基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶的快检新方法与流程

[0001]
本发明属于医学检验和食品安全检测领域，具体涉及一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶(fe3o4@pda@pd/pt)的快检新方法，来定量检测样本中的待测物浓度。


背景技术：

[0002]
免疫层析技术是一种基于抗原抗体特异性反应的检测方法，具有检测速度快、特异性好、操作简单和费用低等优点，相比于其它方法更能满足现场大批量检测的需求，因此近年来发展迅猛，被广泛应用于食品安全、医学检验和环境污染物监测等领域。其中胶体金免疫层析试纸条是应用最广泛的一种免疫层析产品，但其灵敏度较差且易受基质干扰。因此近年来的免疫层析技术主要有三个发展方向：一是采用免疫磁分离富集技术从复杂基质中分离浓缩目标物以避免样品基质的干扰；二是通过信号放大系统(如生物素-链霉亲和素系统等)以提高免疫层析方法的灵敏度；三是采用新型标记物(如荧光微球)，提高信号输出或转变信号输出类型，以达到提高灵敏度的目的。
[0003]
纳米酶是一类具有酶催化性质的纳米材料，例如贵金属纳米材料、金属氧化物和碳基材料等。相比于传统生物酶，其具备超高的稳定性及酶催化活性，因而广泛应用于临床诊断、生物成像及生物传感器领域。经典的金属纳米酶往往以单一金属组成，例如铂纳米酶和钯纳米酶等，之后又发展了一系列的以碳基材料作为载体的铂碳、钯碳等。近期研究发现，基于双金属协同效应，可大大提高纳米酶的催化活性。
[0004]
基质效应是影响实际检测准确性的重要因素。磁分离技术是一种通过免疫磁珠捕获目标物，在外加磁场下磁分离后再分散于一定体积的pbs中的样本前处理方法。通过该技术可以同时达到减弱基质效应和富集目标物的目的。
[0005]
基于上述情况，发明人通过一锅法合成了一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶(fe3o4@pda@pd/pt)作为探针，应用于医学检验和食品安全快速检测等领域并提高试纸条稳定性和检测灵敏度。目前，尚未有将fe3o4@pda@pd/pt作为探针应用于免疫层析法中的相关报道。


技术实现要素：

[0006]
本发明的一个目的是提供一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶fe3o4@pda@pd/pt的快检新方法。
[0007]
本发明的另一个目的是提供预固定fe3o4@pda@pd/pt标记抗体离心管的制备方法。
[0008]
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
[0009]
本发明提供了一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶fe3o4@pda@pd/pt的快检新方法，它包括预固定fe3o4@pda@pd/pt标记抗体离心管的制备和免疫层析试纸条的制备。其中，所述离心管固定有fe3o4@pda@pd/pt标记抗体复合物，该离心管的制备方法包括如下步骤：
[0010]
(1)fe3o4@pda@pd/pt的制备：将1.0mg fe3o4(50～500nm)分散于1ml tris-hcl缓
冲溶液(0.01～0.1m,ph 7～10)中，加入0.2～2.0mg盐酸多巴胺，搅拌反应10～24h后磁分离洗涤得fe3o4@pda，然后将fe3o4@pda复溶至1ml聚乙烯吡咯烷酮溶液(0.5％)中，加入100μl抗坏血酸(1～100mg/ml)、100μl氯钯酸钠(1～100mm)和100μl氯铂酸钾(1～100mm)，50～90℃加热反应15～45min，磁分离洗涤即得fe3o4@pda@pd/pt；
[0011]
(2)fe3o4@pda@pd/pt标记抗体的制备：向制得的fe3o4@pda@pd/pt中加入待标记抗体，混匀后，室温搅拌反应2h，之后，加入封闭剂，室温反应2h，离心取沉淀，得到的沉淀复溶，制成fe3o4@pda@pd/pt标记抗体复合物；
[0012]
(3)预固定fe3o4@pda@pd/pt标记抗体的离心管：取制得的fe3o4@pda@pd/pt标记抗体复合物滴加至离心管中，30℃真空干燥即可。
[0013]
进一步的，所述预固定fe3o4@pda@pd/pt标记抗体的离心管中的待标记抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、纳米抗体、噬菌体表达抗体。
[0014]
