.1供试品溶液的制备

精密称取金银花粗粉1.0g(过四十目筛)，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水25ml，称重，回流提取2h，放冷，称重，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，取上清液过0.45μm微孔滤膜，即得分析样品溶液，备用。

2.1.2混合对照品溶液的制备

分别精密称取马钱苷、新绿原酸、木犀草苷、异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c、绿原酸、金丝桃苷对照品适量，加甲醇分别制成单一对照品储备液。分别精密吸取各单一对照品储备液1ml，置10ml量瓶，加入甲醇，摇匀，定容后，即为混合对照品溶液。

2.2hplc色谱条件

采用agilenteclipseplusc18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为0.1％甲酸水(a)-乙腈(b)；洗脱梯度(0～18min，7％～8％b；18～30min，8％～12％b；30～50min，12％～20％b；50～60min，20％b；60～65min，20％～25％b；65～70min，25％～30％b；70～80min，30％～7％b)，进样量10μl，体积流量1.0ml/min；柱温30℃；检测波长：238nm。

2.3方法学考察

2.3.1专属性试验

取空白溶剂(蒸馏水)和金银花药材(s2)的供试品溶液各1份，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果表明，空白溶剂不干扰测定，表明所用方法专属性良好。

2.3.2精密度试验

取金银花供试品(s2)，按“2.1.1”项下的方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，连续测定6次，以9号(绿原酸)色谱峰为参照峰(s)，计算得到各共有峰相对保留时间rsd在0.00％～0.32％之间，相对峰面积rsd在0.00％～2.86％之间，表明仪器精密度良好。

2.3.3稳定性试验

取金银花供试品(s2)，按“2.1.1”项下的方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件下分别于0、2、4、6、8、12、24h进样，以9号(绿原酸)色谱峰为参照峰(s)，计算得到各共有峰相对保留时间rsd在0.00％～2.11％之间，相对峰面积rsd分别为0.00％～0.30％之间，说明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.3.4重复性试验

取金银花供试品(s8)6份，按“2.1.1”项下的方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件下进样，以9号(绿原酸)色谱峰为参照峰(s)，计算得到各共有峰相对保留时间rsd在0.00％～0.40％之间，相对峰面积rsd分别为0.00％～2.96％之间，说明所用方法重复性良好。

2.4hplc指纹图谱的建立

分别取不同来源的金银花药材(s1～s10)，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，记录色谱图，比较10批金银花的色谱图，确定25个共有峰，其中9号峰为绿原酸，分离度好，峰形良好，含量稳定，故将其作为参照峰，计算其它共有峰的相对峰保留时间和相对峰面积，结果分别见表2、表3。将混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样分析，通过比对，确定2号峰为新绿原酸，10号峰为马钱苷，18号峰为芦丁，20号峰为金丝桃苷，21号峰为木犀草苷，22号峰为异绿原酸b，23号峰为异绿原酸a，25号峰为异绿原酸c。指纹图谱匹配见图1，共有峰模式见图2，样品与对照品叠加图见3，混合对照品图谱见图4。

表210批金银花样品主要共有峰的相对保留时间

表310批金银花样品主要共有峰的相对峰面积

2.5相似度评价

将10批金银花样品指纹图谱aia数据导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)软件进行相似度分析，结果表明，各批样品相似度在0.881～0.990，表明各批次金银花质量基本稳定，个别相似度较低的批次，可能与季节、栽培方式、采收加工等有关。10批金银花的相似度见表4。

表410批金银花的相似度

2.6不同产地金银花药材hplc指纹图谱聚类分析

将10个产地的金银花hplc色谱图样品的25个特征峰相对峰面积导入spss软件，采用类内均锁链法(averagelinkage)，以欧式距离平方(cosine)法为度量标准，建立样品间特征峰相似性聚类，结果如图5所示。10个产地的金银花可以分为四大类，s2样品为一大类，s10为一大类，s1和s7为一大类，s3、s4、s5、s6、s8、s9为一类，此结果程度与相似度一致。

第二节不同产地金银花抗炎作用研究

1仪器与试药

1.1仪器

8mm圆形打孔器；电热鼓风干燥箱(型号：101-3ab，天津市泰斯特仪器有限公司)；电子天平(型号：fa1004，上海西艾爱电子有限公司)；数显百分测厚规(0-10*30*0.01)。

