一种立他司特或其制剂有关物质检测方法与流程

1.本发明属于医药领域，涉及立他司特或其制剂有关物质检测方法。


背景技术：

2.立他司特化学式为c
29h24c12
n2o7s，cas号1025967-78-5，结构式如下：
[0003][0004]
立他司特(lifitegrast)由爱尔兰夏尔开发公司(shire dev llc)研发，是新型的小分子整合素(integrin)抑制药，能拮抗淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)，阻断与其同源配体细胞间黏附分子-1(icam-1)的相互作用，干扰引起干眼病的角膜与结膜组织的icam-1过度表达，是首个治疗干眼症症状和体征的药物。立他司特合成及储存过程中中引入多个杂质，需开发一种方法，对其产生的杂质进行定性定量分析，严格控制立他司特及其制剂的质量品质，保证产品质量符合要求。
[0005]
现有技术cn111060629a公开了一种利非司特有关物质的检测方法，以0.01～1.0％三氟乙酸水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，进行梯度洗脱，但该方法仅能检测出杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e和/或杂质f六个杂质，该方法仅能检测出立他司特样品中的部分杂质，存在杂质检测不全的现象。因此寻求一种能够有效分离且尽可能多的检出立他司特或其制剂中有关物质的高效液相色谱法，对于立他司特或其制剂的精确质量控制具有十分重要的意义。


技术实现要素：

[0006]
本发明提供一种方法简单、灵敏度高、专属性强，可以将立他司特及其制剂中有关物质完全分离的方法，具体如下：
[0007]
一种立他司特或其制剂有关物质检测方法，其特征在于采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸、磷酸水溶液、有机溶剂，或上述混合液为流动相，梯度洗脱；柱温20-60℃；检测波长200-240nm；流速0.5-2.0ml/min。
[0008]
进一步地，所述流动相中，磷酸水溶液为流动相a，磷酸与有机溶剂混合液为流动相b。
[0009]
一种立他司特或其制剂有关物质检测方法，其特征在于包含以下步骤：
[0010]
1)供试品溶液：取立他司特原料药或制剂加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含立他司特1mg的溶液；
[0011]
2)对照溶液：取供试品溶液加溶剂稀释制成每1ml中约含立他司特1μg的溶液；
[0012]
3)检测方法：采用高效液相色谱法，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；磷酸水溶液
为流动相a，磷酸与有机溶剂混合液为流动相b，梯度洗脱；柱温30-50℃；检测波长220nm；流速0.8-1.5ml/min。
[0013]
进一步地，所述磷酸水溶液中磷酸浓度为0.01-2％，优选0.02-1％；所述磷酸与有机溶剂混合液中磷酸浓度为0.01-2％，优选0.02-1％；所述流动相中有机溶剂选自甲醇或乙腈。
[0014]
进一步地，所述步骤1)及2)中溶剂为乙腈，浓度为20％-40％。
[0015]
进一步地，所述检测方法梯度洗脱条件为：
[0016][0017]
所述有关物质含有以下物质：2-(叔丁氧羰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-羧酸、(s)-2-氨基-3-甲砜基-苯丙酸苄酯盐酸盐、苯并呋喃-6-羧酸、(s)-2-(5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺基)-3-(3-(甲磺酰基)苯基)丙酸苄酯、(s)-2-(2-(苯并呋喃-6-羰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺基)-3-(3-(甲基磺酰基)苯基)丙酸苄酯、(s)-2-(2-(苯并呋喃-6-羰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺基)-3-(3-(甲基磺酰基)苯基)丙酸。
[0018]
进一步地，所述有关物质还含有(s)-2-(5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺基)-3-(3-(甲磺酰基)苯基)丙酸、(s)-2-(2-乙酰基-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺基)-3-(3-(甲磺酰基)苯基)丙酸、(s)-2-(苯并呋喃-6-甲酰胺基)-3-(3-(甲磺酰基)苯基)丙酸、2-(苯并呋喃-6-羰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-羧酸、(s)-2-(2-(苯并呋喃-6-羰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺基)-3-(3-(甲基磺酰基)苯基)丙酸甲酯、(s-2-(2-(苯并呋喃-6-羰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺基)-3-(3(甲基磺酰基)苯基)丙酸乙酯、(s)-2-(5,7-二氯-2-叔丁氧羰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺基)-3-(3-(甲基磺酰基)苯基)丙酸苄酯、(s)-2-(苯并呋喃-6-甲酰胺基)-3-(3-(甲磺酰基)苯基)丙酸苄酯。