进一步的，步骤(2)中所述fe3o4@pda@pd/pt标记抗体的制备包括如下具体步骤：取fe3o4@pda@pd/pt超声1～10min，再用0.01～0.5m ph 6.0～8.0的硼酸盐缓冲液调节纳米酶浓度至0.01～0.1mg/ml，加入待标记抗体使其终浓度为1～100μg/ml，振荡混匀后，室温搅拌反应2h，之后，加入封闭剂，使其终浓度为0.1～1％，室温反应2h，然后磁分离去上清，沉淀用0.01～0.1m ph 7.4～8.0的磷酸盐缓冲液复溶为起始体积的1/10，制成fe3o4@pda@pd/pt标记抗体复合物于4℃保存备用；
[0015]
进一步的，本发明的硝酸纤维素膜上包被有待测物人工偶联抗原或待测物抗体作为检测线，包被有抗鼠抗体或抗兔抗体(二抗)作为质控线；其中，该硝酸纤维素膜的制备方法，包括如下步骤：
[0016]
(1)使用0.01～0.5m ph 6.0～8.0的pbs(磷酸盐缓冲溶液)溶液分别调节包被物待测物人工偶联抗原或待测物抗体、抗鼠抗体或抗兔抗体至浓度为0.01～10.0mg/ml；
[0017]
(2)将调整浓度后的待测物人工偶联抗原或待测物抗体喷涂于硝酸纤维素膜上部，作为检测线，将抗鼠抗体或抗兔抗体喷涂于硝酸纤维素膜下部，作为质控线；其中，检测线和质控线之间间隔一定距离，二者的喷量均为0.25～0.74μl/cm；
[0018]
(3)将喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜于37℃过夜烘干处理后，在室温干燥的环境下保存备用。
[0019]
进一步的，所述的待测物人工偶联抗原是指小分子待测物与大分子蛋白质通过化学偶联方法制备的具有免疫原性和反应原性的全抗原；其中，所述的小分子待测物涵盖医学检验领域和食品安全检测领域所需要检测的所有小分子物质；所述的偶联方法包括重氮法、碳二亚胺法、戊二醛法、混合酸酐法、琥珀酸酐法；所述的偶联大分子蛋白包括牛血清白蛋白、酪蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白；所述的偶联比为1:5～1:200，偶联后透析纯化，得到所需的人工偶联抗原。
[0020]
进一步的，所诉待测物抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、纳米抗体。
[0021]
进一步的，所述的免疫层析试纸条的组装，包括以下步骤：
[0022]
(1)在底板上搭接粘贴下述材料：滤纸、样本垫、喷涂有待测物偶联人工抗原或抗体作为检测线和抗鼠抗体/抗兔抗体作为质控线的硝酸纤维素膜和吸水纸，即组装成本发明使用的免疫层析试纸条大板。
[0023]
(2)组装好的试纸条大板，通过切刀切成需要的宽度，即成本发明使用的免疫层析
试纸条，该试纸条可以直接使用，也可以装入塑料卡壳中使用。
[0024]
本发明提供的一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶fe3o4@pda@pd/pt的快检新方法的检测过程包括：
[0025]
经过处理后的检测样本加样到本发明制备的免疫层析试纸条，加样体积为50～200μl/条，反应时间为3～20分钟，之后，在试纸条上滴加10～100μl萘乙酸/二氨基联苯胺(cn/dab，5.5mm)显色液，避光显色1～5min，可以通过读取该试纸条上检测线和质控线的灰度数据，内置标准曲线计算检测样本浓度来实现定量检测，也可以通过肉眼观察检测线和质控线有无显色条带来实现定性判断。
[0026]
本发明的有益效果是：
[0027]
本发明制备的免疫层析试纸条首次以fe3o4@pda@pd/pt作为信标载体，相比于传统的胶体金和hrp酶其稳定性高且信号强，制备得到的免疫层析试纸条稳定性高且检测灵敏度高。
附图说明
[0028]
图1是基于fe3o4@pda@pd/pt的快检方法原理图，其中，1fe3o4@pda@pd/pt-mab、2磁铁、3pvc底板、4吸水纸、5质控线、6nc膜、7检测线、8样本垫、9滤纸、10目标物、11氧化态dab；
[0029]
图2为合成的fe3o4@pda@pd/pt透射电镜表征图。
[0030]
图3为基于fe3o4@pda@pd/pt的快检方法检测人绒毛膜促性腺激素(hcg)实物图，其中a为直接结果，b为加cn/dab显色液后的结果，浓度单位为miu/ml。
[0031]
图4为基于fe3o4@pda@pd/pt的快检方法检测大肠杆菌o157:h7(e.coli o157:h7)实物图，其中a为直接结果，b为加cn/dab显色液后的结果，浓度单位为cfu/ml。
[0032]
