快速电泳用聚丙烯酰胺凝胶及其应用及其使用方法与流程

[0001]
本发明涉及电泳技术领域，具体是一种快速电泳用聚丙烯酰胺凝胶及其应用及其使用方法。


背景技术：

[0002]
聚丙烯酰胺凝胶电泳，polyacrylamide gel electrophoresis，简称page，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，用于分离蛋白质。聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-page）和 sds-聚丙烯酰胺凝胶（sds-page）。非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而sds-page仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（sds即十二烷基硫酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（aps）为催化剂，以四甲基乙二胺（temed）为加速剂。在聚合过程中，temed催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉基交联，从而形成三维网状结构。
[0003]
page电泳体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由过硫酸铵和四甲基乙二胺催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为ph6.8的tris-hcl。分离胶是由ap催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为ph8.9的tris-hcl。电极缓冲液是ph8.3的tris-甘氨酸缓冲液。常规的制备page胶是将丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，tris-hcl，过硫酸铵，sds，四甲基乙二胺和双蒸水按一定的比例配置，要先配置完分离胶待凝固之后，再配置浓缩胶，插上梳子完成page胶制备过程。但由此制得的page胶易出现电泳时间长、电泳后凝胶不易剥离、样本分辨率不高、凝胶保质期短等问题。


