高含量泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用的制作方法

本发明涉及食品检测领域，具体涉及高含量泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用。

背景技术：

蜂花粉是蜜蜂采集蜜粉源植物的花粉，与自身分泌物混合形成花粉团，储存在蜂巢中的一种食物。蜂花粉中含有大量的蛋白质，是蜂蜜蛋白质食物的主要来源。此外，蜂花粉中还含有丰富营养物质，如氨基酸、酚酸黄酮和矿物质等，对人体具有较好的美容、保健等功效，深受广大年轻女性和老年人的喜爱。

当前蜂花粉已经成为常见的食物或保健品。尽管蜜粉植物种类总多，但是能够大量生产蜂花粉品种主要有油菜粉、茶花粉、玫瑰粉、玉米粉、荷花粉、五味子粉、荞麦粉以及混合的杂花粉等，其中油菜粉和茶花粉产量最大。但是油菜粉和茶花粉的口感不佳，不被消费者人群所喜爱，因此，这两种蜂花粉的售价较低。相比之下，玫瑰花粉的香味宜人，深受消费者的喜爱。由于玫瑰蜂花粉总产量非常有限，售价往往是其它品种蜂花粉数倍以上，尽管如此，玫瑰蜂花粉依然供不应求。部分不良企业为了追逐高额利润往往采用其它品种的蜂花粉冒充玫瑰花粉，甚至在玫瑰蜂花粉中掺入淀粉等进行掺假。蜂花粉掺假现象不仅损害了蜂花粉消费者的正当权益，而且危害了蜂产品消费行业的健康发展和市场秩序。当前，现有技术中没有关于玫瑰蜂花粉真实性的评价标准及方法，如何鉴别玫瑰蜂花粉的真实性已经成为蜂产品行业亟待解决的问题。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供了泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷（nepetin-4',7-di-glc）作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用，具体以玫瑰蜂花粉中的特征性内源性物质泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷作为其标志物，用来评价玫瑰蜂花粉的真实性。

本发明通过液相色谱串联高分辨质谱的正负模式对大量的玫瑰蜂花粉以及其它常见的蜂花粉进样分析时发现了玫瑰蜂花粉在正模式下的总离子流色谱图中存在一个含量较高的化合物，其色谱保留时间为7.16min，精确质量数为m/z641.17014，并经过多步骤的检索、比对和分析，得出该化合物泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的具体结构如下所示：

。

基于获得的对照品，本实施例采用lc-ms初步建立了花粉中泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的准确定量分析方法。另外，本发明从玫瑰蜂花粉的主产地云南以及其它省市共采集了20余份花粉样本，样本经前处理之后，由开发的lc-ms方法进样分析，结果发现玫瑰蜂花粉中泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的含量较为稳定为600-900mg/kg。而其它品种的蜂花粉中，该物质的含量很低，甚至检测不到。因此，本发明提出将泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用，即可以将泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷用于玫瑰蜂花粉的真实性鉴别及纯度评价。

本发明进一步提出一种玫瑰蜂花粉的真实性评价方法，以所述泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷为特征性标志物对蜂花粉样本进行检测；若所述蜂花粉样本中所述泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的含量介于600-900mg/kg，判断所述蜂花粉样本为玫瑰蜂花粉；若所述蜂花粉样本中所述泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的含量低于600mg/kg，判定所述蜂花粉样本为其它蜂花粉或者掺假玫瑰蜂花粉。

作为优选，通过加入泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的空白蜂花粉（油菜蜂花粉，该花粉中不含有此物质）确认泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的含量与峰面积间的线性关系，根据蜂花粉样本中泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的峰面积推算其含量。

作为优选，采用uhplc-q-orbitrap（超高液相色谱-高分辨质谱）或lc-ms/ms检测蜂花粉样本。

作为优选，泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷在uhplc-q-orbitrap的精确提取离子流色谱图中含有m/z641.17014([m+h]⁺)准分子离子峰，其精确质量数的误差应当小于5ppm；优选泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷色谱峰的保留时间为7.16min，保留时间允许的偏差应小于0.3min。

此外，为了提高玫瑰蜂花粉的鉴别能力，泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的精确质量数和保留时间除了满足上述条件之外，该物质的ms/ms图谱（子离子图谱）中应该含有其主要的碎片离子，本发明进一步发现了其特征碎片离子：m/z302.04163、m/z317.06491和m/z479.11771，其精确质量数的误差应当小于10ppm。基于上述ms/ms图谱中提供的主要碎片离子，即便是在无泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷对照品的情况，依然可以通过判定蜂花粉样本中含有玫瑰蜂花粉，并可积分母离子峰面积用于玫瑰蜂花粉含量的计算。

