一种鸡蛋免疫荧光检测试纸条及应用和检测方法与流程

本发明属于免疫荧光检测技术领域，具体涉及一种鸡蛋免疫荧光检测试纸条及应用和检测方法。

背景技术：

随着食品行业的发展，过敏性疾病已成为全球性的问题。近年来，食用鸡蛋引起的过敏疾病发生率呈上升趋势。据国外流行病学统计，在食物过敏儿童中，约35％的儿童对鸡蛋过敏，其中1岁前的幼儿更为常见。目前国内外对鸡蛋食物过敏疾病尚没有有效的治疗方法，对鸡蛋抗原严重过敏的患者避免食入含有鸡蛋成分的食物是目前最有效的预防方法之一。近年来，美国及欧盟国家食品标签法中规定必须把鸡蛋作为主要过敏原成分加以标示，并开始对部分进口食品进行鸡蛋过敏原检测，而我国食品出口企业常因食品过敏原标注不正确而被美国fda通报且遭遇退货。随着人们对食品安全的日益重视，我国也势必建立一套过敏原标识制度，这就需要有相应的检测方法为制度的落实提供保障。因此，开发鸡蛋的快速检测方法十分必要。蛋类过敏原在加工过程中稳定性强，有文献证实，蛋类过敏原分别经糖基化处理、6mol/l尿素处理、95℃加热处理后仍不能完全脱敏。

进口鸡蛋过敏原酶联免疫试剂盒多将其作为食品中鸡蛋过敏原的检测目标。但进口试剂盒价格昂贵，因此，研制出快速、有效、低成本的过敏原检测试剂盒有重要意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鸡蛋免疫荧光检测试纸条及应用和检测方法，可快速定性和定量检测食品中的鸡蛋过敏原成分，操作简便、准确度高、灵敏度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种鸡蛋免疫荧光检测试纸条，所述试纸条上包括由左到右首尾相连且依次固定在pvc底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述结合垫上包被有荧光胶乳微球标记的混合抗体；所述混合抗体包括：抗卵白蛋白抗体、抗卵类黏蛋白抗体、抗卵转铁蛋白抗体和抗鸡蛋总抗体；

所述硝酸纤维素膜上包括平行的4条检测线和1条质控线；所述检测线上分别包被抗卵白蛋白抗体、抗卵类黏蛋白抗体、抗卵转铁蛋白抗体和抗鸡蛋总抗体；所述质控线上包被兔抗鼠igg抗体；

所述检测线上的包被抗体与所述荧光胶乳微球标记的混合抗体为配对抗体。

优选的，所述荧光胶乳微球的粒径为50～500nm。

优选的，所述包被有荧光胶乳微球标记的混合抗体的结合垫的制备方法，包括：a.将荧光标记的链霉亲和素和胶乳微球吸附结合，得到荧光胶乳微球；

b.将生物素与所述混合抗体结合，得到生物素化混合抗体；

c.将所述荧光胶乳微球和所述生物素化混合抗体混合，得荧光胶乳微球标记的混合抗体；

d.将所述荧光胶乳微球标记的混合抗体喷涂在结合垫上；

步骤a和b之间不具有时间上的先后关系。

优选的，步骤a所述荧光标记包括异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明或荧光素cy5。

优选的，步骤d所述喷涂时，将所述荧光胶乳微球标记的混合抗体按照2～10μl/cm的用量喷涂在结合垫上。

优选的，所述混合抗体中抗卵白蛋白抗体、抗卵类黏蛋白抗体、抗卵转铁蛋白抗体和抗鸡蛋总抗体的质量比为1：1：1：1。

优选的，4条所述检测线上包被抗卵白蛋白抗体、抗卵类黏蛋白抗体、抗卵转铁蛋白抗体和抗鸡蛋总抗体的包被浓度均为0.5～5.0μl/cm；

所述质控线上包被兔抗鼠igg抗体的包被浓度为0.5～5μl/cm。

本发明还提供了上述免疫荧光检测试纸条在检测食品中鸡蛋过敏原成分中的应用。

优选的，所述花生过敏原成分包括卵白蛋白、卵类黏蛋白、卵转铁蛋白和总鸡蛋蛋白。

本发明还提供了一种检测食品中鸡蛋过敏原成分的方法，包括以下步骤：滴加100～120μl的食品溶液于上述免疫荧光检测试纸条的样品垫上，15min后读取所述检测试纸条的荧光信号，根据标准曲线测定花生过敏原的成分和含量；