技术实现要素：

[0004]
为了克服现有的电泳凝胶存在的不足，本发明提供了一种快速电泳用聚丙烯酰胺凝胶及其应用及其使用方法。
[0005]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种快速电泳用聚丙烯酰胺凝胶，包括浓缩胶和分离胶；浓缩胶包含：ph缓冲体系4-6ml、30%（w/v）的混合胶溶液2-3ml、10%（w/v）的sds 180-210ul、10%（w/v）的aps 90-110ul、temed 8-12ul、ddh
2
o 10-12ml、1%的（w/v）低缺陷型氧化石墨烯 18-20ul；分离胶包含：ph缓冲体系4-6ml、30%（w/v）的混合胶溶液13-15ml、10%（w/v）的sds 180-200ul、50-70%的甘油600-650ul、10%（w/v）的aps 70-80ul、temed7-8ul、ddh
2
o 700-730ul、
1%（w/v）的低缺陷型氧化石墨烯18-20ul；混合胶溶液由丙烯酰胺和甲叉二丙烯酰胺组成。
[0006]
根据本发明的另一个实施例，进一步包括，ph缓冲体系为为三羟甲基氨基甲烷(tris)、双(2-羟基乙胺基)三(羟甲基)甲烷(bis-tris)、三乙醇胺、k+阳离子介质中的一种或多种与乙酸根和cl-阴离子介质中的一种或两种相互搭配形成的缓冲体系。
[0007]
根据本发明的另一个实施例，进一步包括，浓缩胶包含：1.5（mol/l）的缓冲体系 5ml、30%（w/v）的混合胶溶液2.67ml、10%（w/v）的sds 200ul、10%（w/v）的aps 100ul、temed 10ul、ddh
2
o 12ml、1（w/v）%的低缺陷型氧化石墨烯20ul。
[0008]
根据本发明的另一个实施例，进一步包括，分离胶包含：1.5（mol/l）的缓冲体系 5ml、30%（w/v）的混合胶溶液13.33ml、10%（w/v）的sds 溶液200ul、 70%（w/v）的甘油640ul、10%（w/v）的aps 75ul、temed 7.5ul、ddh
2
o 720ul、1%（w/v）的低缺陷型氧化石墨烯20ul。
[0009]
根据本发明的另一个实施例，进一步包括，ph缓冲体系的ph为7-9；丙烯酰胺和甲叉二丙烯酰胺的质量比为（20-40）:1一种快速电泳用聚丙烯酰胺凝胶应用于电泳分离蛋白质、核酸。
[0010]
一种快速电泳用聚丙烯酰胺凝胶应用的方法，包括如下步骤：（1）配制分离胶溶液，并将分离胶溶液加入到胶板中，加入超纯水覆盖其表面，静置，待其凝固后去除分离胶上层的超纯水；（2）配制浓缩胶溶液，并将浓缩胶加入分离胶上层，插入梳子，静置，待其凝固后形成电泳凝胶；（3）拔掉梳子，将蛋白质或核酸样品点入梳子拔出后留下的胶孔中，点样结束后，接通电源，开始电泳；（4）电泳结束后，取胶、染色、显影。
[0011]
根据本发明的另一个实施例，进一步包括，步骤（3）中，电泳为恒压160-180v，电泳时间为40-50min。
[0012]
本发明的有益效果是，石墨烯是一种由碳原子以sp2杂化轨道组成六角形呈蜂巢晶格的二维碳纳米材料，具有很好的韧性，可以弯曲，可以吸附并脱附各种原子和分子。当这些原子或分子作为给体或受体时可以改变石墨烯载流子的浓度，而石墨烯本身却可以保持很好的导电性。小片径氧化石墨烯含有丰富的含氧官能团，有很强的亲水性能，可溶于水、nmp、dmf、乙二醇等溶剂，同时在乙醇、thf等溶剂中有较好的分散性能。
[0013]
将低缺陷型氧化石墨烯与非连续性缓冲系统的聚丙烯酰胺预制凝胶结合，石墨烯溶解于凝胶水溶液中并充分扩散，分散后的石墨烯分子在水溶液中不携带固定电荷。因此，在电泳条件下没有电泳行为，不随电场条件产生分布梯度，可降低水溶液的表观介电常数，表观介电常数的降低使离子淌度增加，并使电泳系统中的单位体积内具有电泳行为的离解离子数增加，电化学驰豫效应加强，缩短了电泳时间。
附图说明
[0014]
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0015]
图1是本发明的电泳样本条带分辨率对比图1；图2是本发明的电泳样本条带分辨率对比图2；
图3是本发明的电泳时间对比图；图4是本发明的同等保质期状态下的对比图；以上所有的图左侧为添加石墨烯的凝胶使用或者电泳图，右侧为原始状态凝胶使用或者电泳图。
[0016]
图1和图2中添加石墨烯的凝胶样本，条带之间分离清晰，确定分辨率较高；图3中电泳相同时间，添加石墨烯的凝胶样本电泳速度更快，即电泳条带较为偏下；图4中，两者在同等保存前提下，添加石墨烯的凝胶样本保存完好，对比例已经产生气泡。
具体实施方式
[0017]
一种快速电泳用聚丙烯酰胺凝胶，包括浓缩胶和分离胶；浓缩胶包含：ph缓冲体系4-6ml、30%（w/v）的混合胶溶液2-3ml、10%（w/v）的sds 180-210ul、10%（w/v）的aps 90-110ul、temed 8-12ul、ddh
2
o 10-12ml、1%的（w/v）低缺陷型氧化石墨烯 18-20ul；分离胶包含：ph缓冲体系4-6ml、30%（w/v）的混合胶溶液13-15ml、10%（w/v）的sds 180-200ul、50-70%的甘油600-650ul、10%（w/v）的aps 70-80ul、temed7-8ul、ddh
2
o 700-730ul、1%（w/v）的低缺陷型氧化石墨烯18-20ul；混合胶溶液由丙烯酰胺和甲叉二丙烯酰胺组成。
[0018]
根据本发明的另一个实施例，进一步包括，ph缓冲体系为为三羟甲基氨基甲烷(tris)、双(2-羟基乙胺基)三(羟甲基)甲烷(bis-tris)、三乙醇胺、k+阳离子介质中的一种或多种与乙酸根和cl-阴离子介质中的一种或两种相互搭配形成的缓冲体系。
[0019]
根据本发明的另一个实施例，进一步包括，浓缩胶包含：1.5（mol/l）的缓冲体系 5ml、30%（w/v）的混合胶溶液2.67ml、10%（w/v）的sds 200ul、10%（w/v）的aps 100ul、temed 10ul、ddh
2
o 12ml、1（w/v）%的低缺陷型氧化石墨烯20ul。
[0020]