1.2试药

水合氯醛(批号：20160705，国药集团化学试剂有限公司)；二甲苯(重庆川东化工有限公司)；蒲地蓝消炎片(批号：20180514，安徽济人药业有限公司)；阿司匹林肠溶片(批号：180914，沈阳奥吉娜药业有限公司)；生理盐水(批号：180218142，安徽丰原药业股份有限公司淮海药厂)；角叉菜胶(上海伊卡生物技术有限公司)。

1.3动物试验供试药液的制备

分别称取不同批次金银花饮片适量(12mg/g)，分别用12倍、10倍、10倍的蒸馏水回流提取3次，每次2h，合并滤液，浓缩，即得浓度为0.6g/ml的药液。

1.4试验动物

昆明小鼠(许可证号：scxk(湘)2014-0011，长沙市天勤生物技术有限公司)，spf级，体重18g～22g。

2方法

2.1小鼠耳肿胀试验

将144只小鼠随机分成13组，每组12只。实验分为空白对照组、西药阳性组、中药阳性对照组及给药组，其中西药阳性组给予阿司匹林肠溶片溶液，中药阳性组给予浦地黄消炎片溶液，空白对照组给予同剂量的蒸馏水。连续给药7天，第7天各组小鼠均于右耳正反两面均匀涂抹二甲苯50μl，左耳作为空白对照。致炎后30min将各组小鼠颈椎脱臼处死，然后用直径8mm打孔器在左右耳相对称部位打下耳片，用万分之一天平称重，记录其质量，计算肿胀度和肿胀率。肿胀度＝右耳质量-左耳质量；肿胀率＝(右耳质量-左耳质量)/左耳质量×100％。

2.2角叉菜胶足肿胀试验

取小鼠，随机分成13组，分为空白对照组、中药阳性组、西药阳性组以及十批金银花水提物组。空白对照组给予等量的生理盐水，阳性对照组分别给予醋酸地塞米松溶液和蒲地蓝消炎片，金银花水提物组分别给予相应剂量的提取物，各组每天给药1次，连续15d。于末次给药后1h，在每只大鼠右后足跖部皮内注射1％角叉菜胶0.1ml。在注入角叉菜胶前及注入后1、2、3、4、6h测定右后足厚度，计算其肿胀度。抑制率(％)＝[(空白对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/对照组平均肿胀度]×100％

2.3慢性棉球肉芽肿试验

取小鼠，随机分成13组，分为空白对照组、中药阳性组、西药阳性组以及十批金银花水提物组。各组小鼠适应性喂养5天之后用水合氯醛麻醉，在无菌条件下于腹部正中作一开口，用止血钳剥离皮肤至腹股沟处，将预先灭菌的50mg棉球植入腹股沟处。待动物清醒后开始给药，空白对照组ig给予等量的生理盐水，阳性对照组分别ig给予醋酸地塞米松溶液和蒲地蓝消炎片，金银花水提物组分别给予相应剂量的提取物，各组每天给药1次，连续15d。末次给药后1h，脱颈椎处死大鼠，剥离并取出棉球肉芽肿组织，置于电子天平上称质量，即为棉球肉芽肿湿质量，将棉球肉芽肿置于60℃烘箱中，干燥48h，取出称量即为棉球肉芽肿干质量。分别用棉球肉芽肿干质量减去原棉球质量即为肉芽肿质量。

抑制率(％)＝[(空白组肉芽肿质量-给药组肉芽肿质量)/空白组肉芽肿质量]*100％

3结果与结论

3.1金银花对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

与空白对照组相比，不同批次金银花及中、西药阳性对照组可降低二甲苯引起的小鼠耳肿胀度，对小鼠的炎症具有明显的抑制作用(p＜0.01)。结果见表5。

3.2金银花对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响

与空白对照组相比，中药阳性对照组、西药阳性对照组和十批金银花小鼠足肿胀度均明显降低，差异有统计学意义(p<0.05或p＜0.01)。说明金银花具有较好的抗炎作用，结果见表6和7。

3.3金银花对棉球肉芽肿的影响

与空白对照组比较，不同批次金银花以及中、西药阳性对照组小鼠肉芽肿干重均显著降低，差异有统计学意义(p<0.05或p＜0.01)。说明金银花具有较好的抗炎作用，结果见表5。

