本发明涉及一种植物性食品中草甘膦和草铵膦的检测方法。
背景技术：
目前检测植物性食品中草甘膦和草铵膦的方法有气相色谱和气质联用法、液相色谱法和液质谱联用法。气相和液相色谱法具有方法稳定、定量准确的优点，但是由于草甘膦和草铵膦均为强极性化合物，不溶于大部分有机溶剂，既无紫外吸收，又不易挥发，且在常规c18色谱柱上没有保留，难以利用气相色谱和高效液相色谱进行分离测定；另一方面，由于缺少生色基团，难以直接利用紫外和荧光检测器进行检测，因此，柱前或柱后衍生方法常用于改善气相色谱和高效液相色谱的色谱行为及提高检测响应值。氯甲酸-9-芴基甲酯是比较理想的衍生剂，因为其与草甘膦和草铵膦衍生反应快，且生成的衍生物比较稳定。目前检测草甘膦和草铵膦的传统前处理方法是将样品用水提取后用固相萃取柱净化，过程复杂，且很难在实验室进行大批量样品的检测。
技术实现要素：
本发明提供一种植物性食品中草甘膦和草铵膦的检测方法，其目的是解决现有技术的缺点，提高试样提取液的净化效果，建立测定植物性食品中的草甘膦、草铵膦残留量的快速分析方法，提高工作效率，降低制备方法对人体毒害。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种植物性食品中草甘膦和草铵膦的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1：试样制备
样品取样得到试样；
2：提取
称取10g试样于50ml离心管中，补水，然后加入10ml甲醇，涡旋振荡2min后，以3800r/min离心5min，待净化；
3：净化
3.1：蔬菜、水果、坚果、食用菌类、香辛料、茶叶类、谷物类试样：
准确吸取1ml提取液于称有5mg多壁碳纳米管的2ml离心管中，涡旋1min后，以10000r/min离心3min，取上清液过0.22μm有机系滤膜于另一个2ml离心中，待衍生化；
3.2：油料作物类试样：
用吸量管准确吸取4ml提取液于5ml离心管中，置于-18℃的冰箱中冷冻过夜，然后取1ml上清液于称有5mg多壁碳纳米管和50mg中性氧化铝的2ml离心管中，涡旋1min后，以10000r/min离心3min，取上清液过0.22μm有机系滤膜于另一个2ml离心管中，待衍生化；
3.3：植物油类试样：
准确吸取1ml提取液直接过0.22μm有机系滤膜于另一个2ml离心管中，待衍生化；
4：衍生化
准确吸取0.5ml净化后的提取液于2ml离心管中，加入0.5ml硼酸盐缓冲溶液，混匀后再加入0.5ml氯甲酸-9-芴基甲酯乙腈溶液，涡旋1min，于40℃水浴中衍生1h，衍生后以10000r/min离心1min，取上清液过0.22μm有机系滤膜，待上机检测；准确吸取标准中间溶液0.5ml，按此步骤同时进行衍生化；
重复步骤2、步骤3、步骤4，每批制备一个平行样的样品；
5：质控样品制备
5.1：方法空白：不称取样品，取10ml甲醇、10ml超纯水于50ml离心管中，重复步骤2、步骤3、步骤4；
5.2：质量控制溶液：不称取样品，取21μl浓度为100mg/l草铵膦、草甘膦标准溶液于50ml离心管中，重复步骤2、步骤3、步骤4，得到待测物的加标浓度为70μg/l的样品加标溶液；
4.10.3：样品加标溶液：称取样品，取21μl浓度为100mg/l草铵膦、草甘膦标准溶液于50ml离心管中，重复步骤2、步骤3、步骤4，得到待测物的加标浓度为70μg/l的样品加标溶液；
6：仪器分析：
6.1：液相色谱条件
6.1.1：色谱柱：poroshell120ec-c18，150mm×3.0mm，粒径2.7μm；
6.1.2：流动相：a为0.1％甲酸5mmol/l乙酸铵水溶液，b为0.1％甲酸5mmol/l乙酸铵甲醇溶液；
6.1.3：流速：0.4ml/min；
6.1.4：柱温：30℃；
6.1.5：进样体积：1μl；
6.2：质谱参考条件
6.2.1：离子源：电喷雾离子源；
6.2.2：电离源极性：正模式；
6.2.3：gastemp：300℃；
6.2.4：gasflow：9l/min；
6.2.5：nebulizer：40psi；
6.2.6：sheathgastemp：350℃；
6.2.7：sheathgasflow：11l/min；
6.2.8：capillary：4000v；
6.2.9：nozzlevoltage：500v；
6.2.10：检测方式：多反应监测(mrm)；
6.3.0：运行只含有甲醇的溶剂空白，检查仪器基线是否平稳；
6.4.0：运行标准工作曲线溶液；用峰面积和浓度建立校准曲线，线性相关系数不得小于0.995；
