一种提高液相色谱原子光谱法分析灵敏度的装置及方法与流程

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种采用原位微等离子体预富集来提高液相色谱原子光谱法分析砷形态的灵敏度的方法。

背景技术：

砷(as)是一种有毒元素，在自然界中以多种不同形态的化合物存在。砷元素的活性和毒性与其形态密切相关，其中无机砷(ias)是有毒的，毒性最强的是as(iii)，其次是as(v)，有机砷的毒性相对较小。因此，准确检测砷形态来评估其潜在的食品安全和环境安全风险是非常必要的。

近年来，高效液相色谱(hplc)、气相色谱(gc)和毛细管电泳(ce)等分离技术，与氢化物发生原子荧光光谱(hg-afs)、氢化物发生原子吸收光谱(hg-aas)和电感耦合等离子体质谱(icp-ms)等检测器联用被广泛应用于as元素的形态分析。其中，lc-hg-afs和lc-hg-aas由于方便操作和仪器成本低，抗干扰能力强，是性价比较高的砷形态分析仪器。但是与hplc-icp-ms相比，lc-hg-afs和lc-hg-aas的分析灵敏度还不能满足超痕量砷形态的分析测定。因此，利用简单和快速的预富集方法来提高分析灵敏度至关重要。液-液萃取、浊点萃取和固相萃取等经常被用来提高hg-afs和hg-aas的分析灵敏度，但是这些预富集方法具有样品消耗多、操作耗时、试剂消耗大等缺点，尤其是进样量有限时，提高仪器的绝对分析灵敏度会比较困难。而采用原位气相富集技术可以在不增加进样量的前提下提高分析灵敏度，是一个非常好的解决方案。

气相富集(gpe)是一种很好的预富集技术，具有操作简单、成本低等优点。常见的gpe材料(包括石英管、石墨炉和钨丝等)是基于加热条件进行预富集的，而介质阻挡放电(dbd)作为低温等离子体(ntp)，可在常温下工作，体积小、结构简单、成本/能耗低，已被广泛应用于各个领域。在用于气相富集之前，dbd可以用作原子化器、化学蒸气发生器(cvg)或发射光谱激发源。2006年，zhu等证明了dbd不仅可以用于测定总砷，还可以将lc与hg-aas联用测定砷形态，但是该报道中dbd用作原子化器，而非气相富集手段。liu和mao首先使用双层石英管作为dbd反应器，采用hg-afs对砷进行了预富集，并通过工作气体o2或h2的切换对总砷实现了稳定、精确的捕集/释放。之后，kratzer等证实了采用平板dbd-hg-aas，实现了同样的总砷预富集效率。

在先前的研究(如专利cn105806689a)中主要采用化学蒸气发生进样装置，样品为水样或者酸体系的消解液，在强酸性和氧化性的消解液中砷的形态全部转化为五价砷，再使用dbd捕获的是总砷，而液相色谱-原子荧光法(lc-afs)测定砷形态时导入原子荧光的是不同价态的砷(如专利cn2788181y)，如三价砷、五价砷、一甲基砷、二甲基砷等，因此生成的砷的气态氢化物与之前的研究(如专利cn105806689a)也完全不同，因此需要dbd全新的方法创新才能实现不同形态砷的精准捕获和释放；并且，液相色谱不同于之前的化学蒸气发生进样装置，需要全新的装置设计与方法创新，才能实现无机砷及其他砷形态的准确、灵敏测定。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种提高液相色谱原子光谱法分析砷形态的灵敏度的装置及方法。

本发明所提供的提高液相色谱原子光谱法分析砷形态的灵敏度的装置，由四部分组成，即液相色谱分离系统(lc),氢化物发生装置(hg)，原位介质阻挡放电(dbdt)预富集装置，以及原子光谱仪，所述液相色谱分离系统(lc)、氢化物发生装置(hg)、原位dbdt预富集装置和原子光谱仪按照待测液流动方向依次串联；

所述装置还包括一台与原子光谱仪连接的计算机(pc)用于分析和输出原子光谱仪的分析结果；

所述液相色谱分离系统由lc柱、lc泵和进样器组成；

所述lc柱为用于砷形态分离的色谱柱；

所述氢化物发生装置由气液分离器、蠕动泵或流动注射系统、进样管路、出口管路组成，进样管路连接液相色谱出口和氢化物反应试剂，经蠕动泵或流动注射系统，导入气液分离器，出口管路连接原位dbdt预富集装置的入口管路；