作为优选，采用uhplc-q-orbitrap对蜂花粉样本进行检测时，液相条件如下：

采用c18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相a，0.1%的甲酸乙腈为流动相b，采用梯度洗脱程序分离：0.0-2.0min，5%的流动相b；2.0-7.0min，5-30%的流动相b；7.0-14.0min，30-95%的流动相b；14.0-18.0min，95%的流动相b；18.0-20.0min，5%的流动相b。

作为优选，液相的流速为0.30ml/min。

作为优选，进样量为5.0µl。

作为优选，采用uhplc-q-orbitrap对蜂花粉样本进行检测时，质谱条件如下：

离子源参数：鞘气的流速45；辅助气的流速10；挡锥气的流速0；电喷雾电压3.5kv；离子导管的温度320℃；s-lensrflevel设为60；离子源的温度350℃；

作为优选，采集的模式为正离子模式下的fullms-ddms²：其中fullms的具体参数设置如下：分辨率：70000；agctarget：3e6；maximumit：100ms；scanrange：80-1200da；spectrumdata：centroid；其中dd-ms²的具体参数设置如下：分辨率：17500；agctarget：1e5；maximumit：50ms；loopcount：2；isolationwindow：2.0da；nce：35ev；spectrumdata：centroid；在ddsettings中，minimumagc：8.0e3；apextrigger：2-6s；excludeisotope：on；dynamicexclusion：8.0s。

采用lc-ms/ms对所述蜂花粉样本进行检测时，由于检测仪器的不同，lc-ms/ms的液相和质谱设置条件与uhplc-q-orbitrap差异较大。

进一步地，采用lc-ms/ms对所述蜂花粉样本进行检测时，液相条件如下：采用c18色谱柱（优选采用较短的c18色谱柱），柱温为25℃，以0.1%的甲酸水为流动相a，0.1%的甲酸乙腈为流动相b，采用梯度洗脱程序分离：0-1.5min，10%的流动相b；1.5-7.5min，10-90%的流动相b；7.5-8.9min，90%的流动相b；8.9-9.0min，90-10%的流动相b；9.0-10.0min，10%的流动相b。

作为优选，液相的流速为0.30ml/min。

作为优选，进样量为3.0µl。

作为优选，为了准确定量蜂花粉中的泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷，采用lc-ms/ms对蜂花粉样本进行检测时，选择多反应监测(mrm)的监测方式，mrm关键参数的设置如下：泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的fragementor：60v，641.2>317.0，30ev，641.2>479.1，15ev。

质谱条件如下：电喷雾离子源(esi)；扫描方式：正离子扫描；离子喷雾电压：3500v；雾化气压力：45psi；干燥气温度:300℃；干燥气流速：5l/min；鞘气温度：250℃；鞘气流速:11l/min。

其中，泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的详细mrm参数设置参见表1。

为验证建立的lc-ms/ms方法科学合理性，本发明考察了该方法的准确度和精密度，变异系数均小于10%，完全符合残留检测分析的要求。

基于本方法采用的仪器和公布的参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱或者液相串联三重四极杆质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整。

进一步地，在检测前，还包括利用甲醇水对所述蜂花粉样本进行提取的步骤；

优选所述蜂花粉样本与甲醇水的质量体积比1：（9~11）；更优选为1：10。

在所述甲醇水中，优选甲醇与水的体积比为2：（7~9），更优选为2：8。

作为优选，采用uhplc-q-orbitrap对蜂花粉样本进行检测前，将蜂花粉按1：10000的质量体积比充分溶于甲醇水中，进行提取。

作为优选，所述提取具体包括如下步骤：将蜂花粉研磨成粉末，取0.8g蜂花粉粉末样品:7.2ml甲醇水的比例将其混合，并使蜂花粉充分混匀，20194g高速离心20min，再取10µl提取液：990µl甲醇水的比例稀释一次，再按照100µl提取液，900µl甲醇水的比例稀释一次。

本发明涉及到的试剂在市场上均可获得，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到较优的实施方式。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明首次公布了高含量泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷可作为玫瑰蜂花粉真实性和纯度评价的指标，并提出了采用液相串联质谱(uhplc-q-orbitrap或lc-ms/ms)检测蜂花粉中泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的方法。基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度，检出限可以达到1µg/kg。

（2）本发明对泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的lc-ms/ms检测方法和关键的检测参数进行了优化，可以准确定量玫瑰蜂花粉中泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷含量。

（3）本发明提供的检测方法简单、高效，便于操作和推广，对保护蜂花粉消费者的合法权益和维护蜂花粉消费行业的健康发展具有重要的现实意义。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的玫瑰蜂花粉中特征性标志物泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的化学结构；

