炎症性肠病诊断方法、诊断探针和诊断试剂盒

本申请涉及炎症性肠病的诊断方法、诊断探针和诊断试剂盒。

背景技术

炎症性肠病(IBD)，例如溃疡性结肠炎和克罗恩病，是一种引起肠炎症的医学病况。虽然在西方国家IBD已经是一种常见病，在日本该病也已呈上升趋势。患有溃疡性结肠炎的日本患者为17万，每年溃疡性结肠炎新发病例的人数超过1万例，且在日本溃疡性结肠炎发病率以与在西方国家的发病率相当的速度增长。克罗恩病患者的人数超过40,000人，虽然没有溃疡性结肠炎患者多，但比以往任何时候都增加更多。溃疡性结肠炎和克罗恩病都是肠道的慢性炎症，其在相对年轻年龄的人群中发生，是伴有反复复发和缓解的难治性疾病。

溃疡性结肠炎是存在于大肠中的主要影响粘膜并导致糜烂和溃疡的弥漫性的和非特异性的炎症。已知免疫机制会影响病理状况。临床环境中溃疡性结肠炎的血清标志物是非特异性炎症证据。研究还报告说，在溃疡性结肠炎(NPL 1)中发现了抗中性粒细胞胞浆抗体和抗平滑肌细胞抗体等自身抗体，并且已经积极鉴定了与这些抗体相对应的抗原。然而，每种抗体的阳性率低至50％或更低。

引文清单

非专利文献

NPL 1:Zhou G等人,消化疾病(Digestive Diseases)2016；34(1-2):90-7

技术实现要素：

技术问题

需要能够特异性检测或诊断炎症性肠病的标记物，以及使用这些标记物检测炎症性肠病的方法。

本发明的目的在于提供一种能够特异性确定炎症性肠病的确定方法、诊断探针及诊断试剂盒。

技术方案

本申请包括以下各项中描述的主题。

第1项：用于确定炎症性肠病的方法，包括测量从受试者收集的样品中的抗内皮细胞蛋白C受体抗体(抗EPCR抗体)。

第2项：根据第1项所述的方法，包括

使从受试者收集的样品与内皮细胞蛋白C受体(EPCR)接触，

测量样品中抗内皮细胞蛋白C受体抗体(抗EPCR抗体)的量，以及

当测量值高于参考值时，确定受试者患有炎症性肠病。

第3项：根据第1项或第2项所述的方法，其中所述判定包括确定以下各项：

是否患有炎症性肠病，

发生炎症性肠病的风险，

炎症性肠病的严重程度，

对于炎症性肠病有预防作用，

对患有炎症性肠病患者的治疗效果，

炎症性肠病是否再发生，

炎症性肠病再发生的风险，

炎症性肠病是否复发，或

炎症性肠病复发的风险。。

第4项：如第1项至3中任一项所述的方法，其中，所述样品为血液、血清或血浆。

第5项：如第1项至4中任一项所述的方法，其中，炎症性肠病为溃疡性结肠炎或克罗恩病。

第6项：用于炎症性肠病的诊断探针，包含内皮细胞蛋白C受体(EPCR)。

第7项：用于炎性肠病的诊断试剂盒，包含内皮细胞蛋白C受体(EPCR)。

本发明的有益效果

本申请使得能够特异性地诊断炎症性肠病。

附图说明

图1显示了抗EPCR抗体的频率和效价。

Control：对照；UC：溃疡性结肠炎。

具体实施方式

1、受试者

受试者不仅包括患有炎症性肠病的患者，还包括疑似患有炎症性肠病的患者。“疑似患有炎症性肠病的受试者”可以是主观怀疑自己患有炎症性肠病的受试者(不仅限于有主观症状的人，还包括单纯希望接受预防性检查的受试者)，或有客观证据(例如，医师因为已知临床检查(例如心率、血压和血液或尿液检验)确定有患有炎症性肠病的合理可能性的人)/或医疗咨询)的受试者。