所述标准曲线为r²＝0.9997；

其中x为过敏原浓度，单位iu/ml，y为荧光信号比值。

本发明提供了一种鸡蛋免疫荧光检测试纸条，其结构如图1所示，包括由左到右首尾相连且依次固定在pvc底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述结合垫上包被有荧光胶乳微球标记的混合抗体；所述混合抗体包括：抗卵白蛋白抗体、抗卵类黏蛋白抗体、抗卵转铁蛋白抗体和抗鸡蛋总抗体；在硝酸纤维素膜(nc膜)上包被抗卵白蛋白抗体(t1线)、抗卵类黏蛋白抗体(t2线)、抗卵转铁蛋白抗体(t3线)、抗鸡蛋总抗体(t4线)和兔抗鼠igg抗体(c线)，其中t1线、t2线、t3线、t4线为检测线，c线为质控线。本发明所述混合抗体和nc膜上包被的抗体分别配对，且混合抗体类似于二抗，nc膜上包被抗体类似于一抗。本发明所述试纸条能够快速定量检测鸡蛋过敏原的种类和含量，并且操作简便、准确性高，回收率应在90％～110％、灵敏度高(≤0.84ng/ml)。

附图说明

图1为本发明所述免疫荧光检测试纸条的结构图；

图2为荧光免疫层析法测定标准曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种鸡蛋免疫荧光检测试纸条，其结构如图1所示，所述试纸条上包括由左到右首尾相连且依次固定在pvc底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述结合垫上包被有荧光胶乳微球标记的混合抗体；所述混合抗体包括：抗卵白蛋白抗体、抗卵类黏蛋白抗体、抗卵转铁蛋白抗体和抗鸡蛋总抗体；

所述硝酸纤维素膜上包括平行的4条检测线和1条质控线；所述检测线上分别包被抗抗卵白蛋白抗体、抗卵类黏蛋白抗体、抗卵转铁蛋白抗体和抗鸡蛋总抗体；所述质控线上包被兔抗鼠igg抗体；

所述检测线上的包被抗体与所述荧光胶乳微球标记的混合抗体为配对抗体。

本发明所述结合垫上包被有荧光胶乳微球标记的混合抗体，所述包被有荧光胶乳微球标记的混合抗体的结合垫的制备方法，优选包括：a.将荧光标记的链霉亲和素和胶乳微球吸附结合，得到荧光胶乳微球；

b.将生物素与所述混合抗体结合，得到生物素化混合抗体；

c.将所述荧光胶乳微球和所述生物素化混合抗体混合，得荧光胶乳微球标记的混合抗体；

d.将所述荧光胶乳微球标记的混合抗体喷涂在结合垫上；步骤a和b之间不具有时间上的先后关系。

本发明步骤a中所述荧光标记的链霉亲和素和胶乳微球的质量比优选为1:40；步骤b中所述生物素和混合抗体的体积比优选为1:4；步骤c中荧光胶乳微球和生物素化混合抗体的体积比优选为10:1。本发明所述荧光胶乳微球的粒径优选为50～500nm。本发明步骤a所述荧光标记优选包括异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明或荧光素cy5。本发明对所述混合抗体中抗卵白蛋白抗体、抗卵类黏蛋白抗体、抗卵转铁蛋白抗体和抗鸡蛋总抗体的质量比优选为1：1：1：1。本发明对所述抗卵白蛋白抗体、抗卵类黏蛋白抗体、抗卵转铁蛋白抗体和抗鸡蛋总抗体的来源并没有特殊限定，优选为本领域的常规市售抗体。本发明步骤d中所述结合垫上所述荧光胶乳微球标记的混合抗体的喷涂量优选为2～10μl/cm。在本发明中，所述荧光胶乳微球标记的混合抗体均为二抗。

