基于特征香气物质GC-IMS指纹图谱的葡萄砧木评价方法与流程

本发明涉及葡萄种植
技术领域：
，具体涉及一种基于特征香气物质gc-ims指纹图谱的葡萄砧木评价方法。
背景技术：
：葡萄嫁接栽培始于19世纪70年代，gastonbazille提出将欧洲葡萄嫁接在美洲葡萄上以抵御根瘤蚜危害。随着葡萄砧木研究的开展和嫁接栽培技术的推广，除了利用砧木的抗性，通过嫁接技术改善葡萄生长结果与果实品质也是一直的研究重点。砧穗相互影响是一个相对复杂的过程，砧木根系会影响接穗营养元素的吸收，对接穗的生长势、结果习性和果实品质具有不同的影响，接穗品种对同一砧木的根构型，尤其是根系分布和根系数量有一定影响，但砧穗互作机制目前仍不清楚。国内外研究发现，砧木对嫁接品种的物候期、产量、穗质量、粒质量、果实糖酸含量、可溶性固形物、果实硬度、着色、果实白藜芦醇等次生代谢物含量、成熟度与贮藏期等方面均会产生不同的影响。特定葡萄品种在进行嫁接前，需要进行砧木筛选。根据种植地域的环境因素进行砧木抗性的筛选，如抗寒性、抗寒性、耐盐碱性等；根据待嫁接品种特性，开展砧穗亲和性评价；最后通过嫁接后的生长发育、结果特性及果实品质综合评价嫁接砧木的适宜性。结果特性评价是终端评价指标，尤为重要。现有研究和技术应用中，砧木对葡萄生长发育及结果特性的评价标准相对单一，往往基于果粒大小、糖酸组成等基础理化指标进行评价判断，具有一定的随机性。国内学者葡萄嫁接在不同砧木的结果性状及果实品质进行了评价分析，测定了果粒大小及果形指数、果穗大小及穗重、可溶性固形物、酸度、果实硬度、总酚、总花色苷含量、糖组成、有机酸组成等理化指标，评价指标繁杂多样，往往依据某一个或几个基础理化指标的高低判定其嫁接砧木的优势，结果过于片面，结论不能很好地应用于生产。gc-ims分析技术广发应用于食品风味研究领域，具有灵敏度高、稳定性好、响应速度快、数据处理简单等优点。目前研究中，基于香味指纹图谱应用于产地判别、快速检测、掺假检验、快速分类、加工工艺评价等
技术领域：
。目前未见在果树砧木嫁接效果评价方面的应用实例。因此，基于特征香气物质组成可以作为评价该品种砧木适宜性的重要指标。建立一种高效评价嫁接葡萄生长结果及果实品质效果的方法具有重要的应用参考价值和产业意义。其中，‘瑞都红玉’葡萄是北京市农林科学院林业果树研究所在‘瑞都香玉’(母本为‘京秀’、父本为‘香妃’)高接试验中发现的1个红色芽变，于2014年12月被北京市农作物品种审定委员会审定，具有早熟、果皮红色、果肉脆甜、玫瑰香浓郁等特点。瑞都红玉是典型的玫瑰香型葡萄品种，香气特征是评价该品种果实品质的重要因素。基于特征香气物质组成可以作为评价瑞都红玉葡萄品种砧木适宜性，有很高的实际应用前景。技术实现要素：本发明的发明目的是，针对上述问题，提供一种基于特征香气物质gc-ims指纹图谱的葡萄砧木评价方法，操作简单、样品检测时间短以及不需要复杂的样品前处理，具有较高的应用价值。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种基于特征香气物质gc-ims指纹图谱的葡萄砧木评价方法，包括以下步骤，s1.标准样品处理：s11.标准样品选择：样品来源于同一栽培区域，按照相同栽培管理措施种植的不同砧木嫁接葡萄，样本数量n为3-20种不同砧木；另选择1-3个样品的该品种自根苗；s12.取样：将选择的样品进行混合取样，然后用刀片切开，取出葡萄籽，果肉粉碎成粉末，得到标准样品，装入进样瓶，封口膜封口，-80℃冷冻存样备用；s2.待测样品处理：将待检测的砧木按照步骤s1的方法进行处理得到待测样品；s3.气相-离子迁移谱分析：通过气相色谱-离子迁移谱联用仪对标准样品进行挥发性物质的检测，得到指纹谱图；s4.数据处理与分析：采用比较法提取步骤2获得的指纹图谱上的特征值区域，所述比较法为根据特征物质在指纹信息谱图中颜色的差异变化和峰面积，选择不同砧木和自根苗葡萄果实样品挥发物质谱图物质点颜色变化深或峰面积差异大的谱图特征区域；s5.选取及评价方法构建：根据物质峰强度信号差异和物质对应的保留时间和迁移时间，从特征区域中选取能显著区分不同砧木及自根葡萄的2-5类种特征香气物质作为对该葡萄品种砧木进行评价的标准；s6.待测样品判定：采用步骤s3同样的仪器条件对待测样品进行检测，获得指纹图谱，参照步骤s5的评价标准进行判定。