一种基于拉曼静默区SERS成像快速检测食品及环境中双酚A的方法与流程

一种基于拉曼静默区sers成像快速检测食品及环境中双酚a的方法
技术领域
1.本发明涉及一种基于拉曼静默区sers成像快速检测食品及环境中双酚a的方法，属于分析化学技术领域。


背景技术：

2.双酚a（bpa）是一种常用于工业合成环氧树脂和聚碳酸酯等的有机化工材料，同时也是一种具有雌激素样活性的内分泌干扰物，可导致内分泌失调，易诱发婴幼儿代谢功能紊乱，甚至引发性早熟或致癌。bpa难以降解，可通过环境进入食物链，或经食品包装材料迁移，进而进入食品中。我国国家卫生标准规定：食品容器及包装材料用碳酸酯树脂和成型品中酚溶出量不得大于0.05 mg/kg，生活饮用水水质标准中，bpa的最大允许浓度为0.01 mg/l。我国国家指定婴幼儿食品中bpa检测方法的检出限为0.1 μg/kg，欧盟国家规定婴幼儿食品中不得检出bpa。目前bpa的国家标准检测方法，多基于高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法等仪器检测法，这些方法虽然准确、灵敏，但检测过程繁杂，耗时较长；近年来bpa新型检测方法有酶联免疫法、电化学传感检测法等，方法快速简便、灵敏度较高，但其易受基质影响较大，易出现假阳性或假阴性或定量不准确的现象。bpa对人体生命健康有严重危害，因此快速、灵敏、准确检测食品及环境中bpa有非常重要的意义。
3.表面增强拉曼光谱（sers）传感快速检测技术，作为一种无损分子指纹技术，目前已广泛用于生物医学、毒品鉴别、食品及环境危害因子检测等现场快速检测领域。基于修饰了拉曼静默区信号分子的贵金属纳米组装体sers传感检测器，是新型快速检测技术。其原理在于以dna核酸适配体及其部分互补序列将纳米颗粒进行组装，利用纳米组装结构的等离子共振耦合增强，研究纳米组装体的协同拉曼增强sers效应，同时引入拉曼静默区（1800-2800 cm-1
）信号分子，利用拉曼静默区特征峰信号强度与目标物浓度之间建立标准曲线，以sers成像实现目标物的快速、高特异性、高灵敏检测。sers成像技术可以线扫描、面扫描等扫描方式，在短时间内快速采集待测样品的多条拉曼光谱，线扫描、面扫描得到多个点的平均光谱，可大幅提高检测的准确度和灵敏度。由于食品及环境样品的拉曼特征分都在200-1800 cm-1
范围内，以拉曼静默区特征峰作为定性、定量特征峰，可以有效降低样品基质的干扰。