本发明所述硝酸纤维素膜(nc膜)上包括平行的4条检测线和1条质控线；所述检测线上分别包被抗卵白蛋白抗体(t1线)、抗卵类黏蛋白抗体(t2线)、抗卵转铁蛋白抗体(t3线)和抗鸡蛋总抗体(t4线)；所述质控线上包被兔抗鼠igg抗体(c线)。本发明对所述nc膜的制备方法并没有特殊限定，优选的包括：用包被缓冲液分别稀释抗卵白蛋白抗体、抗卵类黏蛋白抗体、抗卵转铁蛋白抗体、抗鸡蛋总抗体和兔抗鼠igg抗体，并将稀释后的五种抗体分别平行地划在硝酸纤维素膜上，待抗体渗入硝酸纤维素膜后分别形成包被抗卵白蛋白抗体、抗卵类黏蛋白抗体、抗卵转铁蛋白抗体和抗鸡蛋总抗体的检测线以及包被兔抗鼠igg抗体的质控线。本发明4条所述检测线上包被抗卵白蛋白抗体、抗卵类黏蛋白抗体、抗卵转铁蛋白抗体和抗鸡蛋总抗体的包被浓度均为0.5～5.0μl/cm；所述质控线上包被兔抗鼠igg抗体的包被浓度为0.5～5μl/cm。本发明在进行划线时，针对检测限和质控线的操作不同，在进行检测限的划线时，优选的将抗卵白蛋白抗体、抗卵类黏蛋白抗体、抗卵转铁蛋白抗体和抗鸡蛋总抗体分别依次按3mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50m/20min，在干燥箱内20℃鼓风干燥12h；在质控线划线时，优选将兔抗鼠igg抗体按8mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50m/20min，在硝酸纤维素膜上划线，该线与检测线的线平行，放入干燥箱内20℃鼓风干燥12h。

本发明优选依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装粘贴在pvc底板上，按照要求(4mm)用切条机将其切割成如图1所示的试纸条。本发明所示试纸条可以批量生产，适用于临床快速诊断和现场快速检测，易于保存。

本发明提供了上述免疫荧光检测试纸条在检测食品中鸡蛋过敏原成分中的应用。

本发明所述鸡蛋过敏原成分优选包括卵白蛋白、卵类黏蛋白、卵转铁蛋白和鸡蛋总蛋白，其中鸡蛋总蛋白中不涉及卵白蛋白、卵类黏蛋白和卵转铁蛋白。

本发明还提供了一种检测食品中鸡蛋过敏原成分的方法，包括以下步骤：滴加100～120μl的食品溶液于上述免疫荧光检测试纸条的样品垫上，15min后读取所述检测试纸条的荧光信号，根据标准曲线测定花生过敏原的成分和含量；所述标准曲线为r²＝0.9997；

其中x为过敏原浓度，单位iu/ml，y为荧光信号比值。

本发明将所述待测样本滴加与样品垫上后，样品经过结合垫上的混合抗体进行反应结合，再依次经过检测区的抗卵白蛋白抗体、抗卵类黏蛋白抗体、抗卵转铁蛋白抗体和抗鸡蛋总抗体进行反应，最后达到质控区反应结束。

下面结合实施例对本发明提供的一种鸡蛋免疫荧光检测试纸条及应用和检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明中所用试剂，如非特殊说明，均为常规购买产品，其中：