炎症性肠病是引起肠炎症的任何疾病，优选为溃疡性结肠炎或克罗恩病，更优选为溃疡性结肠炎。

2、样品

从受试者收集的样品可以是任何样品，例如是诸如血液(全血)、血清、血浆和淋巴液的体液。从检测精度的观点来看，优选血液、血清和血浆。

3、抗原EPCR

在提交本申请之前，尚未确定炎症性肠病中自身抗体的疾病特异性抗原，并且该疾病的诊断目前依赖于，例如炎症反应的筛查测试。自身抗体及其抗原的鉴定可用于以下各项：(1)将它们用作临床实践中的诊断探针，(2)诊断和分类疾病，(3)阐明病理状况，以及(4)选择干预目标。

使用已知的蛋白质鉴定方法，例如蛋白质印迹、二维电泳、质谱或表达文库，很难鉴定膜蛋白自身抗原。然而，发明人之前构建了膜蛋白自身抗原鉴定系统(使用逆转录病毒载体和流式细胞术的自身抗原血清学鉴定系统(serological identification system for autoantigens using a retroviral vector and flow cytometry,“SARF,”)Shirai T等人,临床与发育免疫学(Clin Dev Immunol.)2013；2013:453058.doi:10.1155/2013/453058)。

在本研究中，发明人尝试利用SARF鉴定血管内皮细胞自身抗体的抗原，并将内皮细胞蛋白C受体(EPCR)和清道夫受体B类成员I(SCARBI)鉴定为两种新的血管炎症候群的膜蛋白自身抗原。然后，发明人使用EPCR和SCARBI作为检测或诊断探针，测量了患有溃疡性结肠炎的受试者和健康受试者的血清中抗EPCR抗体的量和抗SCARBI抗体的量，令人惊讶地发现患有溃疡性结肠炎的受试者与健康受试者相比，表现出显著增强的抗EPCR抗体活性。

内皮细胞蛋白C受体(EPCR)是蛋白C的特异性受体，蛋白C是凝血因子之一，并且该蛋白C是跨膜蛋白。人源EPCR具有由SEQ ID NO:1(NP#006395.2)所示的氨基酸序列，并且根据本申请的EPCR可以是具有由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白质或是具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的蛋白质。“与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列”是指与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性，优选至少约95％同一性，更优选至少约98％同一性的氨基酸序列。优选地，根据本申请的EPCR是具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白质。

根据本发明的EPCR还可以是具有通过缺失、添加或取代SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的例如一个或两个或更多个氨基酸(优选1至10个，更优选1至5个，还更优选1、2或3个)形成的氨基酸序列的蛋白质。包含缺失、添加或取代的此种氨基酸序列中的缺失、添加或取代位置不受特别限制，只要保持蛋白质的活性。然而，缺失、添加或取代的位置优选不在对应于表位的氨基酸序列中。

序列的“同一性”是指使用本领域已知的数学算法(优选地，能够考虑将空位引入一个或两个序列中以实现最佳比对)比对的两个碱基序列的最佳比对的所有重叠碱基中的相同碱基的百分比(％)。

用于确定碱基序列同一性的其他算法的示例包括，但不限于根据Karlin S等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877(1993)的算法；根据Needleman SB等人，J.Mol.Biol.,48-444-453(1970)的算法；根据Myers EW等人，CABIOS，4:11-17(1988)的算法以及根据Pearson WR等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444-2448(1988)的算法。

例如，可以通过已知方法或等效方法由受试者的细胞或组织制备EPCR。也可以通过已知的肽合成方法，例如通过使用肽合成仪来化学合成EPCR。也可以通过培养含有编码EPCR的DNA的转化体并表达蛋白质来产生EPCR。也可以使用无细胞转录-翻译系统通过生化合成产生EPCR，该无细胞转录-翻译系统使用编码EPCR的核酸作为模板。可以以多种方式例如糖基化修饰EPCR。