6.5.0：测试方法空白来检查是否有污染；
6.6.0：测试质量控制溶液来检查回收率；
6.7.0：测试样品溶液及平行样；
6.8.0：测试样品加标溶液，用于定性和检查回收率；
6.9.0：样品中待测物质量浓度应在标准工作曲线质量浓度范围内，超过标准工作曲线质量浓度上限的样品应稀释后进样，采用外标法定量；
6.3：定性及定量
6.3.1：保留时间
被测试样中待测物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，相对误差应在±2.5％之内；
6.3.2：定量离子、定性离子及子离子丰度比
在相同实验条件下进行样品测定时，如果样品中待测物色谱峰的保留时间与标准样品一致，并且在扣除背景后，样品质谱图中目标化合物的定性离子必须出现，至少应包括1个母离子和2个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的2个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，判断样品中是否存在草甘膦或草胺膦；
6.4：质量控制
7：分析结果计算
7.1：试样中农药残留量按下式(1)进行计算：
式中：
xi——试样中农药残留量，单位mg/kg；
ci——进样液中被测物的浓度，单位μg/l；
v——提取溶液总体积，单位ml，v＝20；
m——试样的质量，单位g；
1000——单位换算系数。
进一步地：
取样按相关标准取一定量，样品取样部位按照gb2763的规定执行；取后的样品将其切碎，充分混匀，用四分法取样或直接放入组织捣碎机中捣碎成匀浆。匀浆放入聚乙烯容器中；谷类样品取样为500g，粉碎后使其全部可通过425μm的标准网筛，放入聚乙烯瓶或袋中；油料作物、茶叶、坚果和香辛料样品各500g，粉碎后充分混匀，放入聚乙烯瓶或袋中；植物油类搅拌均匀；得到的试样于-18℃以下温度保存。
本发明的有益之处在于：
本方法采用特定规格的多壁碳纳米管作为试样净化材料，提高了试样提取液的净化效果。
本方法采用多壁碳纳米管对提取液进行净化，采用超高效液相色谱串联质谱法检测，建立了测定植物性食品中的草甘膦、草铵膦残留量的快速分析方法。
本方法避免了使用二氯甲烷等高毒试剂，试样制备方法对人体毒害降低。
本方法使用c18色谱柱进行草甘膦和草铵膦的定性和定量分析，提高了工作效率，避免在使用hilic色谱柱后，需要数小时的时间，进行色谱柱平衡。
本方法弥补了《gb23200.108-2018食品安全国家标准植物源性食品中草铵膦残留量的测定液相色谱-质谱联用法》的不足，该国家标准不能同时检测草甘膦和草铵膦。
具体实施方式
1：适用范围
本方法适用于植物源性食品中草铵膦、草甘膦残留量的测定，方法为液相色谱-质谱联用法。
2：方法原理
试样用水和甲醇提取，再经固相材料分散净化处理，净化液与氯甲酸-9-芴基甲酯(9-fluorenylmethylchloroformate)反应后生成的衍生物草甘膦-fmoc(glyphosate-fmoc)、草铵膦fmoc(glufosinate-fmoc)经液质检测，外标法定量。
3：参考标准
gb23200.108-2018食品安全国家标准植物源性食品中草铵膦残留量的测定液相色谱-质谱联用法
sn/t1923-2007进出口食品中草甘膦残留量的检测方法液相色谱-质谱/质谱法
4：程序
4.1：仪器设备
4.1.1：液相色谱-质谱联用仪：配有电喷雾离子源(esi)。
4.1.2：分析天平：感量0.0001g、感量0.01g。
4.1.3：组织捣碎仪。
4.1.4：多管式漩涡混匀器(ms200)。
4.1.5：离心机：转速不低于10000r/min。
4.1.6：恒温水浴锅。
4.2：试剂
4.2.1：乙腈(ch3cn，cas号：75-05-8)：色谱纯。
4.2.2：甲醇(ch3oh，cas号：67-56-1)：色谱纯。
4.2.3：乙酸铵(ch3coonh4，cas号：631-61-8)。
4.2.4：硼酸钠(na2b4o7·10h2o，cas号：1303-96-4)。
4.2.5：氯甲酸-9-芴基甲酯(c15h11clo2，cas号：28920-43-6)；纯度99.0％，0～4℃保存。
4.3：溶液配制
4.3.1：硼酸盐缓冲溶液(50.0g/l，ph＝9)：称取5g硼酸钠(na2b4o7·10h2o)(4.2.4(也即上述4.2的试剂中标号4.2.4的硼酸钠(na2b4o7·10h2o，cas号：1303-96-4)，以下此种标号含义均为选择已经描述的相应标号的试剂))，用水溶解并定容至100ml。