如图1所示，fe3o4@pda@pd/pt-mab复合物捕获目标物，外加磁场下磁分离富集目标物，转移加样至免疫层析试纸条，试纸条显色稳定后，加cn/dab显色液与fe3o4@pda@pd/pt作用增强显色。该免疫层析试纸条的构成为：在pvc底板3上，依次搭接地粘贴喷涂有检测线7和质控线5的nc膜6、样本垫8、滤纸9和吸水纸4，粘贴好后通过切条机切成4
×
55mm的试纸条，装入塑料卡壳中，即为一张完整的检测试纸条。
[0033]
如图3和4所示，加入cn/dab显色液后显色强度大大强于直接显色结果，可以大大提高检测方法灵敏度。
具体实施方式
[0034]
实施例1：fe3o4@pda@pd/pt的制备：
[0035]
一、fe3o4@pda的制备：将1.0mg fe3o4(100nm)分散于1ml tris-hcl缓冲溶液(0.05m,ph 8.5)中，加入1mg盐酸多巴胺，搅拌反应15h后磁分离洗涤得fe3o4@pda；
[0036]
二、fe3o4@pda@pd/pt的制备：将fe3o4@pda复溶至1ml聚乙烯吡咯烷酮溶液(0.5％)中，加入100μl抗坏血酸(10mg/ml)、100μl氯钯酸钠(10mm)和100μl氯铂酸钾(10mm)，65℃加热反应20min，磁分离洗涤即得fe3o4@pda@pd/pt。
[0037]
实施例2：一种使用fe3o4@pda@pd/pt为信标载体制备的检测人绒毛膜促性腺激素(hcg)的夹心法免疫层析试纸条的制备
[0038]
一、免疫层析试纸条的制备工艺
[0039]
1.硝酸纤维素膜的制备；
[0040]
抗hcg多抗和抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上：用0.01m ph 7.4的pbs稀释抗hcg多抗的浓度为0.5mg/ml，所得的溶液在膜上喷涂作为检测线；稀释抗鼠抗体的浓度为0.5mg/ml，所得的溶液在膜上喷涂作为质控线，两线的喷量均为0.74μl/cm，检测线与膜顶边间隔10mm，两线中间间隔5mm，37℃烘干12小时，放置于干燥柜中保存备用。
[0041]
2.fe3o4@pda@pd/pt-抗体复合物包被离心管的制备：
[0042]
取0.5mg fe3o4@pda@pd/pt超声(实施例1制备得到)1分钟，用ph 6.0的0.1m硼酸盐缓冲液调节fe3o4@pda@pd/pt浓度为0.05mg/ml，振荡混匀后，1ml fe3o4@pda@pd/pt中加入6μg hcg单克隆抗体，充分混合后，4℃搅拌反应2h，加入终浓度为0.5％的牛血清白蛋白，室温封闭2h，8000r/min离心30min，沉淀用0.01m ph 7.4的磷酸盐缓冲液(pbs)复溶为起始体积的1/10，按照5μl/个滴加至离心管中，30℃真空干燥2h。
[0043]
3.组装试纸条：
[0044]
(1)滤纸和样本垫规格为1
×
30cm；
[0045]
(2)喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，规格为2.5
×
30cm；
[0046]
(3)吸水纸，规格为1.2
×
30cm；
[0047]
(4)pvc底板，规格为5.5
×
30cm。
[0048]
将以上材料按照试纸条结构示意图中各组分位置进行依次粘贴，组装好后用切刀裁切成4
×
55mm的试纸条，装入塑料卡壳中，压紧后装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，室温环境保质期为12个月。
[0049]
二、定量检测样本中的hcg
[0050]
用上述的免疫层析试纸条检测样本中hcg的方法，包括如下的步骤：
[0051]
1.在试纸条加样孔中加入人血清样本100μl，反应15min，再加入50μl cn/dab(5.5mm)，避光反应2min；
[0052]
2.将试纸条插入试纸条读取仪的检测窗口，检测线和质控线显色的强弱会以数值的高低在显示器上显示，根据仪器中已经录入的标准曲线，即可计算出样本中hcg的含量，实现样本中hcg的定量检测。
[0053]
3.建立标准曲线：在阴性基质中加标，标准曲线中hcg浓度为：0、1、2、4、6、8、10、15、20、50miu/ml，r2为0.9921，线性回归方程式为：y＝0.2516ln(x)+0.1775。
[0054]
实施例3：一种使用fe3o4@pda@pd/pt为信标载体制备的检测玉米赤霉烯酮(zen)的竞争法免疫层析试纸条的制备
[0055]
一、免疫层析试纸条的制备工艺
[0056]
1.硝酸纤维素膜的制备；
[0057]
⑴
制备zen人工抗原(zen-bsa)：