优选的，步骤s1中，具体取样步骤为：将步骤s11的每个样品分别处理取样，每个处理中，5株为1个重复，可设置2-6个重复；每个重复试验中，每株树随机取样1-3穗葡萄果穗，单穗葡萄上、中、下部位分别取样1果粒，混合样品为一个重复的样品。优选的，步骤s1中，取出葡萄籽，加液氮粉碎成粉末，冷冻状态下取样1-10g样品装入顶空进样瓶。优选的，步骤s2中，采用气相-离子迁移谱对样品进行分析，色谱柱类型fs-se-54-cb-1，柱温40℃，载气/漂移气n2，ims温度45℃；顶空进样单元条件：进样体积500ul，孵育时间15min，孵育温度40℃，进样针温度85℃，孵化转速500rpm；漂移气流速度150ml/min，气相载气流速2-20ml/min。优选的，步骤s4中，当葡萄品种为瑞都红玉葡萄时，具体的评价标准如下：(1)筛选出第一类物质，pentanal及其聚合体的气相保留时间为3.760min，离子漂移时间为1.1935ms，反应青草和香蕉的香气，用于主成分分析中区分砧木嫁接瑞都红玉葡萄和自根苗葡萄，当峰面积高于350au，为自根苗瑞都红玉，反之为砧木嫁接瑞都红玉葡萄；(2)筛选出第二类物质，包括3种物质包括linalool,2-propanol,3-methylbutanal，气相保留时间分别为：16.575min、2.191min、3.302min，离子漂移时间分别为：1.217ms、1.169ms、1.405ms，判别临界峰面积1000au，具备玫瑰、铃兰、苹果等花香和果香特征，用于主成分分析中判别砧木嫁接的瑞都红玉葡萄果实香气品质的典型性和浓郁度；明显含有该第二类物质的具备本品种典型香气，不含有的不具备典型香气；该第二类物质出峰响应强度高反应典型香气的浓郁度高，反之则说明浓郁度低；可以依据第二类物质直接判别砧木是否为合适的选择；(3)筛选出第三类物质，包括11种物质，物质编号、气相保留时间和离子漂移时间如下：1号峰:气相保留时间4.937min,离子漂移时间1.097ms,判别临界峰面积100au；3号峰:气相保留时间3.643min,离子漂移时间1.263ms,判别临界峰面积100au；10号峰:气相保留时间3.523min,离子漂移时间1.059ms,判别临界峰面积500au；11号峰:气相保留时间3.510min,离子漂移时间1.229ms,判别临界峰面积100au；16号峰:气相保留时间2.795min,离子漂移时间1.152ms,判别临界峰面积500au；3-pentanone:气相保留时间3.838min,离子漂移时间1.108ms,判别临界峰面积300au；n-nonanal:气相保留时间16.640min,离子漂移时间1.477ms,判别临界峰面积500au；furfurol:气相保留时间6.071min,离子漂移时间1.083ms,判别临界峰面积150au；2,3-pentanedione:气相保留时间3.812min,离子漂移时间1.224ms,判别临界峰面积100au；gamma-butyrolactone:气相保留时间8.671min,离子漂移时间1.080ms,判别临界峰面积100au；采用以上11种物质用于主成分分析中判别砧木嫁接的瑞都红玉葡萄果实香气品质的丰满度或复杂性，含有该类11中物质中6-11种说明该样本香气丰满度高、复杂性强，说明用于嫁接的砧木具有优越性；反之少于6种说明该样品香气结构单一，丰满度低，说明用于嫁接的砧木不具有优越性。其中，含有该物质指的是期检测出峰面积超过以下表格中各物质对应的临界峰面积。由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：1.本发明的基于特征香气物质gc-ims指纹图谱的葡萄砧木评价方法，用简单快速的气相-离子迁移谱技术结合化学分析对不同砧木的葡萄香气物质进行分析，基于特征香气物质的指纹图谱，快速评价判定不同砧木嫁接葡萄的结果果实品质优劣。方法操作简单、样品检测时间短以及不需要复杂的样品前处理，具有较高的应用价值。2.本发明的基于特征香气物质gc-ims指纹图谱的葡萄砧木评价方法，鲜食葡萄的香气成分主要包括醇、醛、酯及萜烯类等化学组成，这些挥发性物质是葡萄次生代谢产物。