[0019]
所述有关物质具体信息如下：
[0020]
[0021][0022]
本技术发明人经过大量的实验研究，最终建立了可以有效检测立他司特及其制剂有关物质的高效液相色谱方法。采用本发明之前所能获得的现有技术，对立他司特及其制剂有关物质的分离效果有限，对于同样的样品最多可以分离出6个色谱峰。但是本发明采用的分析方法对于同样的样品可以分离出14个以上色谱峰，且分离度更好。本发明采用特定的流动相和梯度洗脱程序，能实现立他司特及其制剂中至少14个有关物质的检测分离，主峰分离度高，杂质化合物的分离度高，对立他司特原料及制剂有关物质的检测、控制更为全面，检测结果更加准确、可靠。
[0023]
说明书附图
[0024]
图1：本发明实验例3中高效液相色谱图；
[0025]
图2：本发明实验例5中高效液相色谱图；
[0026]
图3：本发明实施例1中高效液相色谱图；
[0027]
图4：本发明实施例3中高效液相色谱图；
[0028]
图5：本发明实施例4中高效液相色谱图。
具体实施例
[0029]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0030]
溶液配制：
[0031]
1)溶剂：20-40％乙腈；
[0032]
2)杂质储备液：精密称取杂质jp-y-4/5/6/8/9/10/11/13/14各2mg于10ml量瓶中，加乙腈稀释溶解定容；精密称取杂质jp-y-12为2mg于20ml量瓶中，加溶剂1)稀释溶解并定容；精密称取杂质jp-y-7/16、sm1/2各20mg于20ml量瓶中，加溶剂1)稀释溶解并定容，再量取2ml分别置于10ml量瓶，稀释溶解定容；
[0033]
3)分离度溶液：精密称取立他司特样品20mg于20ml量瓶，精密加入jp-y-4/5/6/7/8/9/10/11/13/14/16、sm1/2杂质储备液0.1ml，精密加入jp-y-12杂质储备液0.2ml，加溶剂1)稀释溶解定容；
[0034]
4)供试品溶液：称取立他司特样品20mg于20ml量瓶，加溶剂1)稀释并定容；
[0035]
5)对照溶液：取供试品溶液0.1ml于100ml量瓶，加溶剂1)稀释并定容。
[0036]
实验例1
[0037]
溶液配制：见“溶液配制”。
[0038]
检测条件：以0.02％磷酸水溶液为流动相a，0.02％磷酸乙腈混合液为流动相b，按下表进行梯度洗脱；柱温为30℃；检测波长为220nm；流速1.0ml/min，进样量10μl。
[0039][0040]
选择不同稀释溶剂对立他司特原料药及14个杂质进行处理，结果显示：立他司特在纯水或乙腈中均不溶解，在不同浓度乙腈中溶解情况不同，对已知杂质进行定位发现杂质jp-y-12在50％乙腈作为溶剂的条件下会产生溶剂化效应，峰型裂分；在20-40％乙腈中无溶剂化效应，且峰型较好。
[0041][0042]
实验例2
[0043]
溶液配制：见“溶液配制”。
[0044]
检测条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.02％磷酸水溶液为流动相a，0.02％磷酸乙腈混合液为流动相b，梯度洗脱；检测波长220nm；柱温及流速如下：
[0045][0046]
梯度洗脱条件如下：
[0047][0048]
结果显示，在20-60℃柱温、0.5-2.0ml/min流速条件下，立他司特与杂质之间、各已知杂质之间的分离度均大于1.5，但30-60℃柱温、0.8-1.5ml/min流速条件下峰型及分离
度更优。
[0049]
实验例3
[0050]
溶液配制：见“溶液配制”。
[0051]
检测条件：0.02％三氟乙酸水溶液为流动相a，0.02％三氟乙酸乙腈混合液为流动相b，按下表进行梯度洗脱；柱温为30℃；检测波长为220nm；流速为每分钟1.0ml，进样量10μl。
[0052][0053]
结果显示，三氟乙酸体系下仅能检测出5个杂质，出峰顺序为sm2/jp-y-16/jp-y-6/jp-y-4/sm1/jp-y-7，在检测波长下，基线干扰较大，杂质信噪比较低，具体如下表及图1。
[0054]
名称保留时间/min峰面积信噪比分离度sm23.5551313.91223.1/jp-y-165.3795358.144.612.45jp-y-65.7772149.32536.72.38jp-y-47.0583993.48253.76.85sm112.1722461.21695.225.25jp-y-714.7793343.595568.811.63
[0055]
实验例4
[0056]
溶液配制：见“溶液配制”。
[0057]
检测条件：0.1％三氟乙酸水溶液为流动相a，0.1％三氟乙酸乙腈混合液为流动相b，按下表进行梯度洗脱；柱温为30℃；检测波长为220nm；流速为每分钟1.0ml，进样量10μl，具体如下表。
[0058][0059]
结果显示，三氟乙酸体系下仅能检测出5个杂质，出峰顺序为sm2/jp-y-16/jp-y-6/jp-y-4/sm1/jp-y-7。
[0060]