[0058]
偶联方法为混合酸酐法，偶联蛋白为牛血清白蛋白(bsa)，偶联比为1:100，偶联后透析纯化，得到zen-bsa。
[0059]
⑵
检测线和质控线的制备：
[0060]
zen-bsa偶联物和抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上：用0.01m ph 7.4的pbs稀释zen-bsa偶联物的浓度为6mg/ml，所得的溶液在膜上喷涂作为检测线；稀释抗鼠抗体的浓度为0.5mg/ml，所得的溶液在膜上喷涂作为质控线，两线的喷量均为0.74μl/cm，检测线与膜
顶边间隔10mm，两线中间间隔5mm，37℃烘干12h，放置于干燥柜中保存备用。
[0061]
2.fe3o4@pda@pd/pt-抗体复合物包被离心管的制备：
[0062]
取0.5mg fe3o4@pda@pd/pt超声(实施例1制备得到)1分钟，用ph 7.4的0.2m硼酸盐缓冲液调节纳米酶浓度为0.05mg/ml，振荡混匀后，1ml fe3o4@pda@pd/pt中加入10μg zen单克隆抗体，充分混合后，4℃搅拌反应2h，加入终浓度为0.5％的酪蛋白，室温封闭2h，8000r/min离心30min，沉淀用0.01m ph 7.4的pbs复溶为起始体积的1/10，按照5μl/个体积滴加至离心管中，30℃真空干燥2h。
[0063]
3.组装试纸条：
[0064]
(1)滤纸和样本垫规格为1
×
30cm；
[0065]
(2)喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，规格为2.5
×
30cm；
[0066]
(3)吸水纸，规格为1.2
×
30cm；
[0067]
(4)pvc底板，规格为5.5
×
30cm。
[0068]
将以上材料按照试纸条结构示意图中各组分位置进行依次粘贴，组装好后用切刀裁切成4
×
55mm的试纸条，装入塑料卡壳中，压紧后装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，室温环境保质期为12个月。
[0069]
二、定量检测样本中的zen
[0070]
用上述的免疫层析试纸条检测样本中zen的方法，包括如下的步骤：
[0071]
1.称取饲料或粮食样本2g，加入10ml提取液后震荡1分钟，取上清液检测；
[0072]
2.在试纸条加样孔中加入110μl样本，反应5min，再加入50μl cn/dab(5.5mm)，避光反应2min；
[0073]
3.将试纸条插入试纸条读取仪的检测窗口，检测线和质控线显色的强弱会以数值的高低在显示器上显示，根据仪器中已经录入的标准曲线，即可计算出样本中zen的含量，实现阳性样本的定量检测。
[0074]
4.建立标准曲线：在阴性基质中加标，标准曲线中zen浓度为：0、0.5、1、2、4、8ppb，计算r2为0.9912，线性回归方程式为：y＝-896.9ln(x)+1678.3。
[0075]
实施例4：一种使用fe3o4@pda@pd/pt为信标载体制备的检测乙肝表面抗原(hbsag)的夹心法免疫层析试纸条的制备
[0076]
一、免疫层析试纸条的制备工艺
[0077]
1.硝酸纤维素膜上检测线和质控线的制备：
[0078]
hbsag多克隆抗体和抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上：用0.01m ph 7.4的pbs稀释hbsag多克隆抗体的浓度为2mg/ml，所得的溶液喷涂在膜上作为检测线；稀释抗鼠抗体的浓度为0.5mg/ml，所得的溶液喷涂在膜上作为质控线，两线的喷膜量均为0.74μl/cm，检测线与膜顶边间隔10mm，两线中间间隔5mm，37℃烘干12h，放置于干燥柜中保存备用。
[0079]
2.fe3o4@pda@pd/pt-抗体复合物玻璃纤维垫的制备：
[0080]
取0.5mg fe3o4@pda@pd/pt(实施例1制备得到)超声1分钟，用ph 6.0的0.01m pbs缓冲液调节纳米酶浓度为0.1mg/ml，振荡混匀后，1ml fe3o4@pda@pd/pt中加入50μg hbsag单克隆抗体，充分混合后，4℃搅拌反应2h，加入终浓度为0.5％的牛血清白蛋白，室温封闭2h，8000r/min离心30min，沉淀用0.01m ph 7.4的pbs复溶为起始体积，按照7μl/个体积滴加至离心管中，30℃真空干燥2h。
[0081]
3.组装试纸条：
[0082]
(1)滤纸和样本垫规格为1
×
30cm；
[0083]
(2)喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，规格为2.5