特定品种的典型香气特征由特征性的挥发性成分构成。特征香气物质种类和含量的累积水平一定程度上能够充分反映该品种的成熟度及果实品质。因此，基于特征香气物质指纹图谱判别瑞都红玉嫁接砧木的特性具有科学依据。3.本发明的基于特征香气物质gc-ims指纹图谱的葡萄砧木评价方法，大大缩短和简化了果树砧木选择的过程，在其他果树的研究与生产上均可借鉴应用，有很高的实际应用前景。附图说明图1为不同砧木嫁接的葡萄样品中挥发性有机物指纹图谱对比；图2为不同砧木嫁接的葡萄样品中挥发性有机物差异变化。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1一种基于特征香气物质gc-ims指纹图谱的葡萄砧木评价方法，包括以下步骤，s1.标准样品处理：s11.标准样品选择：样品来源于同一栽培区域，按照相同栽培管理措施种植的不同砧木嫁接葡萄，样本数量n为3-20种不同砧木；另选择1-3个样品的该品种自根苗；s12.取样：将选择的样品进行混合取样，每个处理中，5株为1个重复，可设置2-6个重复；每个重复试验中，每株树随机取样1-3穗葡萄果穗，单穗葡萄上、中、下部位分别取样1果粒，混合样品为一个重复的样品。然后用刀片切开，取出葡萄籽，果肉粉碎成粉末，得到标准样品，装入进样瓶，封口膜封口，-80℃冷冻存样备用；s2.待测样品处理：将待检测的砧木按照步骤s1的方法进行处理得到待测样品；s3.气相-离子迁移谱分析：通过气相色谱-离子迁移谱联用仪对标准样品进行挥发性物质的检测，得到指纹谱图；s4.数据处理与分析：采用比较法提取步骤2获得的指纹图谱上的特征值区域，所述比较法为根据特征物质在指纹信息谱图中颜色的差异变化和峰面积，选择不同砧木和自根苗葡萄果实样品挥发物质谱图物质点颜色变化深或峰面积差异大的谱图特征区域；对全部特征区域的物质出峰数据进行正交变换和降维，实现对n×m个葡萄果实样品进行快速聚类；s5.选取及评价方法构建：根据物质峰强度信号差异和物质对应的保留时间和迁移时间，从特征区域中选取能显著区分不同砧木及自根葡萄的2-5类种特征香气物质作为对该葡萄品种砧木进行评价的标准；s6.待测样品判定：采用步骤s3同样的仪器条件对待测样品进行检测，获得指纹图谱，参照步骤s5的评价标准进行判定。实施例2一种基于特征香气物质gc-ims指纹图谱的葡萄砧木评价方法，葡萄品种为瑞都红玉葡萄，包括以下步骤，s1.标准样品处理：s11.标准样品选择：样品来源于同一栽培区域，按照相同栽培管理措施种植的不同砧木嫁接瑞都红玉葡萄，选择品种11r、5bb、3309m、s04和hy的砧木；另选择2个样品的该品种自根苗；s12.取样：将选择的样品进行混合取样，每个处理中，5株为1个重复，可设置2-6个重复；每个重复试验中，每株树随机取样1-3穗葡萄果穗，单穗葡萄上、中、下部位分别取样1果粒，混合样品为一个重复的样品。然后用刀片切开，取出葡萄籽，果肉粉碎成粉末，得到标准样品，装入进样瓶，封口膜封口，-80℃冷冻存样备用；s2.待测样品处理：将待检测的砧木按照步骤s1的方法进行处理得到待测样品；s3.气相-离子迁移谱分析：通过气相色谱-离子迁移谱联用仪对标准样品进行挥发性物质的检测，得到指纹谱图；用气相-离子迁移谱对样品进行分析，色谱柱类型fs-se-54-cb-1，柱温40℃，载气/漂移气n2，见ims温度45℃；顶空进样单元条件：进样体积500ul，孵育时间15min，孵育温度40℃，进样针温度85℃，孵化转速500rpm；漂移气流速度150ml/min，气相载气流速2-20ml/min。表1气相色谱条件timee1(漂移气流速)e2(气相载气流速)r00:00,000150ml/min2ml/minrec02:00,000150ml/min2ml/min-10:00,000150ml/min20ml/min-20:00,000150ml/min100ml/min-25:00,000150ml/min150ml/minstop25:00,000150ml/min150ml/min-s4.数据处理与分析：采用比较法提取步骤2获得的指纹信息图谱上的特征值区域，所述比较法为根据特征物质在指纹信息谱图中颜色的差异变化和峰面积；选择不同砧木和自根苗葡萄果实样品挥发物质谱图物质点颜色变化深或峰面积差异大的谱图特征区域；对全部特征区域的物质出峰数据进行正交变换和降维，实现对n×m个葡萄果实样品进行快速聚类。