一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道代谢组的研究方法与流程

本发明属于家禽选育技术领域，具体地说，涉及一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道代谢组的研究方法。

背景技术：

代谢物是机体与环境之间的物质和能量交换以及生物体内物质和能量的自我更新过程产生的物质，根据机体发育是否必须分为初级代谢物和次级代谢物，初级代谢物成分和含量的变化会导致机体发生突变甚至死亡，因此对代谢物的研究是必要的，最早运用代谢物检测的概念可以追溯到中国古代，人们用蚂蚁定性鉴定尿液中的葡萄糖水平。代谢组学的出现克服了只能检测单一代谢物的缺点，能够检测机体新陈代谢过程中产生的所有能够被检测到的代谢物，从代谢物检测到代谢组学检测的进步得益于相关科学技术的进步，20世纪60-70年代，气相色谱(gc)、液相色谱(lc)和质谱(mc)的发明使得代谢物的定量检测成为可能，horning及其同事运用气相-质谱联用技术测量出了人类尿液和组织中的提取物，随着高灵敏度的质谱(mc)和核磁共振技(nmr)的发现以及计算机科学催生的多元分析统计的发展，代谢组学技术终于在20世纪末诞生了。代谢组学研究对象是相对分子质量小于1000的小分子物质，研究对象的相对分子质量远远小于蛋白组学和转录组学的研究对象，检测更容易，基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学共同构成组学(omics)，基因组学、转录组学和蛋白组学都预示了机体可能将会发生的现象，代谢组学则说明了机体已经发生的现象，能够更系统、更精确地反应机体生命活动的状态，能够观测动植物体内代谢物变化与特定基因表达变化之间的联系，研究代谢产物在动植物生长发育与环境之间应答中的作用，从而进一步揭示生物体在特定时间、特定环境下代谢网络的整体状态，深入解析生命活动规律的内在机制，因此代谢组学被广泛运用于药物开发，营养学和环境科学等多种领域。

剩余采食量(rfi)是遗传育种的重要性状，低rfi往往意味着更好的产肉和产蛋性能，以rfi作为表观选择标准的同时，人们也想更深入了解高低剩余采食量家畜分子水平的区别，以期深度了解其中的机制从而进一步改进家畜育种的进程。目前将rfi与代谢组学的联合研究已有先例，franciscojosénovais等人用血清样本进行代谢组学分析寻找早期代谢组学特征，在实验中发现视黄醇代谢途径的视黄醛、孕酮、硬脂酸、沃米洛尔、2,3二氢黄酮、柠檬酸和植酸在高剩余采食量的肉牛中都高水平表达，证明维生素a在饲料效率中的重要性。barbarau等人研究限饲条件下不同饲料效率鸡的血清代谢组学特征，结果显示家禽中10中氨基酸和rfi的分级相关，其中异亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸、组氨酸和鸟氨酸是主要的高rfi的鉴别因子，肌肽、腐胺、和三酰甘油磷脂的含量与采食量和体重增加呈正相关，牛磺酸解释了与rfi相关的变异，此外与胰岛素相关的磷脂酶a2和花生四烯酸代谢有有一定的变化。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出了一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道代谢组的研究方法，该方法比较不同rfi绍兴鸭之间的差异代谢物，找到在蛋鸭的饲料利用率中起决定作用的代谢通路从而加快绍兴鸭的选育进程。

其技术方案如下：

一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道代谢组的研究方法，包括以下步骤：

步骤1、粪便样品处理

1).称取60mg样本，加入内标(l-2-氯苯丙氨酸，0.3mg/ml；lysopc17:0，0.01mg/ml，均为甲醇配制)各20μl和600μl的甲醇：水(v:v＝4:1)；

2).加入两个小钢珠，在-20℃放置2min预冷，加入研磨机(60hz，2min)；

3).超声提取10min；

4).-20℃静置30min；

5).离心10min(13000rpm，4℃)，取300μl上清液挥干，然后用400μl甲醇：水(v:v＝1:4)复溶，涡旋30s，超声2min。

6).离心10min(13000rpm，4℃)，用注射器吸取150μl的上清液，使用0.22μm的有机相针孔过滤器过滤后，转移到lc进样小瓶，-80℃下保存，直到进行lc-ms分析。

