基于脊椎骨稳定同位素的大洋性鲨鱼生活史研究方法

本发明涉及大洋性鲨鱼素材的制备及研究方法，特别涉及一种基于脊椎骨稳定同位素素材的制备方法及生活史研究方法。

背景技术：

鲨鱼属脊索动物门(chordt)软骨鱼纲(chondrichthyes)板鳃亚纲(elasmobranchii)，在地球上生存已超过四亿年，是现存最古老的物种之一。鲨鱼分为9目34科，全球目前共发现503种，其中我国148种，广泛分布于热带、亚热带海域。鲨鱼作为顶级捕食者，处于食物链顶端或近顶端，通过下行效应对海洋中其他物种的生存、种群变动及海洋生态系统都产生着巨大影响。有别于近海大型鲨鱼，大洋性鲨鱼由于生长缓慢、成熟期晚和繁殖力低等生活史特征,极易被过度捕捞，80％大洋性种类被icun评估为近危(nearthreaten)状态，且身处营养相对贫瘠的大洋，大洋性鲨鱼更多是扮演“机会主义捕食者”的角色，食性泛化(generalist)使得大洋性鲨鱼被认为是鲨鱼“顶级捕食者集团”中相当特殊的一类，目前对其生态功能的关键性和冗余性仍存在争议。因此近年来,国外对鲨鱼资源保护生物学研究逐步兴起的呼声愈发强烈。然而目前国内对鲨鱼基础生物学研究仍较少,且主要集中在近海鲨鱼的年龄、生长及生殖生物学方面，对摄食及洄游行为等仍停留在以描述性研究为主,而此类生活史信息对于掌握大洋性鲨鱼种群结构和数量变动规律至关重要,且可为资源管理和保护提供科学支撑。

稳定同位素技术是近年来生态学领域兴起的一项技术，在海洋生态系统中已得到较为广泛的应用，并逐渐成为海洋食物网研究的一种有力手段。稳定同位素因环境中及个体分馏机制的差异，生物体内稳定同位素值可用于示踪物质在生态系统中的流动。通过脊椎骨轮纹的连续性微取样，其携带的碳、氮和氧稳定同位素比值可用来反映鱼类一定时期内的摄食信息。碳和氧稳定同位素比值[δ¹³c(¹³c/¹²c)和δ¹⁸o(¹⁸o/¹⁶o)]主要用于判断食物来源和栖息环境,氮稳定同位素比值[δ¹⁵n(¹⁵n/¹⁴n)]用于估算营养级。

鲨鱼的脊椎骨主要起支撑鱼体的作用,由钙化软骨组成,主要成分为磷酸羟基磷灰石(ca5(po4)3oh)。随着鱼类生长,脊椎骨在垂直向周期性增长一条不透明轮纹和一条半透明轮纹,刻录了精确的时间序列，因此可用于进行鱼类的年龄鉴定。通过微取样技术,这些沉淀于脊椎骨轮纹上的时间序列信息可结合稳定同位素进一步解释个体的摄食及洄游动态，其通过分析各生长周期间稳定同位素值的变化规律,以追溯鲨鱼生活史变化过程。

技术实现要素：

本发明提供了基于脊椎骨稳定同位素的大洋性鲨鱼素材制备及生活史研究方法，其目的在于，通过微取样技术，可按年轮位置对大洋性鲨鱼脊椎骨薄片进行连续性微取样，去除无机碳后以进行稳定同位素测定，通过脊椎骨(轮纹)上的碳、氮稳定同位素比值来反映鲨鱼生活史周期内的摄食信息。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