图2为本发明实施例1提供的玫瑰蜂花粉在uhplc-q-orbitrap正离子模式下离子流图谱；其中a为总离子流色谱图，b为泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的精确提取离子流色谱图；

图3为本发明实施例1提供的泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷在uhplc-q-orbitrap正离子模式下的质谱图；其中a为全扫描质谱图，b为精确质量数的子离子质谱图，c为碎片离子m/z317.06481的子离子图谱(ms³)；

图4为本发明实施例2提供的lc-ms/ms的mrm模式检测8种主要的不同品种蜂花粉中泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的含量；

图5为本发明实施例3提供的20种商品化玫瑰蜂花粉样品中的泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷含量情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

仪器与试剂：

1.质谱仪(q-exactiveplus)，美国thermofisherscientific公司；

2.1200series液相色谱-6460三重四级杆质谱，美国agilenttechnologies公司；

3.台式低温离心机(microfuge22rcentrifuge)，美国beckmancoulter公司；

4.电子分析天平(pl203)，德国mettlertoledo公司；

5.超纯水机(milli-qgradient)，美国millipore公司；

6.涡动仪(g560e)，美国scientificindustries公司；

甲酸(fa)购买于上海安谱实验科技股份有限(cnw)公司；乙腈(acn)和甲醇(meoh)购买于fisher公司。

实施例1

本实施例首先通过液相色谱串联高分辨质谱的正负模式对大量的玫瑰蜂花粉以及其它常见的蜂花粉进样分析。实验结果表明玫瑰蜂花粉在正模式下的总离子流色谱图中存在一个含量较高的化合物，如图2所示，其中的a为玫瑰蜂花粉总离子流色谱图，b为发现的含量较高的化合物的精确提取离子流色谱（提取窗口为5mda），其色谱保留时间为7.16min，精确质量数为m/z641.17014（如图3中的a所示）。此外，该化合物在玫瑰蜂花粉中的含量显著区别于其它常见蜂花粉品种。图3中的a、b和c分别展示了该化合物的全扫描质谱图(ms)、子离子质谱图(ms/ms)以及碎片离子的子离子质谱图(ms³)。

基于高分辨质谱提供的精确质量数m/z641.17014，本实施例获得该物质的元素组成为c28h33o17⁺。在该物质的ms/ms图谱中；该物质峰的主要碎片含有m/z479.11711和m/z317.06491。随后，本实施例采用compounddiscoverer2.0软件对该物质进行多重化学物质数据库进行检索，如m/zcloud、chembank等。实验结果表明数据库中并没有检索到该化合物，表明该物质属于一个全新的化合物。尽管如此，数据库对比数据表明碎片离子m/z317.06491为泽兰黄酮，其子离子图谱（图3中的c）中的精确质量数的碎片离子能够与m/zcloud中的数据完全匹配上，匹配率高达99%。另外，母离子m/z641.17014与碎片离子m/z479.11711和m/z317.06491，相继相差162da的中性丢失，而精确质量数表明该中性丢失为c6h10o5(m/z162.05282)，表明该中性丢失可能为葡萄糖。基于上述信息，本实施例推断该化合物为泽兰黄酮的双葡萄糖结合产物。由于泽兰黄酮中含有多个可供结合的羟基化位点。单纯的基于质谱信息难以明确该物质的精确化学结构。为此，本实施例联合中国农业大学动物医学院采用制备色谱从玫瑰花粉中分离纯化出了该物质，并获得高纯度对照品约10mg。随后采用核磁共振仪器(nmr)对该物质进行了¹h谱和¹³c谱的解析，详细数据见表2。通过对nmr的数据的解析，明确了该物质为泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷，其详细化学结构见图1。

此外，为保证泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷鉴定结果的有效性，本实施例采用β-葡萄糖醛酸酶对纯化后的泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷进行了酶解处理，然后再次采用液相串联高分辨质谱分析，结果发现了一个高含量的色谱峰m/z317.06486，通过与购买的泽兰黄酮标准品进行了对比，发现两者具有相同的保留时间、母离子(ms)和碎片离子(ms/ms)。该结果再次验证了泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷化学结构鉴定的准确性。

实施例2

本实施例通过两种方式对泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷进行定量检测：

1.样品来源

从市场或者蜂农处购买常见的真实蜂花粉样本共24份，分别为油菜蜂花粉（3份）、茶花蜂花粉（3份）、荷花蜂花粉（3份）、玉米蜂花粉（3份）、玫瑰蜂花粉（3份）、党参蜂花粉（3份）、五味子蜂花粉（3份），荞麦蜂花粉（3份）。用于检测各种蜂花粉中泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的含量。