表5不同批次金银花对二甲苯致小鼠耳廓肿胀及棉球致肉芽肿的影响(n＝10，)

注：与空白对照组比，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

表6不同批次金银花对角叉菜胶足肿胀的影响(n＝10，)

表7不同批次金银花对二甲苯致小鼠角叉菜胶足肿胀的抑制率(n＝10，)

第三节金银花抗炎“谱-效”关系及多指标活性成分评价方法的建立

1层次分析法

1.1计算各药效指标的初始权重系数

为了使得药效评价指标更清楚明了，对3个金银花药效指标(耳肿胀抑制率、肉芽肿抑制率和足肿胀抑制率)进行综合评价，其中1表示两者同等重要，3表示其中一个略为重要,5表示其中一个更为重要。在足肿胀中，选择五个时间点(1h、2h、3h、4h和6h)中抑制率最高的时间点即6h下的抑制率参与谱效构建，基于以上对3个药效指标进行主观性评分，得表8下的矩阵。根据计算公式①计算初始权重系数，结果见表9。

表83个药效指标成对比较判断优先矩阵

表9金银花3个药效指标初始权重系数

1.2归一化权重系数的计算

根据公式②计算归一化权重系数，结果见表10。根据归一化权重系数得到

金银花抗炎的总药效数据，结果见表11。

表10归一化权重系数

表11金银花总药效数据

2灰色关联分析方法

2.1确定分析数列

本研究把金银花各个药效指标作为参考数列，指纹图谱中的特征峰的峰面积作用比较数列。选择药效指标为参考数列，记为y(k),k＝1,2,3,...,m。选择特征峰的峰面积为比较数列，记为xi(k)，i＝1,2,3,...,n。

2.2变量的无量纲化

表1210个产地金银花水提物峰面积均值化结果

表13金银花总药效数值均值化结果

2.3计算灰色关联系数

i＝1,2,3,...,n；k＝1,2,3,...,m；ρ为分辨系数，一般取0.5。

△i(k)＝∣y(k)-χi(k)∣，母序列与子序列的绝对差值。③

△min＝minmin△i(k)，两极最小差值。

△max＝maxmax△i(k)，两极最大差值。

2.4计算关联度

2.5数据处理结果与结论

通过灰色关联度分析法，得到总药效指标下各峰的关联度大小，结果见表14，结果显示各峰的关联度均大于0.680，表明各共有峰与总药效均具有较大相关性，说明金银花抗炎药效是多个成分共同作用的结果，关联度顺序为：峰8>峰12>峰18(芦丁)>峰16>峰3>峰11>峰20(金丝桃苷)>峰22(异绿原酸b)>峰19>峰21(木犀草苷)>峰1>峰9(绿原酸)>峰10(马钱苷)>峰13>峰24>峰14>峰2(新绿原酸)>峰17>峰25(异绿原酸c)>峰23(异绿原酸a)>峰5>峰4>峰15>峰7>峰6。

表14金银花各共有峰与总药效的关联度

3plsr分析金银花抗炎的谱效关系

3.1plsr回归方程的建立

以指纹图谱中各共有峰的峰面积为x，以层次分析得到的金银花抗炎的总药效数据为y，采用软件simca14.1进行偏最小二乘回归法相关性分析。计算出各x对应y的回归系数，见图6。其中回归系数代表各x对y的贡献大小，以此回归系数建模，得回归方程：

y＝19.0325-0.0346x1+0.0645x2-0.0726x3+0.0401x4+0.1227x5-0.0108x6+0.0309x7+0.1406x8-0.0802x9+0.0903x10-0.0903x11+0.0661x12+0.0488x13+0.0378x14+0.0428x15+0.1264x16+0.0320x17+0.0736x18-0.0631x19+0.0985x20+0.0209x21+0.0240x22-0.0084x23+0.0614x24-0.0082x25

偏最小二乘法分析结果显示，25个自变量x对y的回归系数有正也有负，即存在正相关和负相关，因为抗炎总药效数据与药效呈正相关，所以回归系数为正值的峰是对药效有贡献的峰，其中，“x2、x4、x5、x7、x8、x10、x12、x13、x14、x15、x16、x17、x18、x20、x21、x22、x24”这些自变量在抗炎药效指标下呈正相关，为金银花的药效成分组。金银花总药效的plsr模型回归系数及vip贡献见图6。

