一种红茶中人为添加合成着色剂的检测方法与流程

本发明涉及一种茶叶检测方法，具体地说是红茶中人为添加合成着色剂的检测方法。

背景技术：

红茶是全发酵茶，其品质特征的形成取决于鲜叶原料所含化合物的种类，其中对红茶风味影响最为重要的是茶多酚(尤其是儿茶素类)和多酚类氧化酶。在茶叶加工中，必须充分利用酶的生物化学作用，才能形成红茶“红汤红叶”的品质特征。优质红茶的茶汤色为红明亮，不合理的茶叶加工工艺，会使红茶汤色变为暗红。

国标方法《gb5009.35-2016食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》未对红茶样品阐明该如何进行前处理。

技术实现要素：

本发明提供一种红茶中人为添加合成着色剂的检测方法，其目的是解决现有技术的缺点，可以检测红茶中合成着色剂，用于鉴定是否人为添加，避免红茶的以次充好。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种红茶中人为添加合成着色剂的检测方法，其特征在于：

包括如下步骤：

1)：试样制备

1.1)：茶叶：将茶样倒入样品盘内，用四分法取样约50g，置于粉碎机，称取5g磨碎样品，放入100ml烧杯中，加超纯水30ml，得到样品溶液，若样品溶液ph高于6，用柠檬酸溶液调ph到6。

2)：色素提取

2.1)：步骤1.1得到的样品溶液在60℃水浴锅上加热溶解；

2.3)：吸附：将1g聚酰胺粉加入2ml超纯水调成粥状，倒入样品溶液中，搅拌，以g3垂融漏斗抽滤；

2.4)：用60℃，ph为4的水洗涤5次，每次约5ml；

2.5)：用甲醇-甲酸溶液洗涤5次，每次约5ml；

2.6)：用超纯水洗涤3次以上，每次30ml，使抽滤瓶中溶液为中性；

2.7)：弃去抽滤瓶中溶液，并用纯水将其润洗3次；

2.8)：解吸：用乙醇-氨水溶液-水溶液洗涤5次，每次约5ml，使色素完全解吸；

2.9)：浓缩：收集解吸液，加乙酸中和后，放置在水浴锅上蒸发；

2.10)：加超纯水溶解，定容至5ml，用0.45μm水系滤膜过滤到样品瓶中；

2.11)：重复步骤1、以及步骤2.1～步骤2.10，每批制备一个平行样；

3)：质控样品制备

3.1)：方法空白：取30ml超纯水于100ml烧杯中，重复步骤2.1～步骤2.10，不加样品；

3.2)：质量控制溶液：取500μl浓度为50μg/ml合成着色剂混合工作液于100ml烧杯中，再加30ml超纯水，重复步骤2.1～步骤2.10，得到合成着色剂的加标浓度为5μg/ml的质量控制溶液，不加样品；

3.3)：样品加标溶液：取500μl浓度为50μg/ml合成着色剂混合工作液，于经过步骤1处理的样品溶液中，重复步骤2.1～2.10，得到合成着色剂的加标浓度为5μg/ml的样品加标溶液；

4)：仪器分析

4.1)：建立如下表的仪器测试条件

4.2)：运行标准曲线溶液，用峰面积和浓度建立校准曲线，线性相关系数不得小于0.9990；

4.3)：测试方法空白检查是否有污染；

4.4)：测试质量控制溶液检查回收率；

4.5)：测试样品溶液及平行样；

4.6)：测试样品加标溶液，用于定性和检查回收率；

4.7)：通过样品峰和标准品峰的保留时间比较，进行定性分析；

4.11)：用目标化合物的峰面积进行定量；

5)：质量控制

6)：结果计算与评估

6.1)：试样中着色剂含量按下式计算)：

式中)：

x——试样中着色剂的含量，单位mg/kg；

c——进样液中着色剂的浓度，单位μg/ml；

v——试样稀释总体积，单位ml；

m——样品称量重量，单位g；

1000——单位换算系数。

在步骤2.1后具有步骤2.2：若经过步骤2.1处理后的样品溶液混浊，则使用离心机进行离心除杂，离心管50ml，转速5000rpm/min，离心时间5min。

所述甲醇为色谱纯；超纯水为18.25mω；；冰醋酸为ar级；甲醇为ar级；甲酸为ar级；无水乙醇为ar级；乙酸铵为ar级；柠檬酸为ar级；氨水为含量20％～25％；聚酰胺粉为过200目筛；