s5.选取及评价方法构建：根据物质峰强度信号差异和物质对应的保留时间和迁移时间，从特征区域中选取能显著区分不同砧木及自根葡萄的若干类种特征香气物质对该葡萄品种砧木进行评价判别。图1中，每一行代表一个葡萄样品中选取的全部信号峰；每一列代表同一挥发性有机物在不同砧木嫁接的葡萄样品中的信号峰；从图中可以看出每种样品的完整挥发物信息以及样品之间挥发性有机物的差异从图1可以看出，整个指纹谱图中，从上到下依次是110r、5bb、s04、3309m和hy葡萄样品，其中：红色框中的物质分别是每个葡萄样品相对于其他样品含量较高的物质；可以比较明显的看出：在110r样品中含量较高而在其他几个样品中含量较低的物质为2,3-pentanedione(2，3-乙酰基丙酮)、gamma-butyrolactone(γ-丁内酯)、n-nonanal(壬醛)、furfurol(糠醛)、3-pentanone(3-戊酮)等物质。在s04样品中含量较高而在其他样品中含量较低的物质为1-hexanol(1-己醇)、methylpropanal(异丁醛)、ethylacetate(乙酸乙酯)和3-methylbutanal(3-甲基丁醛)等物质。在5bb样品中含量较高而在其他样品中含量较低的物质为acetone丙酮等物质。“13”～“14”在3309m样品中含量较高而在其他样品中含量较低的物质。在hy样品中含量较高而在其他样品中含量较低的物质为pentanal(戊醛)等物质。具体的评价标准如下：(1)筛选出第一类物质，pentanal及其聚合体的气相保留时间为3.760min，离子漂移时间为1.1935ms，反应青草和香蕉的香气，用于主成分分析中区分砧木嫁接瑞都红玉葡萄和自根苗葡萄，当峰面积高于350au，为自根苗瑞都红玉，反之为砧木嫁接瑞都红玉葡萄；(2)筛选出第二类物质，包括3种物质包括linalool,2-propanol,3-methylbutanal，气相保留时间分别为：16.575min、2.191min、3.302min，离子漂移时间分别为：1.217ms、1.169ms、1.405ms，判别临界峰面积1000au，具备玫瑰、铃兰、苹果等花香和果香特征，用于主成分分析中判别砧木嫁接的瑞都红玉葡萄果实香气品质的典型性和浓郁度；明显含有该第二类物质的具备本品种典型香气，不含有的不具备典型香气；该第二类物质出峰响应强度高反应典型香气的浓郁度高，反之则说明浓郁度低；可以依据第二类物质直接判别砧木是否为合适的选择；(3)筛选出第三类物质，包括11种物质，定性参数(物质编号、气相保留时间和离子漂移时间)如下表2，含有该物质指的是期检测出峰面积超过以下表格中各物质对应的临界峰面积。表2定性参数列表物质编号或名称气相保留时间/min离子漂移时间/ms判别临界峰面积/au1号峰4.9371.0971003号峰4.5991.360507号峰3.6431.26310010号峰3.5231.05950011号峰3.5101.22910016号峰2.7951.1525003-pentanone3.8381.108300n-nonanal16.6401.477500furfurol6.0711.0831502,3-pentanedione3.8121.224100gamma-butyrolactone8.6711.080100采用以上11种物质用于主成分分析中判别砧木嫁接的瑞都红玉葡萄果实香气品质的丰满度或复杂性，含有该类11中物质中6-11种说明该样本香气丰满度高、复杂性强，说明用于嫁接的砧木具有优越性；反之少于6种说明该样品香气结构单一，丰满度低，说明用于嫁接的砧木不具有优越性。依据以上选取的三类物质，通过gc-ims对瑞都红玉葡萄样品快速分析，即可基于第一类特征香气物质对自根苗和嫁接苗葡萄进行区分，基于第二类物质对砧木的合适性性进行评价，基于第三类物质对砧木的优越性进一步判别筛选，达到快速筛选砧木的目的。s6.待测样品判定：采用步骤s3同样的仪器条件对待测样品进行检测，获得指纹图谱，参照步骤s5的评价标准进行判定。上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。当前第1页12