2.溶液配制

提取溶液：移取甲醇20ml，超纯水定容到100ml。4℃保存。

泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷标准溶液：称取10mg的泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷标准品，甲醇定容至10ml。4℃保存，有效期2个月。

3.1.qexactiveplus对泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷进行定量，测试条件如下：

（1）样品处理：

将蜂花粉研磨成粉，称取0.8g研磨后的蜂花粉，加入7.2ml提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194g，4℃下离心20min。收集上清液过0.22µm滤膜；吸取10µl提取液，990µl甲醇-水的比例稀释一次；再吸取100µl提取液：900µl甲醇-水的比例稀释一次。稀释液转移至进样瓶中等待上机分析。

（2）空白蜂花粉加标：

将空白蜂花粉（不含泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷）研磨成粉，称取0.8g研磨后的空白蜂花粉，加入7.2ml提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194g，4℃下离心20min。收集上清液过0.22µm滤膜转移至进样品中，吸取10µl提取液，990µl甲醇-水的比例稀释一次；再吸取100µl提取液：900µl甲醇-水的比例稀释一次。取900µl稀释过滤后的液体加入进样瓶，再移取100µl浓度为1mg/kg的泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷标准溶液。涡旋混匀，等待上机分析。

（3）uhplc-qexactiveplus仪器设置

色谱条件为：采用c18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相a，0.1%的甲酸乙腈为b，采用梯度洗脱程序分离：0.0-2.0min，5%的流动相b；2.0-7.0min，5-30%的流动相b；7.0-14.0min，30-95%的流动相b；14.0-18.0min，95%的流动相b；18.0-20.0min，5%的流动相b。液相的流速为0.30ml/min；进样量：5.0µl。

离子源参数：鞘气的流速45；辅助气的流速10；挡锥气的流速0；电喷雾电压3.5kv；离子导管的温度320℃；s-lensrflevel设为60；离子源的温度350℃。

采集的模式为正离子模式下的fullms-ddms2。

其中fullms的具体参数设置如下：分辨率：70000；agctarget：3e6；maximumit：100ms；scanrange：80-1200da；spectrumdata：centroid；其中dd-ms2的具体参数设置如下：分辨率：17500；agctarget：1e5；maximumit：50ms；loopcount：2；isolationwindow：2.0da；nce：35ev；spectrumdata：centroid；在ddsettings中，minimumagc：8.0e3；apextrigger：2-6s；excludeisotope：on；dynamicexclusion：8.0s。

质谱生成的数据通过xcalibur软件收集并存储，将质谱采集的raw数据通过xcalibur的qualitativebrowser分析，比较样品与空白加标样品中泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的fullms模式下的色谱图（如图2）及质谱图（如图3），确定样品中含有泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷。

（4）标准曲线的绘制：在空白蜂花粉样品提取后过滤膜的溶液中制备一系列泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷溶液(20，50，100，200，500，1000ng/ml)。数据通过tracefinder软件处理，定量蜂花粉样品中泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的含量。

3.2.agilent1200液相色谱-6460三重四级杆质谱对泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷进行定量检测

（1）样品处理：

将蜂花粉研磨成粉，称取0.8g研磨后的蜂花粉，加入7.2ml提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194g，4℃下离心20min。收集上清液过0.22µm滤膜；吸取10µl提取液，990µl甲醇-水的比例稀释一次；再吸取100µl提取液：900µl甲醇-水的比例稀释一次。稀释液转移至进样瓶中等待上机分析。

（2）空白蜂花粉加标：

将空白蜂花粉(油菜蜂花粉，不含泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷)研磨成粉，称取0.8g研磨后的空白蜂花粉，加入7.2ml提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194g，4℃下离心20min。收集上清液过0.22µm滤膜转移至进样品中，吸取10µl提取液，990µl甲醇-水的比例稀释一次；再吸取100µl提取液，900µl甲醇-水的比例稀释一次。取900µl稀释过滤后的液体加入进样瓶，再移取100µl浓度为1mg/kg的泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷标准溶液。涡旋混匀，等待上机分析。

（3）agilent1200-6460仪器参数设置如下：采用c18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相a，0.1%的甲酸乙腈为b，采用梯度洗脱程序分离：以0.1%的甲酸水为流动相a，0.1%的甲酸乙腈为流动相b，采用梯度洗脱程序分离：0-1.5min，10%的流动相b；1.5-7.5min，10-90%的流动相b；7.5-8.9min，90%的流动相b；8.9-9.0min，90-10%的流动相b；9.0-10.0min，10%的流动相b，优选液相的流速为0.30ml/min；进样量：3.0µl。

lc-ms/ms的质谱条件如下：电喷雾离子源(esi)；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测(mrm)；离子喷雾电压：3500v；雾化气压力：45psi；干燥气温度：300℃；干燥气流速：11l/min；鞘气温度：250℃；鞘气流速：11l/min。