7).质控样本(qc)由所有样本的提取液等体积混合制备而成，每个qc体积与样本相同。

步骤2、lc-ms处理分析

数据采集：色谱柱acquityuplcbehc18(100mm×2.1mm,1.7um)；色谱柱温为起始温度45℃，保留2min，以10℃/min的速度升至180℃，然后以5℃/min升至240℃，再以25℃/min升至290℃，保留9min；流速0.35ml/min，载气为超纯氦气(≥99.999％)；不分流进样1.0μl；接口温度220℃；离子源温度220℃；溶剂延时6min；电离方式ei；电子能量70ev；全扫描方式，质谱扫描范围(m/z)为30～550，以每秒10张谱的方式采集。

步骤3、数据处理和分析

质谱仪和色谱仪的到的原始数据经过预处理之后。使用chromatof软件v4.22(leco)进行多重分析。对用软件预处理之后的数据集，采用模式识别的方法进行主成分分析法(pca)来分析其动态变化，将数据信息转化为空间信息，可以初步分析各组样本间的总体分布状况，自然聚集状态是否存在差异较大的样本。或者将数据集导入到simca-p13.0软件包中(umetrics,umea,sweden)进行多维统计分析，vip(variableimportance)值代表代谢物差异情况，当vip＞1.0时说明代谢物差异变化较大，并结合t检验(p＜0.05)进一步对vip＞1.0进行筛选，最终筛选出具有显著差异的代谢物。将筛选出来的这些差异代谢物的数据集，导入到metaboanalyst(http://www.metaboanalyst.ca)网站中，对这些差异代谢物所涉及的代谢通路进行进一步的分析，更深一步挖掘这些差异代谢物所蕴含的生物信息。

进一步，步骤1中，所有提取试剂使用前均在-20℃进行预冷。

本发明的有益效果为：

本发明从本研究结果来看，差异代谢物大多为糖类、脂类、氨基酸类以及少量酸和酮等，而大量学者研究表明，糖代谢、脂代谢以及氨基酸代谢有着极为紧密的联系。hrfi组直肠内容物代谢物含量显著高于lrfi组，而在肠道菌群研究中我们得知lrfi群体的肠道有益菌群多样性以及丰度显著高于hrfi群体，且lrfi组差异代谢物显著低于hrfi组，初步预测，hrfi组绍兴鸭可能对饲粮的利用效率较低，大量的营养物质在降解后经肠道吸收效率较低，随粪便排出体外造成浪费，从而在表型上表现为采食量较高，但在体增重上无明显变化，而在产蛋重上低于lrfi组。

附图说明

图1为不同rfi绍兴鸭直肠内容物pca得分图；

图2为不同rfi绍兴鸭直肠内容物pls-da得分图；

图3为不同rfi绍兴鸭直肠内容物opls-da得分图；

图4为hrfi/lrf火山图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物饲养管理

试验用绍兴鸭均来自于绍兴市诸暨市国伟禽业绍兴鸭国家级保种场，从核心群体中选取300只400日龄的绍兴鸭，饲养于3层笼养鸭舍，每个笼位间用隔板隔开，避免因互相啄食饲料而造成实验误差。饲料使用上海香川饲料有限公司的产蛋鸭高峰期配合饲料(蛋倍利)预饲期为10天，正式试验周期60天(即从410天-470天)。期间记录个体采食量，产蛋重，初体重，末体重。

1.1.2仪器设备与试剂

表1主要仪器设备

1.1.3试剂

试剂：甲醇、甲酸、水、乙腈均购自cnw公司，l-2-氯苯丙氨酸购自上海恒创生物科技有限公司，lysopc17:0购自美国avanti公司。吡啶购自德国merckchemicals公司；双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(bsfta)、三甲基氯硅烷(tmcs)购自安普生物科技有限公司；所有化学药品和溶剂均为分析纯或色谱级。

1.1.4样品采集

试验结束后对300只鸭子进行采血，使用人用静脉真空采血管翅下取2ml血液摇匀后放入冰盒内保存，转运到实验室后放入-20℃冰箱保存。根据记录数据计算剩余采食量。挑选出高rfi、低rfi个体各15只进行屠宰，收集十二指肠、盲肠以及直肠内容物约2ml置于灭菌的冻存管中，然后立即放入液氮罐中保存；取十二指肠中部剪下2cm左右组织样用无菌磷酸盐缓冲液冲洗干净后，剪碎放入灭菌冻存管中，立即放入液氮中保存，取下丘脑组织样置于灭菌冻存管中，并放入液氮中保存，上述组织样在转运回实验室后，冻存管中样品全部分类放置于冻存盒中置于-80℃超低温冰箱中保存。