4、抗EPCR抗体

可以通过使用SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的全部或部分作为抗原来鉴定抗EPCR抗体，优选SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的连续4个或更多个氨基酸，更优选5个或更多个氨基酸，还更优选6个或更多个氨基酸，优选连续20个或更多个氨基酸，更优选18或更少的氨基酸，还更优选15或更少的氨基酸。

抗EPCR抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，不仅可以包括完整的抗体分子，还可以包括诸如Fab、F(ab')2、ScFv的其片段和微抗体。

5、用于测量抗EPCR抗体的量的方法

在本申请中，使用EPCR蛋白作为抗原的免疫测定包括使用该抗原的Western印迹；诸如酶联免疫吸附确定(ELISA)、酶免疫测定和荧光免疫测定的免疫测定；免疫沉淀；免疫比浊法；流式细胞仪；和荧光染色。可以通过检测与抗原的分子量相匹配的条带、斑点或峰来进行测量；然而，测量方法不限于这些测定。

在Western印迹中，可以根据抗原的分子量和等电点分离蛋白质。因此，可以从条带大小的位置容易地确定是否存在抗体。在免疫测定中，可以通过使用合适的溶剂将含有抗原的培养细胞固定在固体支持物(例如，载玻片)上，然后使来自受试者的样品与细胞接触以测量标记的抗人免疫球蛋白抗体的量来对根据本申请的抗体进行定量。在流式细胞术中，可以通过使来自受试者的样品与过表达抗原的细胞接触，然后使样品与荧光标记的抗人IgG细胞反应来对根据本申请的抗体进行定量。由于流式细胞术使用未固定化的细胞，因此流式细胞术可以针对自身抗原的细胞外结构域及其高级结构对抗体活性进行定量。

然而，用于测量抗EPCR抗体的量的方法不应限于上述技术；可以使用任何测量方法，只要该方法通过化学或物理技术检测样品中的抗原的量、对应于抗原的量的抗体的量或抗体-抗原复合物的量，并且根据检测到的量计算抗EPCR抗体的量。在测量时抗原或抗体可以与诸如放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质的标记剂结合。放射性同位素的实例包括[¹²⁵I]、[¹³1I]、[³H]和[¹⁴C]。酶的实例包括碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶。荧光物质的实例包括荧光胺和异硫氰酸荧光素。发光物质的实例包括鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素和光泽精。此外，生物素链霉亲合素系统可用于将抗体与标记试剂结合。

为了测量抗体的量，可以使用与转移膜或固相上的抗原特异性结合的抗体的二抗来促进反应，二抗优选是标记的。二抗包括，但不限于诸如多克隆抗体和单克隆抗体(mAb)的天然抗体、可以利用基因重组技术产生的嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体及其结合片段，只要它们识别人免疫球蛋白。此种二抗在本领域中是众所周知的。

6、确定炎症性肠病的方法

本申请包括用于确定炎性肠病的方法，该方法包括测量从受试者收集的样品中的抗内皮细胞蛋白C受体抗体(抗EPCR抗体)。

由于高比例的患有炎症性肠病的患者对抗EPCR抗体呈阳性，因此可以通过测量从受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量，体外特异性地确定或诊断炎症性肠病。

确定包括确定是否患有炎症性肠病，确定发生炎症性肠病的风险，确定炎症性肠病的严重程度，确定对炎症性肠病的预防作用，确定对患有炎症性肠病的患者的治疗作用，确定炎症性肠病是否再发生，确定炎症性肠病再发生的风险，确定炎症性肠病是否复发，判断炎症性肠病复发的风险。

抗EPCR抗体的测量值与另一个值的比较基于是否存在统计学上显著的差异来进行。

在一个实施方案中，根据本发明的用于确定炎症性肠病的方法包括使从受试者收集的样品与内皮细胞蛋白C受体(EPCR)接触，测量抗内皮细胞蛋白C受体抗体(抗-EPCR抗体)，当测量值高于参考值时确定受试者患有炎症性肠病。