采集的模式为正离子模式下的mrm模式。mrm参数：641.2>317.0，30ev(定量离子)，641.2>479.1，15ev(定性离子)。

（4）在空白蜂花粉样品提取后过滤膜的稀释10000倍的溶液中制备一系列泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷(20，50，100，200，500，1000ng/ml)。并指定200ng/ml的空白添加为质控样本。

通过agilent的masshunter定量软件分析样品及空白加标样品。外标法定量，得到标曲公式为y=1.4502e4x-0.60e4，r²=0.9998(x为浓度y定量离子响应积分值)。

通过定量软件即可分析蜂花粉样品中的泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷含量，通过浓度稀释计算，得到蜂花粉样品中泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的含量。对7种不同品种蜂花粉样本的检测结果见图4。由图4可知，玫瑰蜂花粉中的泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的含量显著区别于其他花粉源的蜂花粉样本，当样品中泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的含量高于600mg/kg可被判别为样品花粉源为玫瑰，该样品为玫瑰蜂花粉。

实施例3

1.样品来源

从市场购买20份不同厂家生产的商品化玫瑰蜂花粉。

2.实验步骤

（1）溶液配制

提取溶液：移取甲醇20ml，超纯水定容到100ml。4℃保存。

泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷标准溶液：称取10mg的泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷标准品，甲醇定容至10ml。4℃保存，有效期2个月。

（2）样品处理：

将蜂花粉研磨成粉，称取0.8g研磨后的蜂花粉，加入7.2ml提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194g，4℃下离心20min。收集上清液过0.22µm滤膜；吸取10µl提取液，990µl甲醇-水的比例稀释一次；再吸取100µl提取液：900µl甲醇-水的比例稀释一次。稀释液转移至进样瓶中等待上机分析。

（3）空白蜂花粉加标：

将空白蜂花粉(油菜蜂花粉，不含泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷)研磨成粉，称取0.8g研磨后的空白蜂花粉，加入7.2ml提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194g，4℃下离心20min。收集上清液过0.22µm滤膜转移至进样品中，吸取10µl提取液，990µl甲醇-水的比例稀释一次；再吸取100µl提取液：900µl甲醇-水的比例稀释一次。取900µl稀释过滤后的液体加入进样瓶，再移取100µl浓度为1mg/kg的泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷标准溶液。涡旋混匀，等待上机分析。

agilent1200-6460仪器参数设置如下：采用c18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相a，0.1%的甲酸乙腈为b，采用梯度洗脱程序分离：0-1.5min，10%的流动相b；1.5-7.5min，10-90%的流动相b；7.5-8.9min，90%的流动相b；8.9-9.0min，90-10%的流动相b；9.0-10.0min，10%的流动相b优选液相的流速为0.30ml/min；进样量：3.0µl。

lc-ms/ms的质谱条件如下：电喷雾离子源(esi)；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测(mrm)；离子喷雾电压：3500v；雾化气压力：45psi；干燥气温度：300℃；干燥气流速：11l/min；鞘气温度：250℃；鞘气流速：11l/min。

采集的模式为正离子模式下的mrm模式。mrm参数：641.2>317.0，30ev(定量离子)，641.2>479.1，15ev(定性离子)。

（4）在空白蜂花粉样品提取后过滤膜的稀释10000倍的溶液中制备一系列泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷(20，50，100，200，500，1000ng/ml)。并指定200ng/ml的空白添加为质控样本。

通过agilent的masshunter定量软件分析样品及空白加标样品。外标法定量，得到标曲公式为y=1.4502e4x-0.60e4,r²=0.9998(x为浓度y定量离子响应积分值)。

通过定量软件即可分析20种玫瑰蜂花粉样品中的泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷含量，通过浓度稀释计算，得到蜂花粉中泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的含量如图5。其中编号为1、4、5、6、7、10、12、13、15、17、19的玫瑰蜂花粉泽兰黄酮-4’,7-双葡萄糖苷的含量在600-900mg/kg。因此判定编号为1、4、5、6、7、10、12、13、15、17、19的玫瑰蜂花粉花为真实的玫瑰蜂花粉，编号为2、3、8、9、11、14、16、18、20为其它蜂花粉或掺假玫瑰蜂花粉。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。