所述原位dbdt预富集装置由dbdt反应器、高压电极、地线、入口管路组成，其中dbdt反应器可以是单/双层或者多层石英或陶瓷或其他材质的介质，可以是同轴型、平板型或其他结构，高压电极和地线保持合适距离，以击穿工作气体放电，而不至于击穿损坏介质，入口管路连接所述氢化物发生装置的出口管路；

所述原位dbdt预富集装置用于取代所述原子光谱仪的原子化器或激发源，并与所述原子光谱仪的信号采集光路保持适当距离；或者，所述原位dbdt预富集装置与所述原子光谱仪的原子化器或激发源通过适当长度管路连接；

通过进样器吸取待测溶液，通过液相泵将溶液引入lc柱中进行液相色谱分离；

经液相色谱分离的流出液导入所述氢化物发生装置的气液分离器，与含一定浓度的nabh4或kbh4和koh混合溶液、2％～5％(v/v)的盐酸溶液混合反应，生成砷的氢化物，在气液分离器中完成气液分离；

不同形态砷经过所述氢化物发生装置所产生的砷化氢气体，根据分离时间，选择其中一种或几种砷形态依次通过三通阀(v3)导入到所述原位dbdt预富集装置的入口管路，原位dbdt预富集后经原子光谱仪分析该砷形态的含量，未被选择的砷形态则通过三通阀(v3)的切换直接导入原子光谱仪进行分析；

选择的某种或几种砷形态的砷化氢气体随载气进入所述dbdt反应器，同时将氧气或者空气通入所述原位dbdt预富集装置的入口管路，控制电源电压，dbdt反应器内的工作气体放电产生低温等离子体，完成砷的捕获；氩气源三通(v2)切换气路至dbdt反应器方向，氩气吹扫一段时间消除水汽或其他干扰；由氢气源将氢气通入dbdt反应器，控制电源的电压，dbd反应器内的工作气体放电产生低温等离子体，完成砷的释放，再进入原子光谱仪分析所选定的某种或几种砷形态的含量。

所述原子光谱仪可为原子荧光光谱仪、原子吸收光谱仪、原子发射光谱仪中的一种。

本发明还提供一种提高液相色谱原子光谱法分析砷形态的灵敏度的方法。

本发明所提供的提高液相色谱原子光谱法分析砷形态的灵敏度的方法，为：待测样品中所有的砷形态被提取，直接经液相色谱分离；或者，在提取时加入双氧水，将其中的三价砷氧化为五价砷，再经过液相色谱分离；之后根据分离时间，各砷形态被依次导入所述氢化物发生装置，生成氢化物，导入所述原位dbd预富集装置后被原子光谱仪检测，所测砷含量即为不同砷形态含量。

其中，所述原位dbdt预富集装置预富集砷的操作为：在含氧气氛下，所述dbdt反应器放电产生低温等离子体，完成砷的捕获，在含氢气氛下，所述dbdt反应器放电产生低温等离子体，完成砷的释放；

所述待测样品可为：食品、农产品、水、土壤或沉积物、生物样品、饲料、肥料、大气沉降物中的任意一种；具体可为大米；

待测样品中所有的砷形态包括：三价砷(as(iii))、二甲基砷(dma)、一甲基砷(mma)、五价砷(as(v))等。

所述液相色谱分离的运行条件如下：

色谱柱为用于砷形态分离的色谱柱，具体可为hamiltonprp-x100阴离子交换柱(250mm×4.1mm,10μm)；

流动相：15mmnh4hpo4(ph＝6.0)；

进样体积：100μl；

流速：1ml/min；

使用dbd反应器代替原子光谱仪原有的原子化器或激发源。

在这项研究中，我们尝试采用：(1)lc-afs结合原位dbdt的方法测定大米样品中无机砷；(2)lc-aas和lc-aes结合原位dbdt的方法测定大米样品中的砷形态。在此次研究中，无需增加进样时间和体积，采用dbdt预富集将原子光谱仪分析砷形态的绝对分析灵敏度提高了10倍以上。通过标准曲线的线性、检出限(lod)、精密度和准确性的验证，证明了该分析方法的可行性。该法具有简单、低成本、小体积、绿色和安全等优点，并且dbdt预富集不仅提高了分析灵敏度，也消除了价态歧视，对于砷形态分析来说是很有应用前景的。