抗卵白蛋白抗体：indoorbiotechnologies(货号：ma-3g4，ma-7d8)；

抗卵类黏蛋白抗体：indoorbiotechnologies(货号：ma-5g11，ma-2b2)；

抗卵转铁蛋白抗体：cusab(货号：csb-pa00390f0rb)；

抗鸡蛋总抗体：杭州忠欧生物医药科技园有限公司(货号：ce-gal-01)。

实施例1

1、结合垫的制备

1)荧光胶乳微球的制备

荧光胶乳微球的制备：用吸附缓冲液(50mm、ph5.8的柠檬酸盐缓冲液)稀释粒径为400nm胶乳微球至终浓度30mg/ml，体积为6ml，制得胶乳微球悬浮液；添加适当的红色荧光素罗丹明标记连霉亲和素在吸附缓冲液中，终体积为6ml；将上述胶乳微球悬浮液加入到上述含有红色荧光素罗丹明标记霉亲和素的吸附缓冲液中，制得混合液；将所得混合液在室温下温浴1～2h，并不断搅拌，然后离心，收集沉淀，沉淀用储存缓冲液(含有0.06％bsa的吸附缓冲液)溶解，放置4℃保存，备用。

2)生物素化抗鸡蛋混合抗体的制备

将抗卵白蛋白抗体、抗卵类黏蛋白抗体、抗卵转铁蛋白抗体和抗鸡蛋总抗体按照1:1:1:1的质量比混合后(混合抗体m1)，用0.2mph4.7的醋酸钠缓冲液稀释至3ml，交互用0.2mph4.7的醋酸钠缓冲液对鸡蛋抗体m1充分透析；用1mldmso溶解1ml的nhsb，得到nhsb溶液；向上述3ml鸡蛋混合抗体m1加入25μlnhsb，搅拌2～4h，继续室温搅拌10min，然后用20mm、ph3.9的pbs缓冲液透析，即得生物素化混合抗体m1。

3)荧光胶乳微球标记鸡蛋抗体的制备

将步骤1)制得的荧光胶乳微球和步骤2)制得的生物素化混合抗体按照10:1的体积比混合在一起，反应30min后离心，沉淀用储存缓冲液溶解，恢复至原体积。

4)将荧光胶乳微球标记鸡蛋混合抗体按照2～10μl/cm的用量喷涂在结合垫上。

2、硝酸纤维素膜的制备

1)膜处理取一张硝酸纤维素膜，做好标记后放在ph膜处理液(tbs)中浸泡5～10min；

2)组装点样装置，将浸泡过的硝酸纤维素膜放在平铺的垫子上，放上抗体点样板子，上面要留出贴标记纸的地方。

3)鸡蛋抗体检测区的制备：将抗卵白蛋白抗体、抗卵类黏蛋白抗体、抗卵转铁蛋白抗体和抗鸡蛋总抗体分别依次按3mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50m/20min，在干燥箱内20℃鼓风干燥12h。

4)质控区的制备：将兔抗鼠igg抗体按8mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50m/20min，在硝酸纤维素膜上划线，该线与检测区的线平行，放入干燥箱内20℃鼓风干燥12h。

5)用上述封闭液将的硝酸纤维素膜于37℃封闭60min，取出后置37℃下烘干处理2h，封袋备用。

6)试纸条组装

依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装粘贴在pvc底板上，按照要求用切条机将其切割成适当宽度(4mm)的试纸条(图1所示)。

3、待检抗原检测

将被检测样本滴加100～120μl于样品垫上，后经过结合垫上的抗鸡蛋混合抗体进行反应结合，再依次经过检测区的抗卵白蛋白抗体、抗卵类黏蛋白抗体、抗卵转铁蛋白抗体、抗鸡蛋总抗体进行反应，最后达到质控区反应结束，后将试纸条放于专门的荧光信号读取仪器中，读取荧光信号的大小，进行定量测定。

剂量-反应曲线的线性：测定试剂盒中校准品配制的校准液系列，浓度分别为100.00、50.00、17.50、3.50、0.35iu/ml，用双对数或其它适当的数学模式进行拟合，模型拟合结果应符合分析内精密度(cv％)应≤10.0％；分析间精度(cv％)应≤15.0％。

剂量-反应曲线线性分析结果显示，0.35～100iu/ml范同内，各浓度与测试值呈平滑递增曲线，测量下限(cv<15％测试系统所能检测到的最低浓度)为0.35iu/ml，曲线方程如图2所示：

r²＝0.9997；

其中x为过敏原浓度，单位iu/ml，y为荧光信号比值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。