所述乙酸铵溶液为称取1.54g乙酸铵，加超纯水溶解，定容至1000ml，经0.45μm滤膜过滤；氨水溶液为量取氨水2ml，用超纯水定容至100ml，混匀；乙醇-氨水溶液-水溶液为量取无水乙醇70ml，氨水溶液20ml，超纯水10ml，混匀；甲醇-甲酸溶液为量取甲醇60ml，甲酸40ml，混匀；柠檬酸溶液为称取20g柠檬酸，加超纯水溶解，定容至100ml，摇匀；ph6的水为向超纯水中滴加柠檬酸溶液至ph至6；ph4的水为向超纯水中滴加柠檬酸溶液至ph至4；

所述合成着色剂混合工作液为分别移取浓度为1.00mg/ml的胭脂红、诱惑红、苋菜红、亮蓝、日落黄、柠檬黄标准溶液各500μl于10ml容量瓶中，使用ph6的水定容，混匀，配得每个合成着色剂浓度均为50μg/ml的混合工作液；

所述标准曲线溶液为用50μg/ml混合工作液配制标准曲线溶液，使用ph6的水定容，混匀。

本发明的有益之处在于：

该检测方法填补了《gb5009.35-2016食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》的不足，可以检测红茶中合成着色剂。该检测方法在试样制备过程中使用高速离心机实现固液分离，避免茶渣堵塞垂融漏斗。该检测方法使用紫外可变波长检测器实现6种合成着色剂的同时检测。该检测方法采用不同梯度洗脱程序，来避免合成着色剂与红茶色素可能的信号重叠现象，提高定性准确性。该检测方法减少了乙酸的使用量，来缩短试样制备时间。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1为6种合成着色剂的标准色谱图。

具体实施方式

1：本发明适用范围

本测试方法适用于茶叶、饮料、配制酒、硬糖、蜜饯、淀粉软糖、巧克力及着色糖衣制品等食品中合成着色剂的测定。

本实施例为检测红茶中合成着色剂。

2：本发明方法原理

食品中人工合成着色剂用聚酰胺粉吸附法提取，制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间定性，与峰面积比较进行定量。

3：本发明参考标准

gb5009.35-2016食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定

4：本实施例程序

4.1仪器设备

4.1.1：高效液相色谱仪配备紫外检测器(agilent，hplc1260)；

4.1.2：高速离心机(湖南湘仪，h1850)；

4.1.3：超纯水机(厦门锐思捷科学仪器有限公司，unique-r30)；

4.1.4：电子天平(mettler，ar2130，精确到0.001g)；

4.1.5：移液枪(100μl，200μl，1000μl，5000μl)；

4.1.6：具塞刻度试管(5ml)；

4.1.7：恒温水浴锅；

4.1.8：烘箱；

4.1.9：g3垂融漏斗。

4.2试剂

4.2.1：甲醇：色谱纯；

4.2.2：超纯水：18.25mω；

4.2.3：冰醋酸：ar级；

4.2.4：甲醇：ar级；

4.2.5：甲酸：ar级；

4.2.6：无水乙醇：ar级；

4.2.7：乙酸铵：ar级；

4.2.8：柠檬酸：ar级；

4.2.9：氨水：含量20％～25％；

4.2.10：聚酰胺粉：过200目筛。

4.3试剂配制

4.3.1：乙酸铵溶液(0.02mol/l)：称取1.54g乙酸铵(4.2.7(也即上述4.2的试剂中标号4.2.7的ar级的乙酸铵，以下此种标号含义均为选择已经描述的相应标号的试剂))，加超纯水(4.2.2)溶解，定容至1000ml，经0.45μm滤膜过滤。

4.3.2：氨水溶液：量取氨水(4.2.9)2ml，用超纯水(4.2.2)定容至100ml，混匀。

4.3.3：乙醇-氨水溶液-水溶液(7+2+1，体积比(也即体积份数为7份乙醇、2份氨水、1份超纯水混合))：量取无水乙醇(4.2.6)70ml，氨水溶液(4.3.2)20ml，超纯水(4.2.2)10ml，混匀。

4.3.4：甲醇-甲酸溶液(6+4，体积比(也即体积份数为6份甲醇、4份甲酸混合))：量取甲醇(4.2.4)60ml，甲酸(4.2.5)40ml，混匀。

4.3.5：柠檬酸溶液：称取20g柠檬酸(4.2.8)，加超纯水(4.2.2)溶解，定容至100ml，摇匀。

4.3.6：ph6的水：向超纯水(4.2.2)中滴加柠檬酸溶液(4.3.5)至ph至6。

4.3.7：ph4的水：向超纯水(4.2.2)中滴加柠檬酸溶液(4.3.5)至ph至4。

4.4标准品

4.5标准溶液配制

4.5.1：合成着色剂混合工作液(50μg/ml)：分别移取浓度为1.00mg/ml的胭脂红、诱惑红、苋菜红、亮蓝、日落黄、柠檬黄标准溶液(4.4)各500μl于10ml容量瓶中，使用ph6的水(4.3.6)定容，混匀，配得每个合成着色剂浓度均为50μg/ml的混合工作液。