参考值优选地是已知量的抗EPCR抗体(例如，从患有炎症性肠病的多个患者中的抗EPCR抗体的量计算出的平均值或大于平均值的值)。

如果从受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量高于参考值，则可以确定该受试者患有炎症性肠病。如果从受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量等于或低于参考值，则可以确定该受试者没有患炎症性肠病。此种确定可用于确定受试者是否患有炎症性肠病。

在另一个实施方案中，根据本发明的用于确定炎症性肠病的方法包括使从受试者收集的样品与内皮细胞蛋白C受体(EPCR)接触，测量抗内皮细胞蛋白C受体抗体(抗-EPCR抗体)，以及当测量值高于参考值时确定受试者处于发生炎症性肠病的高风险中。

参考值，例如是根据一组健康受试者的抗EPCR抗体的量计算出的平均值，或者是比根据一组健康人的抗EPCR抗体的量计算出的平均值高且比根据一组炎症性肠病患者的抗EPCR抗体的量计算出的平均值低的预定值。

如果从受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量高于参考值，则可以确定该受试者处于发生炎症性肠病的高风险中。如果从受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量等于或低于参考值，则可以确定该受试者处于患有炎症性肠病的低风险中。此种确定可用于确定发生炎症性肠病的风险。

在另一个实施方案中，根据本发明的用于确定炎症性肠病的方法包括使从受试者收集的样品与内皮细胞蛋白C受体(EPCR)接触，测量抗内皮细胞蛋白C受体抗体(抗-EPCR抗体)，以及通过比较测量值与参考值来确定受试者的炎症性肠病的严重程度。

参考值，例如是根据多个患有一定严重程度的炎症性肠病患者的抗EPCR抗体的量计算出的平均值。

如果受试者的测量值高于平均值，则可以确定该受试者的炎症性肠病很可能落入所讨论的严重程度的分类中。如果受试者的测量值等于或低于平均值，则可以确定该受试者的炎症性肠病不太可能落入所讨论的严重程度的分类中。此种确定可用于确定炎症性肠病的严重程度。

在另一个实施方案中，根据本发明的用于确定炎症性肠病的方法包括使在受试者接受预防炎症性肠病的措施之前从该受试者收集的样品和在受试者接受预防炎症性肠病的措施之后从该受试者收集的样品分别与内皮细胞蛋白C受体(EPCR)接触，测量两个样品中的抗内皮细胞蛋白C受体抗体(抗-EPCR抗体)的量，以及通过比较两个样品的测量值确定受试者中对炎症性肠病的预防作用。

如果在受试者接受预防炎症性肠病的措施后从受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量低于在受试者接受预防炎症性肠病的措施之前从该受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量，可以确定该受试者已经接受了对炎症性肠病的预防作用。如果在受试者接受预防炎症性肠病的措施之后从该受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量等于或高于在受试者接受预防炎症性肠病的措施之前从该受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量，则可以确定该受试者没有接受对炎症性肠病的预防作用。预防炎症性肠病的措施包括施用诸如5-氨基水杨酸制剂和类固醇制剂的抗炎药、免疫抑制剂、诸如抗-TNF-α-抗体的药剂、运动疗法和饮食疗法。此种确定可用于确定对炎症性肠病的预防作用。

在另一个实施方案中，根据本发明的用于确定炎症性肠病的方法包括使在受试者接受治疗炎症性肠病的措施之前从该受试者收集的样品和在受试者接受治疗炎症性肠病的措施之后从该受试者收集的样品分别与内皮细胞蛋白C受体(EPCR)接触，测量两个样品中抗内皮细胞蛋白C受体抗体(抗-EPCR抗体)的量，以及通过比较两个样品确定受试者中的炎症性肠病的治疗效果。

如果在受试者接受治疗炎症性肠病的措施之后从该受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量，低于在受试者接受治疗之前从该受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量，则可以确定该受试者已接受炎症性肠病的治疗效果。如果在受试者接受治疗炎症性肠病的措施之后从该受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量，等于或高于在受试者接受治疗炎症性肠病的措施之前从该受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量，则可以确定该受试者没有接受炎症性肠病的治疗效果。治疗炎症性肠病的措施包括诸如血管搭桥手术的手术；施用诸如5-氨基水杨酸制剂和类固醇制剂的抗炎药、免疫抑制药物和诸如抗TNF-α抗体的药剂；运动疗法和饮食疗法。此种确定可用于确定炎症性肠病的治疗效果。