4.3.2：氯甲酸-9-芴基甲酯乙腈溶液(10.0g/l)：称取1g氯甲酸-9-芴基甲酯(4.2.5)，用乙腈(4.2.1)溶解并定容至100ml。
4.3.3：乙酸铵水溶液(5mmol/l)：称取0.385g乙酸铵(4.2.3)溶解于适量水中，用水定容至1000ml。
4.4：标准品
4.4.1：草铵膦标准溶液，浓度为100mg/l，有效期12个月。
4.4.2：草甘膦标准溶液，浓度为100mg/l，有效期12个月。
4.5：标准溶液配制
4.5.1：标准中间溶液
依据下表1配制标准中间溶液，基质匹配标准曲线中间溶液用样品空白提取液进行稀释定容。标准曲线中间溶液用甲醇水溶液(v/v＝1：1)进行稀释定容。
保存条件：-18℃保存，有效期：1个月。
表1标准中间溶液的配制
4.5.2：标准工作曲线溶液
将标准中间溶液(4.5.1)用样品空白提取液稀释成浓度为10μg/l、20μg/l、50μg/l、100μg/l、200μg/l的系列基质匹配标准溶液，进行仪器测定。以草铵膦或草甘膦的质量浓度为横坐标、其衍生物的峰面积为纵坐标，绘制曲线。
有效期：7天。
表2标准工作曲线溶液的配制
4.6：试样制备
蔬菜、水果和食用菌样品按相关标准取一定量，样品取样部位按照gb2763的规定执行。对于个体较小的样品，取样后全部处理；对于个体较大的基本均匀样品，可在对称轴或对称面上分割或切成小块后处理；对于细长、扁平或组分含量在各部分有差异的样品，可在不同部位切取小片或截成小段后处理；取后的样品将其切碎，充分混匀，用四分法取样或直接放入组织捣碎机中捣碎成匀浆。匀浆放入聚乙烯容器中。取谷类样品500g，粉碎后使其全部可通过425μm的标准网筛，放入聚乙烯瓶或袋中。取油料作物、茶叶、坚果和香辛料样品各500g，粉碎后充分混匀，放入聚乙烯瓶或袋中。植物油类搅拌均匀。试样于-18℃以下温度保存。
4.7：提取
4.7.1：蔬菜、水果、食用菌类
称取10g(精确至0.01g)试样于50ml离心管中，参见附录a补水，然后加入10ml甲醇，涡旋振荡2min后，以3800r/min离心5min，待净化。
4.7.2：香辛料、茶叶类
称取2g(精确至0.01g)试样于50ml离心管中，参见附录a补水，然后加入10ml甲醇，涡旋振荡2min后，以3800r/min离心5min，待净化。
4.7.3：谷物、坚果、油料作物、植物油类
称取5g(精确至0.01g)试样于50ml离心管中，参见附录a补水，然后加入10ml甲醇，涡旋振荡2min后，以3800r/min离心5min，待净化。
附录a
表1所选基质含水量、称样量及提取前补水量信息表
4.8：净化
4.8.1：蔬菜、水果、坚果、食用菌类、香辛料、茶叶类、谷物类
准确吸取1ml提取液于称有5mg多壁碳纳米管的2ml离心管中，涡旋1min后，以10000r/min离心3min，取上清液过0.22μm有机系滤膜于另一个2ml离心中，待衍生化。
4.8.2：油料作物类
用吸量管准确吸取4ml提取液于5ml离心管中，置于-18℃的冰箱中冷冻过夜，然后取1ml上清液于称有5mg多壁碳纳米管和50mg中性氧化铝的2ml离心管中，涡旋1min后，以10000r/min离心3min，取上清液过0.22μm有机系滤膜于另一个2ml离心管中，待衍生化。
4.8.3：植物油类
准确吸取1ml提取液直接过0.22μm有机系滤膜于另一个2ml离心管中，待衍生化。
4.9：衍生化
准确吸取0.5ml净化后的提取液于2ml离心管中，加入0.5ml硼酸盐缓冲溶液，混匀后再加入0.5ml氯甲酸-9-芴基甲酯乙腈溶液，涡旋1min，于40℃水浴中衍生1h，衍生后以10000r/min离心1min，取上清液过0.22μm有机系滤膜，待上机检测。准确吸取标准中间溶液0.5ml，按此步骤同时进行衍生化。
重复步骤4.7～4.9，每批制备一个平行样。
4.10：质控样品制备
4.10.1：方法空白：不称取样品，取10ml甲醇、10ml超纯水于50ml离心管中，重复步骤4.7～4.9。
4.10.2：质量控制溶液：不称取样品。取21μl浓度为100mg/l草铵膦、草甘膦标准溶液于50ml离心管中，重复步骤4.7～4.9。得到待测物的加标浓度为70μg/l的样品加标溶液。
4.10.3：样品加标溶液：称取样品。取21μl浓度为100mg/l草铵膦、草甘膦标准溶液于50ml离心管中，重复步骤4.7～4.9。得到待测物的加标浓度为70μg/l的样品加标溶液。
5仪器分析：
5.1：液相色谱条件
