识别胃低分化腺癌中癌干细胞成分的抗体组合物及其应用的制作方法

本发明属于生物检测领域，涉及识别胃低分化腺癌中癌干细胞成分的抗体组合物及其应用。
背景技术：
：胃癌是一种消化道常见病，在世界范围癌症致死事件中位居第二，以东亚地区高发。引发胃癌的常见因素有幽门螺杆菌感染、吸烟、高盐饮食习惯，也包括特殊遗传因素。由于环境因素对胃癌发生发展影响深远，东西方胃癌特征不同，以发病部位、组织细胞学形态、治疗方案、预后疗效、标志物分布特点等方面差异显著。中国临床肿瘤学会(csco)发布的2018年胃癌诊疗指南中提出，胃癌组织学类型大致有：上皮内肿瘤-腺瘤癌、腺癌、腺鳞癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、未分化癌及神经内分泌癌。其中，90％以上的胃癌被诊断为腺癌。从组织学分级角度，胃癌分为分级无法评估(gx)、高分化(g1)、中分化(g2)和低/未分化(g3)。病理医生凭借经验，以显微镜下观察癌细胞是否可形成分化完全的组织结构(如腺管)人为判定癌细胞分化程度。高分化癌细胞分化成熟，接近正常细胞，预后佳；低分化及未分化癌细胞分化差，表现幼稚，预后差。研究表明，正常胃内的多能干细胞(即正常胃干细胞)可分化为胃组织中所有类型细胞，包括腺细胞，鳞状细胞，平滑肌细胞，间叶细胞等。正常胃干细胞公认的标志物是乙醛脱氢酶1(aldh1)。而在胃癌组织，也有报道表明存在胃癌干细胞。它是一类处于静默状态的未分化肿瘤细胞，可自我更新，在体外悬浮培养条件下可自发形成球形体。其可多向分化为腺癌细胞、鳞状癌细胞等，具有高度致瘤性，是促进肿瘤侵袭转移的原动力。2012年，katsuno等通过aldefluor技术和荧光活化分选技术从胃癌细胞系中分选出aldh1+和aldh1－细胞群，将不同比例的aldh1+细胞和aldh1－细胞接种至重度联合免疫缺陷小鼠中，发现胃癌细胞的致瘤能力与aldh1+细胞的比例具有明显的相关性(aldh1+细胞的比例越高，其致瘤能力越强)。同时他还发现，aldh1－细胞只能分化为aldh1－细胞，而aldh1+细胞可分化成aldh1+细胞和aldh1－细胞，并且aldh1+细胞的成瘤能力要明显强于aldh1－细胞。这一研究证明了aldh1+的胃癌细胞具有干细胞所有特性。因此，正常胃干细胞表达aldh1，而表达aldh1的胃癌细胞是胃癌干细胞。aldh1是胃干细胞的金标准。癌干细胞主导了胃癌的发生、发展，尽管放化疗方法能杀死大多数肿瘤细胞，但只要癌干细胞存活，在治疗过程中便极有可能发生肿瘤细胞耐药及疾病复发。如果存在胃癌干细胞，病灶切除(包括全胃切除、胃大部切除、半胃切除等)是最佳治疗手段，可阻断疾病复发。治愈的关键在于根除胃癌干细胞，故胃癌干细胞在病理检测中的早期发现和鉴别诊断至关重要。但到目前位置，发病率最高及恶性程度最大的胃低分化腺癌中，尚缺乏针对癌干细胞成分的特异性病理诊断标记物。并且，临床现行的胃低分化腺癌治疗方案，仅以淋巴结是否转移、肿瘤分级及分期为主要参考依据，并未考虑胃癌干细胞成分所导致的预后差异。鳞状细胞癌相关抗原(scca)是一种分子量为45kd的糖蛋白，属于卵白蛋白-丝氨酸蛋白酶抑制物家族,是肿瘤相关抗原ta-4的一部分。上世纪70年代，scca从宫颈鳞状细胞癌细胞中分离出来，因此被认为是鳞状细胞癌(简称鳞癌)的特异性标志物。目前临床实验室血清scca检测广泛应用于宫颈癌诊治及预后监测。数据显示，健康女性血清scca水平为1.9μg/l(可信度99％)，而28％～88％宫颈鳞癌患者血清中scca水平升高。其他具有鳞状细胞的脏器(比如食管、肺、头颈部等)癌变时，血清scca水平也可发生上调。技术实现要素：本发明的目的是针对上述不足，提供识别胃低分化腺癌中癌干细胞成分的免疫荧光检测组合物。本发明的另一目的是提供所述组合物的应用。我们首次发现并证实，在病理诊断为胃低分化腺癌的患者中，部分患者的胃低分化腺癌细胞亦表达scca蛋白。换言之，一个具有腺癌特征的胃癌细胞同时表达鳞癌蛋白，其很可能为胃癌干细胞。进一步研究证实，scca与aldh1在胃低分化腺癌细胞中呈现共定位，提示scca/aldh1联合使用可识别胃低分化腺癌中癌干细胞成分。本发明的目的可通过如下技术方案实现：一种识别胃低分化腺癌中癌干细胞成分的免疫荧光标记蛋白组合，由scca和aldh1组成。