注：溶液保存在0℃～5℃冰箱中，有效期3个月。

4.5.2：标准曲线溶液：用50μg/ml混合工作液(4.5.1)配制标准曲线溶液，使用ph6的水(4.3.6)定容，混匀。

注：溶液保存在0℃～5℃冰箱中，有效期1个月。

以下为检测步骤。

4.6试样制备

4.6.1：茶叶：将茶样倒入样品盘内，用四分法取样约50g，置于粉碎机，称取5g(精确至0.001g)磨碎样品，放入100ml烧杯中，加超纯水(4.2.2)30ml，得到样品溶液，若样品溶液ph较高，用柠檬酸溶液(4.3.5)调ph到6左右。

4.7色素提取

4.7.1：若样品溶液ph较高，用柠檬酸溶液(4.3.5)调ph到6左右，60℃水浴锅上加热溶解。

4.7.2：若经过4.7.1处理后的样品溶液混浊，则需要使用离心机进行离心除杂。离心管50ml，转速5000rpm/min，离心时间5min。

4.7.3：吸附：将1g聚酰胺粉(4.2.10)加入2ml超纯水(4.2.2)调成粥状，倒入样品溶液中，搅拌片刻，以g3垂融漏斗抽滤；

4.7.4：用60℃，ph为4的水(4.3.7)洗涤5次，每次约5ml；

4.7.5：用甲醇-甲酸溶液(4.3.4)洗涤5次，每次约5ml；

4.7.6：用超纯水(4.2.2)洗涤3次以上，每次约30ml，确保抽滤瓶中溶液为中性；

4.7.7：弃去抽滤瓶中溶液，并用超纯水(4.2.2)将其润洗3次；

4.7.8：解吸：用乙醇-氨水溶液-水溶液(4.3.3)洗涤5次，每次约5ml，确保色素完全解吸；

4.7.9：浓缩：收集解吸液，加乙酸中和后，放置在水浴锅上蒸发至近干；

4.7.10：加超纯水(4.2.2)溶解，定容至5ml，用0.45μm水系滤膜过滤到样品瓶中。

4.7.11：重复步骤4.6、及步骤4.7.1～步骤4.7.10这十步，每批制备一个平行样。

4.8质控样品制备

4.8.1：方法空白：取30ml超纯水(4.2.2)于100ml烧杯中，重复步骤4.7.1～步骤4.7.10。不加样品。

4.8.2：质量控制溶液：取500μl浓度为50μg/ml合成着色剂混合工作液(4.5.1)于100ml烧杯中，再加30ml超纯水(4.2.2)，重复步骤4.7.1～步骤4.7.10。得到合成着色剂的加标浓度为5μg/ml的质量控制溶液。不加样品。

4.8.3：样品加标溶液：取500μl浓度为50μg/ml合成着色剂混合工作液(4.5.1)于经过4.6处理的样品溶液中，重复步骤4.7.1～步骤4.7.10。得到合成着色剂的加标浓度为5μg/ml的样品加标溶液。

4.9仪器分析

4.9.1：建立如下表的仪器测试条件

4.9.2：运行标准曲线溶液(4.5.2)，用峰面积和浓度建立校准曲线，线性相关系数不得小于0.9990。

4.9.3：测试方法空白(4.8.1)来检查是否有污染。

4.9.4：测试质量控制溶液(4.8.2)来检查回收率。

4.9.5：测试样品溶液及平行样(4.7.10～4.7.11)。

4.9.6：测试样品加标溶液(4.8.3)，用于定性和检查回收率。

4.9.7：通过样品峰和标准品峰的保留时间比较(见表1)，进行定性分析(见图1)。

4.9.11：用目标化合物的峰面积进行定量。

表1：用于目标化合物定量的参考保留时间

4.10质量控制

注：a，b表示两次平行样的测定结果。

5结果计算与评估

5.1：试样中着色剂含量按下式计算：

式中：

x——试样中着色剂的含量，单位mg/kg

c——进样液中着色剂的浓度，单位μg/ml

v——试样稀释总体积，单位ml

m——样品称量重量，单位g

1000——单位换算系数

结果保留2位有效数字。

5.2报告检出限：0.50mg/kg

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。