附图说明

图1为本发明中所使用的lc-hg-dbdt原子光谱仪器系统的示意图，其中气泵；v1(溶液与硼氢化钾混合三通)、v2(氩气源三通)、v3(氢气源三通)和v4(空气源三通)，三通切换阀；原子光谱检测器，可以为原子荧光光谱仪(afs)、原子吸收光谱仪(aas)或原子发射光谱仪(aes)；pc，计算机。

图2为hg和dbdt(含空白)条件下四种砷形态标准溶液的色谱图对比，三价砷(as(iii))、二甲基砷(dma)、一甲基砷(mma)、五价砷(as(v))的浓度均为5μg/l。

图3为h2o2浓度对as(iii)氧化的影响。

图4为捕获过程中空气流量和放电电压的影响(n＝3)。a(空气流速)，将110ml/min的信号设置为100；b(放电电压)，将11kv的信号设置为100，其他信号参照该值进行归一化。

图5为载气吹扫时间的影响(n＝3)。190s扫描的信号设置为100，其他信号参照该值进行归一化。

图6为h2流量和放电电压对释放的影响(n＝3)。a(h2流速)，将180ml/min的信号设置为100。b(放电电压)，将13kv下的信号归一化为100，其他信号参照该值进行归一化。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

原子荧光光谱仪、原子吸收光谱仪或原子发射光谱仪与所述原位dbd预富集装置耦合后用于砷形态分析。

实施例1、采用lc-hg-dbdt-afs测定大米样品中无机砷

色谱分离系统由hamiltonprp-x100分析柱(250mm×4.1mm,10μm，美国汉密尔顿公司)，sa-10lc泵(shimadzu，japan)和进样器(北京吉天仪器有限公司，北京)组成。配有100μl样品定量环。流动相为15.0mm(nh4)2hpo4，使用hcooh和nh4oh将ph调节至6.0后，采用0.22μm滤膜过滤，并将其在进入色谱柱之前使用超声水浴脱气。原子荧光光谱仪，配备氢化物发生(hg)装置和砷空心阴极灯(hcl)(北京有色金属研究总院)。lc-hg-dbdt-afs系统的示意图如图1所示。优化的dbdt-afs和lc操作条件总结于表1中。

表1lc-hg-dbdt-afs运行条件

表2真实大米样品中的无机砷含量(n＝3)

实施例中采用的化学品和标准品如下：

去离子水用于制备标准溶液、洗脱液和样品溶液；盐酸，硝酸，双氧水，还原剂为1％(m/v)kbh4溶解于0.18％(m/v)的koh溶液。

大米有证标准物质(crm)(gbw(e)100348，gbw(e)100359，钢研纳克标准物质中心)：gbw(e)100348：总砷含量为0.23±0.03mg/kg，ias含量为0.18±0.03mg/kg；gbw(e)100359：总砷含量为0.15±0.02mg/kg，ias含量为0.13±0.02mg/kg。

砷标准溶液(1mg/ml)用于测定总砷含量。as形态标准溶液如下：亚砷酸根溶液(as(iii)，75.7±1.2μg/g)；砷酸根溶液(as(v)，17.5±0.4μg/g)；一甲基砷溶液(mma，25.1±0.8μg/g)；二甲基砷溶液(dma，52.9±1.8μg/g)，砷及其形态标液购自国家标准物质研究中心，4℃冷藏。载气为99.999％的氩气，h2和空气分别由氢气发生器和气泵产生。

总砷分析

大米样品在北京市场购买。称量约0.200g的大米到聚四氟乙烯管中，加入3mlhno3和2mlh2o2，冷消解过夜。然后将其放入微波消解仪中。微波系统运行程序如下：(1)80℃保持3min；(2)100℃保持3min；(3)130℃保持3min；(4)160℃保持3min；(4)190℃保持25min。微波运行程序完成后，将其赶酸至0.5ml。再将其转移至25ml样品管中，定容至25ml。使用0.22μm过滤后，上机测定。

砷形态的提取

称取0.2～1.0g的大米样品放入聚四氟乙烯管中，加入10ml的1％(m/v)hno3-1％(m/v)h2o2溶液，进行微波萃取。微波萃取系统运行程序为5min升温至90℃，并在90℃下保持30min。冷却后，将提取液转移到离心管中，10000rpm离心10min。离心后，上清液通过0.22μm滤膜过滤，上机测定。