检测所述的蛋白组合的抗体组合物，由scca的单克隆抗体和aldh1的单克隆抗体组成。所述的组合物优选由美国santacruz公司生产的货号为sc-28384的scca鼠单克隆抗体和美国abcam公司生产的货号为ab52492的aldh1的兔单克隆抗体组成。本发明所述的抗体组合物在制备胃低分化腺癌临床诊断和/或预后监测试剂中的应用。本发明所述的抗体组合物优选在制备胃低分化腺癌临床诊断和/或预后监测的免疫荧光试剂中的应用。一种识别胃低分化腺癌中癌干细胞成分的免疫荧光检测试剂盒，包含本发明所述的抗体组合物。有益效果：(1)scca为癌细胞特异性标志物，aldh1为干细胞特异性标志物，可广泛用于胃低分化腺癌的疾病鉴别诊断和预后监测，填补这两方面免疫荧光检测上的空白。我们的研究数据表明，在病理诊断为胃低分化腺癌的患者中，胃低分化腺癌细胞scca阳性结果与aldh1阳性结果符合率达100％。从瘤块中分选scca+aldh1+细胞群，在低粘附培养皿中进行悬浮培养，可形成癌干细胞特征性细胞球形体。(2)scca/aldh1组合检测的优势在于其检测两个标记物，能够简化临床病理平行检测三个以上标志物的操作流程，降低由个体因素差异导致的多个标志物结果的判读难度，缩短取样至发报告周期。此法可用于胃低分化腺癌临床诊断和/或预后监测，从而达到个体化精准医疗目的。附图说明图1为胃部疾病患者组织石蜡切片的苏木精—伊红染色和scca免疫组化。scca在部分胃低分化腺癌中表达增加，阳性率达22％，而在胃炎不表达，在原发性胃腺鳞癌中表达大幅增加。a.苏木精—伊红染色诊断为胃低分化腺癌的患者(放大倍数200×)；b.同一患者石蜡切片的scca免疫组化染色(判++；放大倍数200×)；c.胃炎患者石蜡切片的scca免疫组化染色(放大倍数100×)；d.原发性胃腺鳞癌患者石蜡切片的scca免疫组化染色(放大倍数100×)。图2为胃部疾病患者组织石蜡切片的aldh1免疫组化。aldh1在干细胞及癌干细胞均表达。a.aldh1在正常干细胞的免疫组化染色(放大倍数200×)；b-d.aldh1在癌干细胞的免疫组化染色(放大倍数200×)。图3为胃低分化腺癌患者组织石蜡切片中scca、aldh1免疫荧光结果评价。a.使用scca的鼠单克隆抗体免疫荧光染色(放大倍数800×)；b.使用aldh1的兔单克隆抗体免疫荧光染色(放大倍数800×)；c.dapi细胞核染色(放大倍数800×)；d.三色荧光融合图，黄色区域表示scca和aldh1的荧光信号在细胞浆中呈现共定位，评价为阳性，判定见胃癌干细胞成分(放大倍数800×)。图4为实施例3胃癌干细胞表型及培养形成的胃癌干细胞球形体。a.使用流式细胞术分选scca+aldh1+胃癌细胞并验证其表型；b.采用低粘附培养板对scca+aldh1+胃癌细胞进行球形体培养，次日显微镜下观察到已形成的癌干细胞球形体(放大倍数40×)。具体实施方式实施例1石蜡切片标本：来自2010年1月至2019年6月在南京医科大学第一附属医院住院的胃部疾病患者38例，所有患者均经病理学诊断证实,患者基本信息见表1。中位年龄64.5岁，其中男性患者26例，女性患者12例。其中，18例胃炎、18例胃低分化腺癌、2例原发性胃腺鳞癌。表1.38例确诊胃部疾病患者基本信息石蜡切片免疫组化：选取4μm石蜡包埋人胃组织切片，60℃孵育1小时。二甲苯中浸泡30分钟脱蜡，并依次浸泡浓度梯度乙醇溶液。使用甲醇配制的3％过氧化氢溶液室温封闭10分钟。pbs洗3次，每次5分钟。含5％羊血清的pbs中室温封闭2小时。一抗4℃孵育过夜。pbs洗3次，每次5分钟。hrp标记羊抗鼠二抗室温孵育30分钟。pbs洗3次，每次5分钟。使用dab显色后，立刻放入装有pbs的卧式染缸内冲洗，终止显色。依次浸泡浓度梯度乙醇溶液，并在二甲苯中浸泡10分钟，滴加中性树胶封片，普通光学显微镜观察、记录；结果见图1、图2、表2。由图1可见，scca在部分胃低分化腺癌中表达增加，而在胃炎不表达，在原发性胃腺鳞癌中表达大幅增加。由表2可见，18例胃低分化腺癌患者石蜡切片，临床病理常用免疫组化标志物评价不一。而scca在胃低分化腺癌细胞的阳性率达22％(4/18)。由图2可知，aldh1在正常干细胞、癌组织中正常干细胞及癌干细胞均有表达。表2.18例胃低分化腺癌患者组织石蜡切片的常规标志物和scca免疫组化结果实施例2挑选18例胃低分化腺癌中scca表达阳性的4例，其石蜡切片进行scca和aldh1免疫荧光染色。