4、基于谱效关联的金银花多指标活性成分评价方法的建立

结合灰色关联度分析法及偏最小二乘分析法结果，选择灰色关联度分析中关联度大于0.7且偏最小二乘法分析中对金银花抗炎药效呈正相的指纹峰为特征峰，其峰面积之和记为a。结合药效数据，金银花a越大其抗炎作用越好。为减少色谱峰峰面积的重现性问题引起的系统误差，引入“峰占比-a％”，即a占总峰面积的百分比。各批次金银花药材a及其占比情况见表15。

表1510批金银花药材a及其占比情况

由表15可以看出，十批金银花药材中a2占色谱峰总面积为86.08％～93.64％，平均值为91.29％。按质量评价研究方法惯例，设定均值下浮20％为其质量评价的下限，及特征峰峰面积占比不得低于73.03％。综上所述，本实验设定金银花的质量评价方法为：采用agilenteclipseplusc18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为0.1％甲酸水(a)-乙腈(b)；梯度洗脱(0～18min，7％～8％b；18～30min，8％～12％b；30～50min，12％～20％b；50～60min，20％b；60～65min，20％～25％b；65～70min，25％～30％b；70～80min，30％～7％b)，进样量10μl，体积流量1.0ml/min，柱温30℃，检测波长为238nm，采用高效液相色谱仪(agilent1260)检测金银花水提液，其特征峰占比(色谱峰2、4、5、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、24峰面积之和占色谱峰总面积的百分比)不得低于73.0％。

综上所述，本发明具有将金银花的指纹图谱与其抗炎作用进行谱效相关性研究，获得可通过其指纹图谱以直接预测其抗炎活性，从而用于判断金银花质量优劣的特点。

附图说明

图1是本发明hplc指纹图谱的建立中的金银花药材指纹图谱叠加图(s1:山东临沂；s2:山东c180516；s3：湖北罗田；s4：河北巨鹿；s5：河南新乡；s6：河南封丘：s7：河南密县；s8：安徽亳州；s9：河北获鹿；s10：山东枣庄)；

图2是本发明hplc指纹图谱的建立及特征峰的指认中金银花药材共有峰模式；

图3是本发明hplc指纹图谱的建立及特征峰的指认中金银花样品与对照品色谱图的叠加图(s1-新绿原酸；s2：马钱苷；s3：芦丁；s4：金丝桃苷；s5：木犀草素；s6：异绿原酸b；s7:异绿原酸a；s8：异绿原酸c；s9：金银花样品)；

图4是本发明hplc指纹图谱的建立及特征峰的指认中金银花混合对照品图谱(1-8：新绿原酸、绿原酸、马钱苷、金丝桃苷、木犀草苷、异绿原酸b、异绿原酸a、异绿原酸c)；

图5是本发明不同产地金银花药材hplc指纹图谱聚类分析中基于hplc的金银花聚类分析图；

图6是本发明plsr回归方程的建立中金银花总药效的plsr模型回归系数及vip贡献图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例：一种基于谱效关系的金银花质量检测方法，包括有以下步骤：

(1)金银花hplc指纹图谱的建立：

所述步骤(1)中，金银花hplc指纹图谱的建立中供试品溶液的制备为：精密称取金银花粗粉1.0g，过四十目筛，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水25ml，称重，回流提取2h，放冷，称重，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，取上清液过0.45μm微孔滤膜，即得分析样品溶液，备用。

所述步骤(1)中，金银花hplc指纹图谱的建立中混合对照品溶液的制备为：分别精密称取马钱苷、新绿原酸、木犀草苷、异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c、绿原酸、金丝桃苷对照品适量，加甲醇分别制成单一对照品储备液；分别精密吸取各单一对照品储备液1ml，置10ml量瓶，加入甲醇，摇匀，定容后，即为混合对照品溶液。

所述步骤(1)中，金银花hplc指纹图谱的建立中hplc色谱条件为：采用agilenteclipseplusc18色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.1％甲酸水(a)-乙腈(b)；洗脱梯度0～18min，7％～8％b；18～30min，8％～12％b；30～50min，12％～20％b；50～60min，20％b；60～65min，20％～25％b；65～70min，25％～30％b；70～80min，30％～7％b，进样量10μl，体积流量1.0ml/min；柱温30℃；检测波长：238nm。