技术实现要素：

4.本发明基于核酸适配体技术和纳米材料的自组装技术，提出了一种新型的、灵敏的、简便的、准确的快速检测bpa的方法，构建了具有拉曼静默区信号的纳米组装体，并以此作为sers成像检测基底，用于食品及环境样品中bpa的快速检测，以拉曼静默区特征峰信号与目标物的浓度建立标准曲线，可以有效降低样品基质拉曼信号的干扰，提高检测的灵敏度和准确度，实现食品及环境样品中bpa的快速定性定量检测（图1）。
5.本发明的目的是提供一种基于拉曼静默区sers成像快速检测食品及环境中双酚a的方法，所述方法为将修饰有巯基化的bpa适配体（bpa aptamer）的金纳米颗粒（aunps），和修饰有巯基化的bpa适配体部分互补序列（bpa cs）的aunps，分别标记上含拉曼特征峰的信标分子4-mbn，混合孵育组装得到纳米组装体，向纳米组装体中加入样本混合反应，通过拉曼光谱法测定双酚a离子。
6.在本发明的一种实施方式中，所述方法的具体步骤如下：（1）金纳米颗粒的制备将0.2~0.3 mmol/l氯金酸水溶液，加热至沸腾，加入质量分数为0.75~1.25%的柠檬酸水溶液，继续加热搅拌，溶液变为酒红色后，保持加热8~12 min后停止加热，待溶液冷却至室温，将其离心浓缩，得到金纳米颗粒；（2）金纳米颗粒溶液a：向步骤（1）中的金纳米颗粒加入巯基化的bpa aptamer，使得金纳米颗粒与bpa aptamer的摩尔比为1：10，于35~38℃水浴孵育1~5 h后，加入nacl溶液，过夜孵育，离心去上清，重悬，得到金纳米颗粒溶液a；（3）金纳米颗粒溶液b：向步骤（1）中的金纳米颗粒加入巯基化的bpa cs，使得金纳米颗粒与bpa cs的摩尔比为1：10，于35~38℃水浴孵育1~5 h后，加入nacl溶液，过夜孵育，离心去上清，重悬，得到金纳米颗粒溶液b；（4）金纳米颗粒偶联拉曼信标分子：在步骤（2）制备的金纳米颗粒溶液a和步骤（3）制备的金纳米颗粒溶液b中，分别加入终浓度为8~12 μmol/l信标分子4-mbn，孵育，得到两种金纳米颗粒aunps-bpaaptamer-4-mbn 和aunps-bpa cs-4-mbn；（5）纳米组装体的组装：分别取45~55 μl步骤（4）得到的两种金纳米颗粒aunps-bpaaptamer-4-mbn 和aunps-bpa cs-4-mbn混匀后，加入终浓度为18~22 mmol/l的mgcl2溶液，35~38℃水浴孵育10~15 h，离心后去上清液，重悬，得到纳米组装体；（6）向步骤（5）中制备的纳米组装体中加入待测样本，混合孵育后测定拉曼信号。
7.在本发明的一种实施方式中，所述巯基化的bpaaptamer的5
′
端经巯基修饰，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.在本发明的一种实施方式中，所述巯基化的bpa cs的5
′
端经巯基修饰，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.在本发明的一种实施方式中，步骤（2）和步骤（3）中，孵育的条件为35~38℃水浴孵育1~5 h。
10.在本发明的一种实施方式中，步骤（2）和步骤（3）中，nacl溶液的终浓度为80~120 mmol/l。
11.在本发明的一种实施方式中，步骤（4）中，孵育的条件为35~38℃水浴孵育5~10 h。
12.在本发明的一种实施方式中，步骤（6）中，纳米组装体与待测样本的体积比为1:1。
13.在本发明的一种实施方式中，步骤（6）中，通过纳米组装体在静默区的表面增强拉曼信号与bpa浓度的标准曲线计算bpa浓度。
14.在本发明的一种实施方式中，步骤（6）中，在常温条件下孵育8~12 min。
15.在本发明的一种实施方式中，步骤（6）中，在785 nm的激发波长下测定拉曼信号。
16.在本发明的一种实施方式中，所述标准曲线为y=-1076.11*lg(x)+1233.95，其中y为2228 cm-1
处的拉曼光谱峰信号强度，x为bpa浓度。
17.本发明还提供了上述方法在食品和环境领域中的应用。
18.本发明还提供了上述方法在检测双酚a中的应用。
19.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提出了一种新型的、灵敏的、简便的、准确的快速检测bpa的方法，其基于纳米材料的自组装技术和核酸适配体技术，构建了具有拉曼静默区信号的纳米组装体，并以此作为sers检测基底。将拉曼静默区特征峰信号与目标物的浓度建立标准曲线，以sers成像来快速、高灵敏定性定量检测bpa，定量限和检出限分别为0.05 nmol/l和0.033 nmol/l，该方法用于食品及环境等复杂样品中bpa的检测，可以有效降低样品基质拉曼信号的干扰，提高检测的灵敏度和准确度。
附图说明
20.图1 本发明基于纳米组装体sers检测的原理图。
21.图2 本发明金纳米颗粒和纳米组装体的透射电镜照片。
22.图3 本发明中向纳米组装体中加入不同浓度的bpa，导致的拉曼光谱的变化图。
23.图4 本发明中的拉曼光谱检测bpa的标准曲线图。
具体实施方式
24.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
25.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。