lc-hg-dbdt-afs的分析程序

lc-hg-dbdt-afs的分析程序包括以下6个步骤。(1)砷形态分离：首先，用自动进样器吸取100μl溶液，然后，通过液相泵将溶液引入lc柱中。(2)生成砷形态的氢化物：从lc柱中流出的溶液与1％(m/v)kbh4(溶于0.18％(m/v)koh溶液)中混合，然后，将混合液通过蠕动泵引入gls系统，与盐酸混合。此时，ar以400mlmin^-1进入gls，并以氢化砷形式进入dbd系统。(3)无机砷捕获：根据as(v)的保留时间(580～710s)，在空气-ar气氛下以11kv放电，将as(v)生成的砷化氢引入dbdt中，以氧化砷的形式捕获；(4)吹扫时间：通过用氩气吹扫190s，消除水分干扰。(5)as(v)的释放：在h2-ar气氛下13kv电压放电，以砷原子形式释放。(6)砷形态检测：将释放出的砷原子引入afs中进行测量，其中总as(v)定量为ias。为了节省ias分析时间，仅采用原位dbdt来预富集as(v)，而不是对lc分离后的每种砷形态进行预富集。因此，通过lc-hg-afs直接测量dma和mma时，dbdt是关闭的，dbdt在关闭状态时，氢火焰的作用是原子化。

结果与讨论

lc-hg-dbdt-afs的仪器设计

在有限的进样体积下，对于从lc色谱柱流出的分析物进行原位预富集是非常有意义的。因为常规预富集方法(例如spe、lle、cpe)溶液消耗量较大，不适合在lc之后进行原位预富集。在我们以前的研究中，原位dbdt在不增加进样体积的情况下提高了仪器的绝对灵敏度，已成功应用于水和生物样品中as的富集。它为我们提供了一个启发，即原位dbdt结合lc可能是解决lc-afs灵敏度不足问题的有效方案。因此，本研究构建了lc-hg-dbdt-afs系统，采用三层同心石英管来代替afs原有的原子化器。为了测试砷形态的分离性能，测量了一系列5μg/las(iii)、dma、mma和as(v)标准溶液，结果如图2所示。根据所需的保留时间，将as(iii)、dma和mma直接带入afs中，而无需dbd预富集，因此它们色谱峰的保留时间在原始位置。但是，考虑到原始的as(v)峰较宽且较低，表明灵敏度相对较低，将原位dbdt在580s至710s(图2)中通电以捕获as(v)。因此，as(v)峰在原始保留时间消失了。当释放过程开始时，as(v)峰在～900s处再次出现，并且比以前更尖。从观察结果看，尖锐的峰意味着as(v)的绝对分析灵敏度明显提高。同时，相同的峰面积(前者：后者＝1：0.99)表明在lc-dbdt系统中as(v)形态可以100％捕获和释放。以上结果证明，lc-hg-dbdt-afs不仅能够很好地分离出不同的砷形态，还可以预富集as(v)。

as(ⅲ)的氧化处理

为了尽量提高lc-afs对砷形态的检测能力，通常采取氧化或还原反应将as(iii)和as(v)合并为ias。在这项工作中，考虑到dbd的富集，在萃取过程中使用h2o2将as(iii)转化为as(v)。为了优化h2o2的最佳浓度，称取1.0g大米(添加1.0μgas形态标液)，然后加入1％hno3溶液(含0.1％、0.5％、1％、2.5％或5％h2o2)进行萃取。采用微波萃取系统90℃提取30min。从图3中可以看出，当h2o2含量超过0.5％时，可以发现as(iii)的回收率为0，而as(v)相应地成倍增加，这说明as(iii)完全氧化成了as(v)。同时，dma和mma回收率保持不变，证明as(iii)不会转化为有机砷，有机砷也不会转化为as(v)。因此，为确保as(iii)完全氧化，选择了1％h2o2+1％hno3作为提取溶剂。

as(v)捕获

lc-hg-dbdt-afs通过dbd预富集as(v)，载气和捕获电压是影响dbd捕获的关键因素。在之前的研究中，证明了含o2的气氛能有效捕获砷，考虑到易于获取和安全性，可以用空气代替o2。将10～150ml/min空气与ar混合，结果如图4-a所示。考虑到原子荧光猝灭，在实验中选择了as(v)的释放信号来评估捕获效率。随着空气流速的增加，砷的af信号上升到110ml/min，然后保持平稳。因此，考虑到信号值和相对标准偏差(rsd)，选择110ml/min。另一方面，放电是产生ntp的关键参数，实验中研究了其对as(v)捕获的影响。如图4-b所示，af信号在超过11kv时达到最高点；同样，该结果与图2中所示的100％捕获一致，这说明dbd完全捕获了as(v)。因此，选择了11kv作为捕获电压，空气流速为110ml/min进行捕获。