在另一个实施方案中，根据本发明的确定炎症性肠病的方法包括将从炎症性肠病已经完全治愈的受试者收集的样品与内皮细胞蛋白C受体(EPCR)接触，测量样品中的抗内皮细胞蛋白C受体抗体(抗EPCR抗体)的量，当测量值高于参考值时确定该受试者患有再发性炎症性肠病。

参考值优选为抗EPCR抗体的已知量，例如由多个患有炎症性肠病的患者的抗EPCR抗体的量计算出的平均值或高于平均值的值。

如果从炎症性肠已经病完全治愈的受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量高于参考值，则可以确定该受试者患有再发性炎症性肠病。如果从炎症性肠病已经完全治愈的受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量等于或低于参考值，则可以确定该受试者没有患再发性炎症性肠病。治疗炎症性肠病的措施包括诸如血管搭桥手术的手术；施用诸如5-氨基水杨酸制剂和类固醇制剂的抗炎药、免疫抑制药物和诸如抗TNF-α抗体的药剂；运动疗法和饮食疗法。此种确定可用于确定炎症性肠病是否已经再发生。

在另一个实施方案中，根据本发明的用于确定炎症性肠病的方法包括将从炎症性肠病已经完全治愈的受试者收集的样品与内皮细胞蛋白C受体(EPCR)接触，测量样品中抗内皮细胞蛋白C受体抗体(抗EPCR抗体)的量，通过比较样品的测量值与参考值确定受试者再发生炎症性肠病的风险。

参考值是抗EPCR抗体的已知量，例如从多个患有炎症性肠病的患者的抗EPCR抗体的量计算出的平均值或高于平均值的值、从炎症性肠病已经完全治愈的受试者完全治愈时的抗EPCR抗体的量计算出的值或高于该值的值、从炎症性肠病已经完全治愈的多个患者完全治愈时的抗EPCR抗体的量计算出的平均值或高于该平均值的值。

如果从炎症性肠病已经完全治愈的受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量高于参考值，则可以确定该受试者处于再发生炎症性肠病的高风险中。如果从炎症性肠病已经完全治愈的受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量等于或低于参考值，则可以确定该受试者处于再发生炎症性肠病的低风险中。炎症性肠病的治疗措施包括诸如血管搭桥手术的外科手术；施用，诸如5-氨基水杨酸制剂和类固醇制剂抗炎药、免疫抑制剂和诸如抗TNF-α-抗体的药剂；运动疗法和饮食疗法。此种确定可用于确定炎症性肠病再发生的风险。

在另一个实施方案中，根据本发明的用于确定炎性肠病的方法包括使从已停止接受治疗炎性肠病的措施的受试者收集的样品与内皮细胞蛋白C受体(EPCR)接触，测量样品中的抗内皮细胞蛋白C受体抗体(抗-EPCR抗体)，以及通过比较样品的测量值与参考值来确定受试者是否已复发了炎症性肠病。

参考值，例如是比从一组健康受试者的抗EPCR抗体的量计算出的平均值或从一组患有炎症性肠病的患者的抗EPCR抗体的量计算出的平均值高的预定值。

如果从已经停止接受治疗炎症性肠病的措施的受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量高于参考值，则可以确定该受试者患有复发性炎症性肠病。如果从已经停止接受治疗炎症性肠病的措施的受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量等于或高于参考值，则可以确定该受试者没有患复发性炎症性肠病。治疗炎症性肠病的措施包括诸如血管搭桥手术的手术；施用诸如5-氨基水杨酸制剂和类固醇制剂的抗炎药、免疫抑制药物和诸如抗TNF-α抗体的药剂；运动疗法和饮食疗法。此种确定可用于确定炎症性肠病是否已复发。