基于脊椎骨稳定同位素的大洋性鲨鱼生活史研究方法，先制备大洋性鲨鱼素材，然后采用如下步骤：

(1)食性转换，稳定同位素信息是捕食者相对较长时期积累的结果，利用稳定同位素信息基于贝叶斯统计方法建立食物混合模型，探索生活史过程中食性的转变；

(2)营养级评估，利用¹⁵n判别值δ¹⁵n来估算营养级：

tl＝λ+(δ¹⁵nconsumer-δ¹⁵nbase)/δ¹⁵n

式中：λ是选定的基线生物的营养级，δ¹⁵nconsumer是鲨鱼的δ¹⁵n值，δ¹⁵nbase食物网中基线生物δ¹⁵n值，δ¹⁵n为判别值；

(3)营养生态位分化，在r语言程序中使用贝叶斯标准椭圆度量营养生态位，以指物种在生物群落或生态系统中的地位和角色；

(4)栖息地利用，脊椎骨轮纹上的稳定同位素比值多为年周期性均值,反映了鲨鱼更长期的摄食信息及不同时期栖息地环境特征,可用以构建鱼类生活史中栖息地变化模式。

优选地，所述制备大洋性鲨鱼素材，选用三龄及以上鲨鱼的个体，包括如下步骤：

(1)提取：自第一背鳍处取约3-5节脊椎骨，冷冻保存；

(2)清洗：切除脊椎骨上肌肉及结缔组织，并用蒸馏水冲洗并烘干；

(3)研磨：在金相研磨机上前后使用120grits、600grits及1200grits防水耐磨砂纸进行研磨，将两面分别打磨至接近中心位置，约成1-3mm厚的脊椎骨薄片，并随时在透射光解剖镜下观察其研磨程度，直至轮纹较为清晰，将样品放至样品盒中待微取样；

(4)微取样：使用装有5mm钻头的微取样仪，在目镜下，从出生纹开始在各不透明轮纹之间打点并连续性微取样，为保证样本量充足，可分别在脊椎骨薄片四边等位置微取样，每个取样点粉末重量应超过0.3mg，将各取样点粉末置于2ml离心管内；

(5)去除无机碳：在离心管中滴加1.5ml乙二胺四乙酸浸泡一周，浸泡完毕后使用超纯水冲洗粉末五遍以去除粉末中残余的乙二胺四乙酸，其中第一遍、第三遍及第五遍使用离心机离心，洗净后置于60℃烘箱内烘干；

(6)包埋：取0.3-1.0mg脊椎骨粉末置于锡舟内，包埋完成后置于样品盒内待测定稳定同位素。

优选地，所述三龄及以上鲨鱼采用脊椎骨直径大于10mm的鲨鱼，个体过小的脊椎骨不易研磨，且所携带生活史信息时间短，可用肌肉等其他组织代替。

优选地，所述步骤(5)中，所述第一遍、第三遍及第五遍使用的离心机功率为4000转，离心时间为3min本发明的有益效果是：

本发明方法是对个体较大(脊椎骨直径>10mm)大洋性鲨鱼脊椎骨稳定同位素用素材进行制备并进行生活史研究，根据实验发现通过微取样技术可实现脊椎骨携带的年龄信息与摄食生态研究的有机结合，通过对各年轮间打点微取样，其稳定同位素携带信息可反映鲨鱼个体生活史中摄食、洄游等变化情况，有效解决了脊椎骨较难取样的问题，进一步解释大洋性鲨鱼生态角色对食物网影响的纵向深度，并对大洋性鲨鱼生态地位的关键性及冗余性作出合理解释,为大洋性鲨鱼摄食生态学研究提供有力支撑。

附图说明

图1为本发明直径>10mm的长鳍真鲨脊椎骨形态示意图；

图2为本发明直径>10mm的长鳍真鲨脊椎骨形态纵切片示意图；

图3为本发明直径>10mm的长鳍真鲨脊椎骨切片微取样图

图4为长鳍真鲨脊椎骨连续性微取样¹⁴n值变化

图5为长鳍真鲨脊椎骨连续性微取样¹³c值变化

图6为长鳍真鲨各生长阶段营养生态位椭圆重叠图

图中各符号代表：1、椎体2、椎体中心3、椎体中心面4、生长轮纹。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将结合具体附图对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍(以长鳍真鲨为例)，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