名称保留时间/min峰面积信噪比分离度sm23.6551247.12211.1/jp-y-165.4665292.342.611.92jp-y-65.8692089.54513.72.21jp-y-47.1503912.52222.26.21sm112.2782391.421600.524.31
jp-y-714.8683279.885538.512.00
[0061]
实验例5
[0062]
溶液配制：
[0063]
杂质储备液：精密称取杂质jp-y-4/5/6/8/9/10/11/13/14各2mg于10ml量瓶中，乙腈稀释溶液并定容；精密称取杂质jp-y-12为2mg于20ml量瓶中，加50％乙腈溶液并定容；
[0064]
杂质定位溶液：分别量取jp-y-4/5/6/8/9/10/11/13/14杂质储备液1ml分别置于20ml量瓶,量取jp-y-12杂质储备液1ml置于10ml量瓶，分别加50％乙腈溶液并定容；
[0065]
检测条件：以0.05％磷酸水溶液为流动相a，0.05％磷酸乙腈混合液为流动相b，梯度洗脱；柱温为30℃；检测波长为220nm；流速为每分钟1.0ml，进样量10μl，梯度洗脱条件如下：
[0066][0067]
检测步骤及结果：取各个杂质定位溶液10μl，分别进样，结果显示杂质jp-y-12与溶剂峰不分离，无法保留，不适用于杂质12的检测，其他杂质检测情况见下表。
[0068][0069][0070]
实验例6
[0071]
溶液配制：见“溶液配制”。
[0072]
检测条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.05％磷酸水溶液为流动相a，0.05％磷酸乙腈混合液为流动相b，梯度洗脱；柱温20-60℃；检测波长220nm；流速0.5-2.0ml/min，梯度洗脱条件如下：
[0073][0074]
实验步骤及结果：取分离度溶液10μl进样，结果显示杂质jp-y-14/16无法分离，杂质jp-y-10与立他司特无法分离，杂质jp-y-13与jp-y-7分离度小于1.5，该方法无法将14个已知杂质及杂质与立他司特进行分离，具体如下表及图2。
[0075][0076]
实施例1
[0077]
溶液配制：见“溶液配制”。
[0078]
检测条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.02％磷酸水溶液为流动相a，0.02％磷酸乙腈混合液为流动相b，梯度洗脱；柱温30℃；检测波长220nm；流速0.8ml/min，梯度洗脱条件如下：
[0079][0080]
检测步骤及结果：取分离度溶液10μl进样，结果显示14个已知杂质及未知杂质分离度均大于1.5，与主峰最近杂质分离度达大于2，方法专属性良好。已知杂质分离情况具体如下表，所有杂质分离情况见图3：
[0081]
物质名称保留时间/min峰面积信噪比理论塔板数分离度jp-y-123.75632.72989.33364/sm29.14314.18236.81431818.7jp-y-1411.66643.14292.1172467.6jp-y-1615.98657.815110.22478011.3jp-y-1118.10636.78671.1324215.2jp-y-628.91929.86843.64504122.8jp-y-431.90036.40658.8693455.8jp-y-1036.25658.072109.81286763.7立他司特37.92534703.57376058.32123094.6jp-y-842.90345.309139.149399012.2sm144.69826.84178.44530392.5jp-y-945.18341.480140.56105832.0jp-y-1346.02736.824111.45917483.6
jp-y-749.52139.314130.57597375.9jp-y-553.32326.34885.786314312.5
[0082]
实施例2
[0083]
分析得立他司特原料及制剂中杂质jp-y-10与立他司特主峰分离度最接近，因此以杂质jp-y-10的分离作为系统适用性要求。
[0084]
溶液配制：
[0085]
1)jp-y-10储备液：称取杂质jp-y-10 2mg于10ml量瓶，乙腈稀释溶液并定容；
[0086]
2)系统适用性试验溶液：精密称取立他司特样品20mg于20ml量瓶，加入jp-y-10储备液适量，加20-40％乙腈溶解，并定量稀释制成每1ml中约含立他司特1mg和杂质jp-y-10 1μg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液。
[0087]
检测条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.05％磷酸水溶液为流动相a，0.05％磷酸乙腈混合液为流动相b，梯度洗脱；柱温50℃；检测波长220nm；流速1.2ml/min，梯度洗脱条件如下：
[0088][0089][0090]
检测步骤及结果：取系统适用性试验溶液10μl进样，结果显示以杂质jp-y-10的分离作为系统适用性验证条件，结果显示分离度大于1.5，峰型良好，灵敏度高。
[0091]
名称jp-y-10立他司特保留时间(min)36.18437.880分离度/4.6
[0092]
实施例3
[0093]
溶液配制：见“溶液配制”。
[0094]