×
30cm；
[0084]
(3)吸水纸，规格为1.2
×
30cm；
[0085]
(4)pvc底板，规格为5.5
×
30cm。
[0086]
将以上材料按照试纸条结构示意图中各组分位置进行依次粘贴，组装好后用切刀裁切成4
×
55mm的试纸条，装入塑料卡壳中，压紧后装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，室温环境保质期为12个月。
[0087]
二、定量检测样本中的hbsag
[0088]
用上述的免疫层析试纸条检测样本中hbsag的方法，包括如下的步骤：
[0089]
1.在试纸条加样孔中加入人血清样本100μl，反应20min，再加入50μl cn/dab(5.5mm)，避光反应2min；
[0090]
2.将试纸条插入试纸条读取仪的检测窗口，检测线和质控线显色的强弱会以数值的高低在显示器上显示，根据仪器中已经录入的标准曲线，即可计算出样本中hbsag的含量，实现样本中hbsag的定量检测。
[0091]
3.调节标准曲线：在阴性基质中加标，加标标准曲线中hbsag浓度为：0、10、20、40、80、160ppb，计算r2为0.9946，线性回归方程式为：y＝-429.9ln(x)+4341.3。
[0092]
实施例5：一种使用fe3o4@pda@pd/pt为信标载体制备的检测大肠杆菌o157:h7的夹心法免疫层析试纸条的制备
[0093]
一、免疫层析试纸条的制备工艺
[0094]
1.硝酸纤维素膜上检测线和质控线的制备：
[0095]
大肠杆菌o157:h7多克隆抗体和抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上：用0.01m ph 7.5的pbs稀释o157:h7多克隆抗体的浓度为2mg/ml，所得的溶液喷涂在膜上作为检测线；稀释抗鼠抗体的浓度为0.5mg/ml，所得的溶液喷涂在膜上作为质控线，两线的喷量均为0.74μl/cm，检测线与膜顶边间隔10mm，两线中间间隔5mm，37℃烘干12h，放置于干燥柜中保存备用。
[0096]
2.fe3o4@pda@pd/pt-抗体复合物包被离心管的制备：
[0097]
取0.5mgfe3o4@pda@pd/pt(实施例1制备得到)超声1分钟，用ph 8.0的0.2m硼酸盐缓冲液调节纳米酶浓度为0.05mg/ml，振荡混匀后，1ml fe3o4@pda@pd/pt中加入20μg大肠杆菌o157:h7单克隆抗体，充分混合后，4℃搅拌反应2h，加入终浓度为0.5％的酪蛋白，室温封闭2h，8000r/min离心30min，沉淀用0.01m ph 7.4的pbs复溶为起始体积的1/10，按照9μl/个体积滴加至离心管中，30℃真空干燥2h。
[0098]
3.组装试纸条：
[0099]
(1)滤纸和样本垫规格为1
×
30cm；
[0100]
(2)喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，规格为2.5
×
30cm；
[0101]
(3)吸水纸，规格为1.2
×
30cm；
[0102]
(4)pvc底板，规格为5.5
×
30cm。
[0103]
将以上材料按照试纸条结构示意图中各组分位置进行依次粘贴，组装好后用切刀裁切成4
×
55mm的试纸条，装入塑料卡壳中，压紧后装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，
室温环境保质期为12个月。
[0104]
二、定量检测样本中的大肠杆菌o157:h7
[0105]
用上述的免疫层析试纸条检测样本中大肠杆菌o157:h7的方法，包括如下的步骤：
[0106]
1.样本前处理：样本按照国标方法进行增菌培养，培养后检测；
[0107]
2.在试纸条加样孔中加入110μl样本，反应5min，再加入50μl cn/dab(5.5mm)，避光反应2min；
[0108]
3.将试纸条插入试纸条读取仪的检测窗口，检测线和质控线显色的强弱会以数值的高低在显示器上显示，根据仪器中已经录入的标准曲线，即可计算出样本中大肠杆菌o157:h7的含量，实现样本的定量检测。
[0109]
4.调节标准曲线：在阴性基质中加标，标准曲线中大肠杆菌o157:h7浓度为：0、102、103、104、105、106cfu/ml，计算出r2为0.9965，线性回归方程式为：y＝654.3ln(x)+5120.4。
[0110]
以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。