本发明公开了基于脊椎骨稳定同位素的大洋性鲨鱼素材制备及生活史研究方法，主要针对三龄及以上鲨鱼(一般脊椎骨直径>10mm)的个体：

参见图1、图2所示，较大个体(脊椎骨直径>10mm)素材制备方法包括如下步骤：

(1)提取：自第一背鳍处取约3-5节脊椎骨，冷冻保存；

(2)清洗：切除脊椎骨上肌肉及结缔组织，并用蒸馏水冲洗并烘干；

(3)研磨：在金相研磨机上前后使用120grits、600grits及1200grits防水耐磨砂纸进行研磨，将两面分别打磨至接近中心位置，约成1-3mm厚的脊椎骨薄片，并随时在透射光解剖镜下观察其研磨程度，直至轮纹较为清晰，将样品放至样品盒中待微取样；

(4)微取样：如图3所示，使用装有5mm钻头的微取样仪，在目镜下，从出生纹开始在各不透明轮纹之间打点并连续性微取样，为保证样本量充足，可分别在脊椎骨薄片四边等位置微取样，每个取样点粉末重量应超过0.3mg，将取好的粉末置于2ml离心管内；

(5)去除无机碳：在各样本中滴加1.5ml乙二胺四乙酸(edta)浸泡一周，浸泡完毕后使用超纯水冲洗粉末五遍以去除粉末中残余的乙二胺四乙酸，其中第一遍、第三遍及第五遍使用离心机离心，洗净后置于60℃烘箱内烘干；

(6)包埋：取0.3-1.0mg脊椎骨粉末置于锡舟内，包埋完成后置于样品盒内待测定稳定同位素。

基于脊椎骨稳定同位素的大洋性鲨鱼生活史研究方法，包括如下步骤：

(1)食性转换，稳定同位素信息是捕食者相对较长时期积累的结果，利用稳定同位素信息基于贝叶斯统计方法建立食物混合模型，探索生活史过程中食性的转变；如图4所示，为4尾长鳍真鲨生活史过程中¹⁵n变化，其生活史中氮值变化平稳，证明长鳍真鲨食性泛化，无显著食性转变过程

(2)营养级评估，利用¹⁵n判别值δ¹⁵n来估算营养级：

tl＝λ+(δ¹⁵nconsumer-δ¹⁵nbase)/δ¹⁵n

式中：λ是选定的基线生物的营养级，δ¹⁵nconsumer是鲨鱼的δ¹⁵n值，δ¹⁵nbase食物网中基线生物δ¹⁵n值，δ¹⁵n为判别值；

(3)营养生态位分化，在r语言程序中使用贝叶斯标准椭圆(standardellipsecorrectedarea,seac)度量营养生态位，以指物种在生物群落或生态系统中的地位和角色；如图6所示，为长鳍真鲨四种成长阶段营养生态位椭圆，各阶段皆有较为宽泛的生态位宽度，且有较大重叠面积，说明长鳍真鲨种内竞争较为激烈

(4)栖息地利用，脊椎骨轮纹上的稳定同位素比值多为年周期性均值,反映了鲨鱼更长期的摄食信息及不同时期栖息地环境特征,可用以构建鱼类生活史中栖息地变化模式。如图5所示，长鳍真鲨随年龄增大¹³c值略有变小，生活史中整体变化幅度较小，佐证长鳍真鲨终身大洋性，并在性成熟后存在垂直移动或靠近沿岸或岛屿的行为

本发明通过微取样技术，可按年轮位置对大洋性鲨鱼脊椎骨薄片进行连续性微取样，去除无机碳后以进行稳定同位素测定，通过脊椎骨(轮纹)上的碳、氮稳定同位素比值来反映鲨鱼生活史周期内的摄食信息。碳稳定同位素比值[δ¹³c(¹³c/¹²c)]主要用于判断食物来源和栖息环境,氮稳定同位素比值[δ¹⁵n(¹⁵n/¹⁴n)]用于估算营养级。本发明通过上述方法探索大洋性鲨鱼生活史过程中食性、栖息地转换过程以及种内生态位分化情况，进一步解释大洋性鲨鱼生态角色对食物网影响的纵向深度，并对大洋性鲨鱼生态地位的关键性及冗余性作出合理解释。有效的将脊椎骨所携带的年龄信息与摄食生态学研究有机结合，为物种保护提供有力支撑。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。