as(v)释放

hg产生的水分过多不利于保持dbd等离子体。因此，必须在dbd释放或原子化前除去水分。一些研究人员使用干燥剂来去除水分，但是干燥剂寿命短且不方便，而载气吹扫简单有效，可消除水分。氩气在不同的时间作用于dbdt，结果如图5所示。信号从30s显著上升至190s，此后保持平稳。因此，选择最佳释放时间为190s，以消除水分干扰。

h2和放电电压是影响dbdt释放as(v)效率的关键因素，其中h2被认为是释放过程中氢自由基的直接来源。实验研究了h2对释放信号的影响，结果见图6-a，在<180ml/min时，as信号随h2流速增加而增加。在180ml/min处达到平稳，并具有良好的rsd。在图6-b中，信号随着放电电压升高至13kv而增加，然后保持平稳。因此，选择13kv为释放电压，180ml/min为h2流速。此外，根据图2，有和没有富集的峰面积比接近1，证明as被100％释放，并且在从dbdt到检测器的过程中没有分析物损失。

分析性能

使用as(iii)、dma、mma和as(v)的混合标液验证了lc-hg-dbdt-afs系统的校准曲线在0.5～50μg/l范围内，相关系数>0.997。仪器检出限(进样量＝100μl)由公式3σ/m计算，在空白中进行11次测量(σ为标准偏差，m为校正曲线的斜率)，为0.05μg/l；根据公式10σ/m估算的相应定量限为0.18μg/l。相比之下，没有通过dbdt预富集的仪器检出限为0.6μg/l，该法将检出限降低了11倍。当称取1g样品时，lod方法为0.5μg/kg。使用5μg/l的as(v)标准溶液(n＝6)重复进行测量的rsd值为1.9％，说明仪器有很好的精密度。为了比较已建立的lc-hg-dbdt-afs方法，该方法的检出限明显优于其他lc-hg-afs或lc-hg-aas方法，并且与lc-icp-ms方法相当。

实际样品分析

为了验证所建立的方法，在表2中，分别通过lc-hg-dbdt-afs和lc-icp-ms测定了包括crm(gbw(e)100348和gbw(e)100359)在内的实际样品。结果表明，标准物质的结果在认证的不确定度范围内；实际样品的加标回收率为93％至102％，与lc-icp-ms相比，无显著差异(p>0.05)。因此，说明采用该方法测定大米样品中的ias具有较好的准确度和精密度。

4.结论

首次将lc与dbdt结合用于ias的气相预富集，构建了lc-hg-dbdt-afs仪器来提高分析灵敏度。仅用100μl进样量，检出限为0.05μg/l，将分析灵敏度提高一个数量级(峰高)。与传统的预富集方法(如spe、lle、cpe)相比，由于操作简单，不需要有机试剂，更简单和环保。

实施例2采用lc-hg-dbdt-aas测定大米样品中砷形态

色谱分离及样品提取方法同实施例1相同。本实施例将原子吸收作为检测器替换了实施例1的原子荧光，dbd反应器平板型结构。运行条件参考表1稍作优化，详见表3-a。

本实施例中，构造的lc-hg-dbdt-aas，采用t型石英管来代替aas原有的原子化器。根据所需的保留时间，开启dbdt将dma、mma和as(v)进行预富集。因此，几种形态在相应保留时间的峰消失了。当释放过程开始时，相应砷形态的峰再次出现，比以前的峰形更尖锐。通过样品的加标回收率确定了该方法的可行性，见表3-b。

表3-alc-hg-dbdt-aas运行条件

表3-b真实大米样品中的砷形态含量(n＝3)。

实施例3采用lc-hg-dbdt-aes测定大米样品中砷形态

色谱分离及样品提取方法同实施例1相同。本实施例将aes作为检测器替换了实施例1的原子荧光光谱仪。dbd为圆柱形，主要由石英管组成，钨棒电极和铜线圈电极。60mm长石英管(内径3mm，外径5mm)安装在ptfe基座上。将接地的铜线圈包裹起来紧紧在石英管外部，距石英管顶部10mm。钨棒(直径1mm)的中心位于石英管作为另一个电极。钨电极和接地电极尖端之间的距离大约5mm。运行条件见表4-a中，通过样品的加标回收率确定了该方法的可行性，实验数据见表4-b中。

表4-alc-hg-dbdt-aes运行条件

表4-b真实大米样品中的砷形态含量(n＝3)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。