5.1.1：色谱柱：poroshell120ec-c18，150mm×3.0mm，粒径2.7μm；
5.1.2：流动相：a为0.1％甲酸5mmol/l乙酸铵水溶液，b为0.1％甲酸5mmol/l乙酸铵甲醇溶液；
5.1.3：流速：0.4ml/min；
5.1.4：柱温：30℃；
5.1.5：进样体积：1μl。
表3流动相及梯度洗脱程序
5.2：质谱参考条件
5.2.1：离子源：电喷雾离子源；
5.2.2：电离源极性：正模式；
5.2.3：gastemp：300℃；
5.2.4：gasflow：9l/min；
5.2.5：nebulizer：40psi；
5.2.6：sheathgastemp：350℃；
5.2.7：sheathgasflow：11l/min；
5.2.8：capillary：4000v；
5.2.9：nozzlevoltage：500v；
5.2.10：检测方式：多反应监测(mrm)，多反应监测条件见表4。
表4两种农药衍生物的保留时间和多反应监测(mrm)条件
5.3.0：运行只含有甲醇的溶剂空白，检查仪器基线是否平稳。
5.4.0：运行标准工作曲线溶液(4.5.2)。用峰面积和浓度建立校准曲线，线性相关系数不得小于0.995。
5.5.0：测试方法空白(4.10.1)来检查是否有污染。
5.6.0：测试质量控制溶液(4.10.2)来检查回收率。
5.7.0：测试样品溶液及平行样(4.9)。
5.8.0：测试样品加标溶液(4.10.3)，用于定性和检查回收率。
5.9.0：样品中待测物质量浓度应在标准工作曲线质量浓度范围内，超过标准工作曲线质量浓度上限的样品应稀释后进样，采用外标法定量。
5.3：定性及定量
5.3.1：保留时间
被测试样中待测物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，相对误差应在±2.5％之内。
5.3.2：定量离子、定性离子及子离子丰度比
在相同实验条件下进行样品测定时，如果样品中待测物色谱峰的保留时间与标准样品一致，并且在扣除背景后，样品质谱图中目标化合物的定性离子必须出现，至少应包括1个母离子和2个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的2个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其相对偏差不超过表5规定的范围，则可判断样品中存在草甘膦或草胺膦。
表5定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差(单位为百分率)
5.4：质量控制
注：a，b表示两次平行样的测定结果。
6：分析结果计算
6.1：试样中农药残留量按下式(1)进行计算：
式中：
xi——试样中农药残留量，单位mg/kg；
ci——进样液中被测物的浓度，单位μg/l；
v——提取溶液总体积，单位ml，v＝20。
m——试样的质量，单位g；
1000——单位换算系数。
保留2位有效数字。当结果大于1mg/kg时，保留3位有效数字。
7：报告检出限
香辛料和茶叶的定量限为0.1mg/kg，其他样品的定量限为0.05mg/kg。
以下为涉及物质的化学结构式：
1.草甘膦化学结构式
2.草胺膦化学结构式
3.氯甲酸-9-芴基甲酯(9-fluorenylmethylchloroformate,fmoc)化学结构式
4.草甘膦-fmoc(glyphosate-fmoc)化学结构式
5.草铵膦-fmoc(glufosinate-fmoc)
6.：草甘膦、草铵膦农残衍生物在质谱中的裂解机理
6.1：草甘膦农残衍生物在质谱中的裂解机理
通过对草甘膦衍生物在串联质谱中的裂解机理进行系统的分析研究，可探索出草甘膦衍生物的裂解机理为：首先草甘膦衍生物裂解为离子m/z214，离子m/z214流经碰撞室期间会失去一个co2分子而变为离子m/z170，离子m/z170在碰撞室内与惰性气体氮气发生有效碰撞，再次裂解为离子m/z88。
6.2：草铵膦残衍生物在质谱中的裂解机理
通过对草铵膦衍生物在串联质谱中的裂解机理进行系统的分析研究，可探索出草铵膦衍生物的裂解机理为：首先草铵膦衍生物裂解为离子m/z208和离子m/z226，离子m/z226流经碰撞室期间会失去一个co2分子而变为离子m/z182，离子m/z182在碰撞室内与惰性气体氮气发生有效碰撞，再次裂解为离子m/z136。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。