(2)金银花抗炎作用研究：

所述步骤(2)中，金银花抗炎作用研究，包括小鼠耳肿胀试验、角叉菜胶足肿胀试验、慢性棉球肉芽肿试验。

(3)金银花指纹图谱与抗炎谱效关系的建立：

所述步骤(3)中，金银花指纹图谱与抗炎谱效关系的建立：采用灰色关联分析方法具体包括以下步骤：

确定分析数列：

把金银花各个药效指标作为参考数列，指纹图谱中的特征峰的峰面积作用比较数列，选择药效指标为参考数列，记为y(k),k＝1,2,3,...,m；选择特征峰的峰面积为比较数列，记为xi(k)，i＝1,2,3,...,n。

变量的无量纲化：

计算灰色关联系数：

i＝1,2,3,...,n；k＝1,2,3,...,m；ρ为分辨系数，一般取0.5；

△i(k)＝∣y(k)-χi(k)∣，母序列与子序列的绝对差值；

△min＝minmin△i(k)，两极最小差值；

△max＝maxmax△i(k)，两极最大差值；

计算关联度：

采用层次分析法，计算各药效指标的初始权重系数；

plsr分析金银花抗炎的谱效关系；

以指纹图谱中各共有峰的峰面积为x，以层次分析得到的金银花抗炎的总药效数据为y，采用软件simca14.1进行偏最小二乘回归法相关性分析；计算出各x对应y的回归系数，其中回归系数代表各x对y的贡献大小，以此回归系数建模，得回归方程：

y＝19.0325-0.0346x1+0.0645x2-0.0726x3+0.0401x4+0.1227x5-0.0108x6+0.0309x7+0.1406x8-0.0802x9+0.0903x10-0.0903x11+0.0661x12+0.0488x13+0.0378x14+0.0428x15+0.1264x16+0.0320x17+0.0736x18-0.0631x19+0.0985x20+0.0209x21+0.0240x22-0.0084x23+0.0614x24-0.0082x25。

(4)基于金银花的谱效关系建立质量评价标准检测金银花质量。

所述步骤(4)中，基于金银花的谱效关系建立质量评价标准检测金银花质量：基于谱效关联的金银花多指标活性成分评价方法的建立，结合灰色关联度分析法及偏最小二乘分析法结果，选择灰色关联度分析中关联度大于0.7且偏最小二乘法分析中对金银花抗炎药效呈正相关的指纹峰为特征峰，通过计算选择特征峰占总峰面积的比例来制定金银花质量评价方法。

所述步骤(4)中，基于金银花的谱效关系建立质量评价标准检测金银花质量：金银花的质量评价方法为：采用agilenteclipseplusc18色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.1％甲酸水(a)-乙腈(b)；梯度洗脱0～18min，7％～8％b；18～30min，8％～12％b；30～50min，12％～20％b；50～60min，20％b；60～65min，20％～25％b；65～70min，25％～30％b；70～80min，30％～7％b，进样量10μl，体积流量1.0ml/min，柱温30℃，检测波长为238nm，采用高效液相色谱仪检测金银花水提液，其特征峰占比色谱峰2、4、5、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、24峰面积之和占色谱峰总面积的百分比不得低于73.0％。

所述特征峰是以绿原酸作为参照峰，特征峰与参照峰的保留时间比值为相对保留时间，其中2、4、5、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、24号特征峰的相对保留时间分别为0.285、0.639、0.817、0.917、0.957、1.025、1.171、1.202、1.367、1.418、1.517、1.557、1.665、1.697、1.754、1.949、2.09。

指纹图谱是评价中药质量的重要方法，能从整体上定性评价药材质量优劣。该发明在指纹图谱的基础上，更进一步的明确了哪些指纹峰与抗炎有密切正相关性，并以此指纹峰与为特征峰，计算特征峰在指纹图谱所有共有峰的占比值高低，评价药材优劣，即：特征峰占比值越高，影响药效指标的有效成分越多，药材抗炎作用越强。并通过10批不同产地金银花的实验数据，确定了特征峰占比不得低于73％，作为评价药材是否合格的最低限，在此限度以上，数值越高，表明有效成分越多，药效越强，质量更优。