在另一个实施方案中，根据本发明的用于确定炎症性肠病的方法包括使从正在接受治疗炎症性肠病的措施的受试者收集的样品和在受试者已经停止治疗炎症性肠病的措施后从该受试者收集的样品分别与内皮细胞蛋白C受体(EPCR)接触，测量两个样品中抗内皮细胞蛋白C受体抗体(抗-EPCR抗体)的量，并通过比较两个样品的测量值确定受试者中的炎症性肠病复发的风险。

如果在受试者已经停止治疗炎症性肠病的措施后从该受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量高于参考值，则可以确定该受试者处于复发炎症性肠病的高风险中。如果在受试者已经停止治疗炎症性肠病的措施之后从该受试者收集的样品中的抗EPCR抗体的量等于或低于参考值，则可以确定该受试者处于复发炎症性肠病的低风险。治疗炎症性肠病的措施包括诸如血管搭桥手术的手术；施用诸如5-氨基水杨酸制剂和类固醇制剂的抗炎药、免疫抑制药物和诸如抗TNF-α抗体的药剂；运动疗法和饮食疗法。此种确定可用于确定炎症性肠病复发的风险。

7、诊断探针

本申请还包括包含内皮细胞蛋白C受体(EPCR)的用于炎症性肠病的诊断探针。

炎症性肠病可以是引起肠炎症的任何疾病，优选溃疡性结肠炎或克罗恩病，更优选溃疡性结肠炎。

EPCR可以是具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质或是具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的蛋白质。“与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列”是指与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性，优选至少约95％同一性，更优选至少约98％同一性的氨基酸序列。优选地，根据本发明的EPCR是具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白质。

EPCR也可以是具有通过缺失、添加或取代SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的例如一个或两个或更多个(优选1至10，更优选1至5，还更优选1、2或3个)氨基酸形成的氨基酸序列的蛋白质。包含缺失、添加或取代的此种氨基酸序列中的缺失、添加或取代位置不受特别限制，只要保持蛋白质的活性。然而，缺失、添加或取代的位置优选不在对应于表位的氨基酸序列中。

8、诊断试剂盒

本申请还包括包含内皮细胞蛋白C受体(EPCR)的用于炎症性肠病的诊断试剂盒。

炎症性肠病可以是引起肠炎症的任何疾病，优选溃疡性结肠炎或克罗恩病，更优选溃疡性结肠炎。

EPCR可以是具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质或是具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的蛋白质。“与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列”是指与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性，优选至少约95％同一性，更优选至少约98％同一性的氨基酸序列。优选地，根据本发明的EPCR是具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白质。

EPCR也可以是具有通过缺失、添加或取代SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的例如一个或两个或更多个(优选1至10个，更优选1至5个，还更优选1、2或3个)氨基酸形成的氨基酸序列的蛋白质。包含缺失、添加或取代的此种氨基酸序列中的缺失、添加或取代位置不受特别限制，只要保持蛋白质的活性。然而，缺失、添加或取代的位置优选不在对应于表位的氨基酸序列中。

诊断试剂盒除了EPCR之外还可以含有用于检测抗体的量的反应中所必需的且与EPCR一起储存时不会不利地影响反应的其他物质，诸如各种试剂(例如，显色试剂、标记的二抗和封闭剂)。诊断试剂盒还可包含缓冲溶液、洗涤溶液和使用说明。

提供的EPCR(抗原蛋白)优选被固定在合适的固体支持物上。固体支持物的实例包括由不溶性多糖(例如琼脂糖、葡聚糖和纤维素)、合成树脂、玻璃或用于典型抗原-抗体反应的金属组成的各种支持物，诸如微孔板、管、膜、柱、珠、和传感器芯片。固定可以通过物理吸附或化学键合来完成，这通常用于使蛋白质不溶解或固定蛋白质。