根据本发明的另一个实施例，进一步包括，分离胶包含：1.5（mol/l）的缓冲体系 5ml、30%（w/v）的混合胶溶液13.33ml、10%（w/v）的sds 溶液200ul、 70%（w/v）的甘油640ul、10%（w/v）的aps 75ul、temed 7.5ul、ddh
2
o 720ul、1%（w/v）的低缺陷型氧化石墨烯20ul。
[0021]
根据本发明的另一个实施例，进一步包括，ph缓冲体系的ph为7-9；丙烯酰胺和甲叉二丙烯酰胺的质量比为（20-40）:1一种快速电泳用聚丙烯酰胺凝胶应用于电泳分离蛋白质、核酸。
[0022]
一种快速电泳用聚丙烯酰胺凝胶应用的方法，包括如下步骤：（1）配制分离胶溶液，并将分离胶溶液加入到胶板中，加入超纯水覆盖其表面，静置，待其凝固后去除分离胶上层的超纯水；（2）配制浓缩胶溶液，并将浓缩胶加入分离胶上层，插入梳子，静置，待其凝固后形成电泳凝胶；（3）拔掉梳子，将蛋白质或核酸样品点入梳子拔出后留下的胶孔中，点样结束后，接通电源，开始电泳；（4）电泳结束后，取胶、染色、显影。
[0023]
根据本发明的另一个实施例，进一步包括，步骤（3）中，电泳为恒压160-180v，电泳
时间为40-50min。
[0024]
实施例一：一种快速电泳用聚丙烯酰胺凝胶，包括浓缩胶和分离胶，浓缩胶包括：1.5m的tris-hcl（ph=8.6）5ml、30%（w/v）的混合胶溶液 2.67ml、10%（w/v）的sds 200ul、10%（w/v）的aps 100ul、temed 10ul、ddh
2
o 12ml、1%（w/v）的低缺陷型氧化石墨烯20ul。
[0025]
优选地，分离胶包括：1.5m的tris-hcl 5ml、30%（w/v）的混合胶溶液13.33ml、10%（w/v）的sds 200ul、70%（w/v）的甘油640ul、10%（w/v）的aps 75ul、temed 7.5ul、ddh
2
o 720ul、1%（w/v）的低缺陷型氧化石墨烯20ul。
[0026]
其中，混合胶液由丙烯酰胺和甲叉二丙烯酰胺组成，丙烯酰胺和甲叉二丙烯酰胺的质量比为29:1。
[0027]
本发明还公开了一种快速电泳用聚丙烯酰胺凝胶的用途，所述用途是将快速电泳用聚丙烯酰胺凝用于电泳分离蛋白质，所述电泳方法步骤如下：（1）配制分离胶溶液，并将一定体积的分离胶溶液加入到胶板中，加入超纯水覆盖其表面，静置，待其凝固后去除分离胶上层的超纯水；（2）配制浓缩胶溶液，并将一定体积的浓缩胶加入分离胶上层，插入梳子，静置，待其凝固后形成电泳凝胶；（3）拔掉梳子，将溶菌酶样品点入胶孔中，点样结束后，接通电源，140v恒压电泳40min；（4）电泳结束后，取胶、染色、显影。
[0028]
需要说明的是，若本实施例的聚丙烯酰胺凝胶中不添加低缺陷型氧化石墨烯时，其电泳时间在45min以上。
[0029]
实施例二：一种快速电泳用聚丙烯酰胺凝胶，包括浓缩胶和分离胶，浓缩胶包括：bis-tris（ph=7）4ml、30%（w/v）的混合胶溶液2ml、10%（w/v）的sds 180ul、10%（w/v）的aps 90ul、temed 8ul、ddh
2
o 10ml、1%（w/v）的低缺陷型氧化石墨烯18ul；分离胶包括：bis-tris（ph=7）4ml、30%（w/v）的混合胶溶液13ml、10%（w/v）的sds 180ul、50%（w/v）的甘油600ul、10%（w/v）的aps 70ul、temed 7ul、ddh
2
o 700ul、1%（w/v）的低缺陷型氧化石墨烯18ul。
[0030]
其中，混合胶液由丙烯酰胺和甲叉二丙烯酰胺组成，丙烯酰胺和甲叉二丙烯酰胺的质量比为35:1。
[0031]
本发明还公开了一种快速电泳用聚丙烯酰胺凝胶的用途，所述用途是将快速电泳用聚丙烯酰胺凝用于电泳分离核酸，所述电泳方法步骤如下：（1）配制分离胶溶液，并将一定体积的分离胶溶液加入到胶板中，加入超纯水覆盖其表面，静置，待其凝固后去除分离胶上层的超纯水；（2）配制浓缩胶溶液，并将一定体积的浓缩胶加入分离胶上层，插入梳子，静置，待其凝固后形成电泳凝胶；（3）拔掉梳子，将ecoli裂解液样品点入胶孔中，点样结束后，接通电源，160v 恒压电泳35min；（4）电泳结束后，取胶、染色、显影。
[0032]
需要说明的是，若本实施例的聚丙烯酰胺凝胶中不添加低缺陷型氧化石墨烯时，其电泳时间在40min以上。
[0033]
实施例三：一种快速电泳用聚丙烯酰胺凝胶，包括浓缩胶和分离胶，浓缩胶包括：bis-tris（ph=9）6ml、30%（w/v）的混合胶溶液3ml、10%（w/v）的sds 210ul、10%（w/v）的aps 110ul、temed 12ul、ddh
2
o 12ml、1%（w/v）的低缺陷型氧化石墨烯 19ul；分离胶包括：bis-tris（ph=9）6ml、30%（w/v）的混合胶溶液14ml、10%（w/v）的sds 200ul、60%（w/v）的甘油650ul、10%（w/v）的aps 80ul、temed 8ul、ddh
2
o 730ul、1%（w/v）的低缺陷型氧化石墨烯19ul。
[0034]
其中，混合胶液由丙烯酰胺和甲叉二丙烯酰胺组成，丙烯酰胺和甲叉二丙烯酰胺的质量比为40:1。
[0035]
本发明还公开了一种快速电泳用聚丙烯酰胺凝胶的用途，所述用途是将快速电泳用聚丙烯酰胺凝用于电泳分离蛋白质，所述电泳方法步骤如下：（1）配制分离胶溶液，并将一定体积的分离胶溶液加入到胶板中，加入超纯水覆盖其表面，静置，待其凝固后去除分离胶上层的超纯水；（2）配制浓缩胶溶液，并将一定体积的浓缩胶加入分离胶上层，插入梳子，静置，待其凝固后形成电泳凝胶；（3）拔掉梳子，将样品点入胶孔中，点样结束后，接通电源，140v恒压电泳35min；（4）电泳结束后，取胶、染色、显影。
[0036]
需要说明的是，若本实施例的聚丙烯酰胺凝胶中不添加低缺陷型氧化石墨烯时，其电泳时间在45min以上。
[0037]
其中，sds：十二烷基硫酸钠；aps：过硫酸铵；temed：四甲基乙二胺；ddh2o:去离子水。
[0038]
以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围内。