26.bpa标准品购自bepure公司，信标分子4-mbn购自北京百灵威科技有限公司公司，双酚酸（dpa）、双酚c（bpc）和乙烯雌酚（des）分别购自bepure、cato、bepure公司。
27.实施例1：检测传感器的构建a、20 nm金纳米颗粒的制备取250 ml洁净的三角瓶，加入100 ml浓度为0.25 mmol/l氯金酸水溶液，置于恒温磁力搅拌器上，在快速磁力搅拌的作用下，加热至沸腾并冷凝回流。接着加入1.8 ml新鲜配置的质量分数为1%的柠檬酸水溶液，继续加热搅拌还原，溶液的颜色由无色变为蓝色最终变为酒红色，保持加热10 min后停止加热。待溶液冷却至室温，将其离心浓缩，得到终浓度为10 mmol/l的20 nm金纳米颗粒，将其冷却至室温后，4℃冷藏备用。
28.b、金纳米颗粒上修饰适配体bpa aptamer步骤a制备的金纳米颗粒中加入巯基化的bpa适配体（bpa aptamer）（5
′‑
sh-ttttttttttccggtgggtggtcaggtgggatagcgttccgcgtatggcccagcgcatcacgggttcgcacca-3
′
），使得金纳米颗粒与bpa aptamer的摩尔比为1：10，于37℃水浴孵育3 h后，分多次加入nacl溶
液直至反应体系中nacl的终浓度为100 mmol/l，过夜孵育，离心去上清，以超纯水重悬沉淀，得到标记了bpa aptamer的金纳米颗粒溶液a，待用。
29.c、金纳米颗粒偶联bpa适配体部分互补序列：bpa cs将步骤a制备的金纳米颗中加入巯基化的bpa cs（5
′‑
sh-ttttttttttcccacctgaccacccaccgg-3
′
），使得金纳米颗粒与bpa cs的摩尔比为1︰10，于37℃水浴孵育3 h后，分多次加入nacl溶液直至反应体系中nacl的终浓度为100 mmol/l，过夜孵育，离心去上清，用超纯水重悬沉淀，得到标记了bpa cs的金纳米颗粒溶液b，待用。
30.d、金纳米颗粒偶联拉曼信标分子在步骤b和c制备的金纳米颗粒溶液a、b中，分别加入信标分子4-mbn，使得其终浓度为10 μmol/l，37℃水浴孵育8 h。
31.e、纳米组装体的组装分别取50 μl步骤d中标记了4-mbn的金纳米颗粒溶液a和b，混匀，并分多次逐步加入mgcl2溶液至其终浓度为20 mmol/l，37℃水浴孵育12 h，离心后去上清液，沉淀物以100 μl超纯水重悬，得到纳米组装体。金纳米颗粒和纳米组装体的透射电镜照片如图2所示，表明sers传感器组装成功。
32.实施例2：sers成像快速定量检测bpa通过在实施例1中的sers传感器中加入一系列不同浓度的bpa标准品，混匀置于常温反应10 min后进行测试，建立sers传感器表面增强拉曼信号与bpa浓度的标准曲线。
33.bpa标准品添加浓度依次为0，0.05，0.1，0.5，1，2，10 nmol/l，分别加入相同体积的纳米组装体中，随着bpa浓度的增加，纳米组装体会有不同程度的解离，从而得到不同的拉曼信号强度，导致的拉曼光谱的变化图如图3所示，bpa浓度越低，拉曼信号越强。
34.在785 nm的激发波长下，根据sers静默区2228 cm-1
特征峰信号强度与bpa浓度的关系建立两者之间的标准曲线，实现对bpa的快速检测，拉曼光谱检测bpa的标准曲线图如图4所示，标准曲线为y=-1076.11*lg(x)+1233.95（r2=0.9889），检测限（lod值）为0.033 nmo/l。
35.实施例3：表面增强拉曼光谱检测bpa的特异性验证应用实施例1中所建立的sers传感器，选择双酚酸（dpa）、双酚c（bpc）和乙烯雌酚（des）验证该sers传感器的特异性。
36.向实施例1中的sers传感器中，分别加入浓度0.5 nmol/l bpa，50 nmol/l 双酚c，50 nmol/l 双酚酸，50 nmol/l 乙烯雌酚，混匀置于常温反应10 min后进行测试。
37.当向实施例1中的sers传感器中加入浓度为50 nmol/l的bpc、dpa和des时，拉曼光谱与不加入任何物质的对照组的拉曼光谱类似，基本没有引起拉曼光谱信号的变化。而当向实施例1中的sers传感器中加入浓度仅为0.5 nmol/l的bpa时，其拉曼光谱会出现明显的降低。将所测得的拉曼光谱中2228 cm-1
特征峰强进行对比：对照组为4906 cps，双酚c 为4890 cps，双酚酸为4904 cps，乙烯雌酚为 4887 cps，而bpa仅为1600 cps。
38.结果表明，当向sers传感器中加bpa的类似物时，即使加入浓度是bpa浓度的100倍时，仍不能引起组装体的解离。证明，该sers传感器对bpa具有良好的特异性和选择性。
39.实施例4：食品及环境样品检测应用实施例1中所建立的sers传感器，对添加浓度分别为0.1 nmol/l和1 nmol/l
的婴幼儿奶粉和养殖用水进行检测，利用实施例2所建立的标准曲线，计算添加回收率（表1）。本发明的sers传感检测方法对bpa在0.05-10nmol/l浓度范围内具有较高准确性，添加回收率保持在92%~99.2%之间，三次重复实验的rsd值均小于8.54%，适合bpa快速定量检测，能够满足食品及环境等复杂样品中bpa的快速、高灵敏定量检测的需要。
40.表1 婴幼儿奶粉及养殖用水中bpa检测虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。