检测条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；1％磷酸水溶液为流动相a，0.05％磷酸乙腈混合液为流动相b，梯度洗脱；柱温50℃；检测波长220nm；流速1.2ml/min，梯度洗脱条件如下：
[0095][0096]
检测步骤及结果：取分离度溶液10μl进样，结果显示14个已知杂质、已知杂质与未知杂质间分离度均大于1.5；所有杂质与主峰最近杂质分离度达大于2。已知杂质分离情况具体如下表，所有杂质分离情况见图4：
[0097]
物质名称保留时间/min峰面积信噪比理论塔板数分离度
jp-y-123.76831.97276.23380/sm29.15713.55930.31599319.6jp-y-1411.65443.60376.9170597.7jp-y-1615.94157.76692.22553011.4jp-y-1118.03237.74560.3325125.2jp-y-628.87028.95634.14537123.0jp-y-431.79437.28249.2674605.7jp-y-1036.18455.82890.21305643.8立他司特37.88034724.68063438.12129994.6jp-y-842.89043.583116.152151312.1sm144.67426.69065.24598912.5jp-y-945.17441.233117.86406892.0jp-y-1346.01736.58392.86033593.7jp-y-749.52139.453108.57676346.5jp-y-553.31325.60871.788459812.2
[0098]
实施例4
[0099]
溶液配制：见“溶液配制”。
[0100]
检测条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.05％磷酸水溶液为流动相a，0.08％磷酸乙腈混合液为流动相b，梯度洗脱；柱温40℃；检测波长220nm；流速1.0ml/min，梯度洗脱条件如下：
[0101][0102]
检测步骤及结果：取分离度溶液10μl进样，结果显示14个已知杂质分离度均大于1.5，与主峰最近杂质分离度达大于2。已知杂质分离情况具体如下表，所有杂质分离情况见图5：
[0103]
物质名称保留时间/min峰面积信噪比理论塔板数分离度jp-y-125.30532.62513.83979/sm214.70914.80741.82534326.6jp-y-1418.57138.12080.93551810.1jp-y-1622.02958.872103.0340927.9jp-y-1126.00740.08118.9523768.5jp-y-637.44030.2561.016402827.7jp-y-49.13637.9013.03308995.3jp-y-1041.68858.35924.93036554.3立他司特42.62332900.2795650.13329733.1
jp-y-847.40441.361142.75762412.3sm149.48528.6221.94788843.2jp-y-949.87641.8733.26485161.6jp-y-1350.85038.847120.86169863.9jp-y-754.93241.642132.87242728.7jp-y-559.50926.47238.184068414.3
[0104]
实施例5立他司特原料中有关物质检测方法
[0105]
溶液配制：
[0106]
供试品溶液：分别取立他司特原料药(批号jp-20092701、jp-20082701、jp-20082702、jp-20082703、jp-20091601)，精密称定，加20-40％乙腈适量，超声使溶解并定量稀释制成每1ml中约含立他司特1mg的溶液。
[0107]
对照溶液：精密量取立他司特供试品适量，加20-40％乙腈稀释制成每1ml中约含立他司特1μg的溶液。
[0108]
检测条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.05％磷酸水溶液为流动相a，0.05％磷酸乙腈混合液为流动相b，梯度洗脱；柱温30℃；检测波长220nm；流速0.8ml/min，梯度洗脱条件如下：
[0109][0110]
检测步骤及结果：取各批次供试品溶液、对照溶液10μl进样，结果显示不同批次杂质检测结果如下表：
[0111][0112]
实施例6立他司特制剂中有关物质检测方法
[0113]
溶液配制：
[0114]
供试品溶液：分别取立他司特制剂(批号20111801、20111802、20111803)，精密称定，加20-40％乙腈适量，超声使溶解并定量稀释制成每1ml中约含立他司特1mg的溶液。
[0115]
对照溶液：精密量取立他司特供试品适量，加20-40％乙腈稀释制成每1ml中约含立他司特1μg的溶液。
[0116]
检测条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.04％磷酸水溶液为流动相a，0.04％磷酸乙腈混合液为流动相b，梯度洗脱；柱温50℃；检测波长220nm；流速1.0ml/min，梯度洗脱条件如下：
[0117][0118]
检测步骤及结果：取各批次供试品溶液、对照溶液10μl进样，结果显示立他司特制剂三批检测样品中均不含上述已知14个杂质。