1.2方法

1.2.1粪便样品处理

1.称取60mg样本，加入内标(l-2-氯苯丙氨酸，0.3mg/ml；lysopc17:0，0.01mg/ml，均为甲醇配置)各20μl和600μl的甲醇：水(v:v＝4:1)；

2.加入两个小钢珠，在-20℃放置2min预冷，加入研磨机(60hz，2min)；

3.超声提取10min；

4.-20℃静置30min；

5.离心10min(13000rpm，4℃)，取300μl上清液挥干，然后用400μl甲醇：水(v:v＝1:4)复溶，涡旋30s，超声2min。

6.离心10min(13000rpm，4℃)，用注射器吸取150μl的上清液，使用0.22μm的有机相针孔过滤器过滤后，转移到lc进样小瓶，-80℃下保存，直到进行lc-ms分析。

7.质控样本(qc)由所有样本的提取液等体积混合制备而成，每个qc体积与样本相同。

备注：所有提取试剂使用前均在-20℃进行预冷。

1.2.2lc-ms处理分析

数据采集：色谱柱acquityuplcbehc18(100mm×2.1mm,1.7um)；色谱柱温为起始温度45℃，保留2min，以10℃/min的速度升至180℃，然后以5℃/min升至240℃，再以25℃/min升至290℃，保留9min；流速0.35ml/min，载气为超纯氦气(≥99.999％)；不分流进样1.0μl；接口温度220℃；离子源温度220℃；溶剂延时6min；电离方式ei；电子能量70ev；全扫描方式，质谱扫描范围(m/z)为30～550，以每秒10张谱的方式采集。

1.3数据处理和分析

质谱仪和色谱仪的到的原始数据经过预处理之后。使用chromatof软件v4.22(leco)进行多重分析。对用软件预处理之后的数据集，采用模式识别的方法进行主成分分析法(pca)来分析其动态变化，将数据信息转化为空间信息，可以初步分析各组样本间的总体分布状况，自然聚集状态是否存在差异较大的样本。或者将数据集导入到simca-p13.0软件包中(umetrics,umea,sweden)进行多维统计分析，vip(variableimportance)值代表代谢物差异情况，当vip＞1.0时说明代谢物差异变化较大，并结合t检验(p＜0.05)进一步对vip＞1.0进行筛选，最终筛选出具有显著差异的代谢物。将筛选出来的这些差异代谢物的数据集，导入到metaboanalyst(http://www.metaboanalyst.ca)网站中，对这些差异代谢物所涉及的代谢通路进行进一步的分析，更深一步挖掘这些差异代谢物所蕴含的生物信息。

2.结果与分析

2.1绍兴鸭盲肠内容物lc-ms多元统计分析

2.1.1代谢物主成分分析(pca)

pca为非监督分析，最能反映数据的原始情况。由图1可知，在主成分分析中，r2x[1]＝0.289，r2x[2]＝0.125，且两组样品分散较为理想，但组间分散趋势不是很明显，组内差异较明显。

2.1.2偏最小二乘-判别分析(pls-da)

pls-da为有监督判别统计，运用偏最小二乘回归建立代谢物表达量与样本分组之间的关系模型，实现样品类别预测。r2x[1]＝0.294，r2x[2]＝0.253，表明lrfi组与hrfi组之间有差异，但差异偏小。具体如图2所示。

2.1.3正交偏最小二乘方-判别分析(opls-da)

opls-da同样也为有监督判别统计分析，其在pls-da的基础上滤除与分类信息无关的噪音，最大化凹显不同组别之间差异。从图3可知，两组样本在opls-da得分图上具有显著的差异。

2.2单变量统计分析

为了能够比较直观的表现不同rfi群体之间代谢物差异，我们将hrfi组对比lrfi组的代谢差异物的p值和foldchange值进行可视化处理制作火山图，可以看出相比于lrfi组，hrfi组上调差异物较多(图4)。

2.3差异代谢物及相关代谢途径分析

在opls-da分析的基础上，筛选影响较大的差异代谢物(vip>1.0)，并进行t检验(p<0.05)，同时通过www.genome.jp/kegg/网站实时鉴定代谢差异物并分析相关代谢途径。如表2，列出部分差异代谢物以及相关代谢途径。而在差异代谢物热图top50中，可以得出hrfi组与lrfi组差异代谢物有明显聚集趋势，且hrfi组中差异代谢物离散程度较大。

表2绍兴鸭直肠内容物差异代谢物

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。