石蜡切片免疫荧光染色：选取4μm石蜡包埋的人胃组织切片，60℃孵育1小时。二甲苯中浸泡30分钟脱蜡，并依次浸泡浓度梯度乙醇溶液。一部分切片进行he染色，用于组织形态学分析；另一部分进行免疫荧光染色，在柠檬酸盐缓冲液中(ph6.0)修复抗原，含5％羊血清的pbs中封闭，结合一抗4℃孵育过夜。pbs洗3次，每次5分钟。荧光标记羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗室温孵育2小时。pbs洗3次，每次5分钟。加入抗荧光淬灭试剂，荧光显微镜观察、记录；结果见图3、表3。由图3可见，目前病理检测无法识别的胃癌干细胞成分，使用scca/aldh1免疫荧光组合检测可进行区分。由表3可见，在病理诊断为胃低分化腺癌的患者中，胃低分化腺癌细胞scca阳性结果与aldh1阳性结果符合率达100％。表3scca表达阳性的4例胃低分化腺癌的scca-aldh1免疫荧光染色综合评价实施例3分离胃组织：1)将新鲜切除的病理确诊为低分化腺癌的胃组织放入预冷的含10％胎牛血清dmem/f12培养基；2)在超净台内用预冷的无菌pbs冲洗组织块，用无菌眼科剪破碎组织块至1mm左右，移至消化瓶；3)配置含iv型胶原酶、ii型胶原酶和透明质酸酶的dmem/f12培养基，加入消化瓶中，确保组织块完全浸没悬浮，无菌锡箔纸封口；4)37℃水平振荡消化至组织块消失；5)消化后细胞悬液经200目筛网过滤，所得上清1000rpm/min离心，5分钟；6)弃上清，预冷pbs重悬，1000rpm/min离心2次，每次5分钟；7)弃上清，沉淀用预冷pbs重悬，调整细胞浓度为1×106个/ml。制备aldh1检测样本：1)取出2个ep管，分别标记“test”和“control”；2)取1ml细胞悬液至“test”管；3)加入5μldeab试剂至“control”管；4)加入5μlaldefluor试剂至“test”管，迅速混匀，吸取500μl至“control”管，立即混匀；5)将“test”和“control”放入细胞培养箱孵育60分钟；6)250g，5分钟离心；7)“test”和“control”各加入200μlpbs重悬。标记scca及流式细胞术分选：1)加入scca-pe抗体5μl至“test”管，室温避光孵育15分钟；2)各加入1mlpbs，1000rpm，5min离心，弃上清；3)各加入1mlpbs重悬，使用流式细胞仪(bdaria)进行分选，dmem/f12干细胞培养基(含egf、bfgf、b27、bsa和its)收集分选所得scca+aldh1+细胞。标记cd44及流式细胞术检测：1)吸取少许分选所得scca+aldh1+细胞，加入cd44-apc抗体5μl，室温避光孵育15分钟；2)加入1mlpbs，1000rpm，5min离心，弃上清；3)加入1mlpbs重悬，使用流式细胞仪(bdcalibur)进行检测。cd44是一个胃癌干细胞次要标志物，结果如图4a所示，分选所得scca+aldh1+细胞均为cd44+，完全符合胃癌干细胞表型。其余scca+aldh1+细胞进行体外培养：1)细胞密度调整至1×104～1×105个/ml，接种于低粘附培养板中，置于细胞培养箱内培养，每2～4天更换干细胞培养基一次；2)培养7天，镜下观察低粘附培养板中的球形体，如图4b所示。实施例4我们随访了11例有淋巴结转移的胃低分化腺癌患者的生存情况。由表4可见，scca+aldh1+的见胃癌干细胞成分患者均为复发死亡，存活时间<24个月。而其他未见胃癌干细胞成分的患者仅28％(2/7)复发。表4.18例胃低分化腺癌患者复发、生存情况。编号手术/化疗scca/aldh1免疫荧光染色综合评价复发/生存病例1手术+化疗未见胃癌干细胞成分存活病例2手术+化疗未见胃癌干细胞成分存活病例3手术+化疗未见胃癌干细胞成分无复发死亡病例6手术+化疗未见胃癌干细胞成分复发死亡病例7手术+化疗见胃癌干细胞成分复发死亡病例8手术+化疗见胃癌干细胞成分复发死亡病例11手术+化疗见胃癌干细胞成分复发死亡病例13手术+化疗见胃癌干细胞成分复发死亡病例14手术+化疗未见胃癌干细胞成分存活病例16手术+化疗未见胃癌干细胞成分复发存活病例17手术+化疗未见胃癌干细胞成分存活当前第1页12