根据本发明的诊断试剂盒可应用于例如炎症性肠病的诊断或炎症性肠病的临床测试(例如监测)，或靶向通过EPCR的信号转导的药物发现研究。

本说明书中引用的所有专利申请和文件的公开内容通过引用整体并入本文中。

尽管上面详细描述了本申请的实施方案，但是本申请不限于这些实施方案，并且基于本申请的技术思想的各种变化是可能的。

以下实施例更详细地描述了本发明。然而，本申请不限于这些实施例。

实施例

1、受试者

在Tohoku大学医院，根据健康和劳动科学研究基金支持的难治性疾病的策略研究项目的对难治性炎症性肠病的研究中描述的溃疡性结肠炎诊断标准(2017年1月21日修订)，从诊断患有溃疡性结肠炎的36名患者以及从79名健康受试者(对照)中收集血液样品。从受试者的静脉中收集血液并按照常规方法进行离心以获得血清，然后将血清储存在冰箱中直至使用。

2、流式细胞仪和抗体结合实验

EPCR的DNA序列(SEQ ID NO：2)通过PCR进行扩增并被插入pMX-GFP载体。使用Fugene用含有这些EPCR-GFP的逆转录病毒载体转染Plat E细胞以产生含有EPCR-GFP序列的逆转录病毒。然后用逆转录病毒感染大鼠骨髓瘤细胞以建立强力表达EPCR蛋白的细胞。每个强力表达EPCR蛋白的细胞都正在表达GFP。在将这些细胞与GFP阴性细胞混合后，使这些细胞与血清来源的IgG(一抗)和PE(藻红蛋白)-抗人IgG抗体(二抗)反应。随后，通过FACS通过比较GFP阳性组和GFP阴性组之间PE的荧光强度测量抗EPCR抗体活性。

测量了患有溃疡性结肠炎的患者的抗EPCR抗体滴度和健康受试者的滴度(图1)。纵轴表示与EPCR表达细胞结合的血清IgG和与EPCR非表达细胞结合的血清IgG的平均荧光强度(MFI)比率。在36名溃疡性结肠炎患者中的25名(约70％)中检测到抗EPCR抗体，而在健康受试者中未检测到抗EPCR抗体。患有溃疡性结肠炎的患者的抗EPCR抗体的量明显高于健康受试者的抗EPCR抗体的量(Mann Whitney试验)。

尽管还检查了受试者中抗SCARBI抗体的表达，但在患有溃疡性结肠炎的患者和健康受试者之间没有发现显著差异(数据未显示)。

序列表

<110> 东北大学

<120> 炎症性肠病的诊断方法、诊断标记物及诊断试剂盒

<130> FP213936JP

<130>

<150> JP 2019-156558

<151> 2019-08-29

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 238

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Leu Thr Thr Leu Leu Pro Ile Leu Leu Leu Ser Gly Trp Ala Phe

1 5 10 15

Cys Ser Gln Asp Ala Ser Asp Gly Leu Gln Arg Leu His Met Leu Gln

20 25 30

Ile Ser Tyr Phe Arg Asp Pro Tyr His Val Trp Tyr Gln Gly Asn Ala

35 40 45

Ser Leu Gly Gly His Leu Thr His Val Leu Glu Gly Pro Asp Thr Asn

50 55 60

Thr Thr Ile Ile Gln Leu Gln Pro Leu Gln Glu Pro Glu Ser Trp Ala

65 70 75 80

Arg Thr Gln Ser Gly Leu Gln Ser Tyr Leu Leu Gln Phe His Gly Leu

85 90 95

Val Arg Leu Val His Gln Glu Arg Thr Leu Ala Phe Pro Leu Thr Ile

100 105 110

Arg Cys Phe Leu Gly Cys Glu Leu Pro Pro Glu Gly Ser Arg Ala His

115 120 125

Val Phe Phe Glu Val Ala Val Asn Gly Ser Ser Phe Val Ser Phe Arg

130 135 140

Pro Glu Arg Ala Leu Trp Gln Ala Asp Thr Gln Val Thr Ser Gly Val

145 150 155 160

Val Thr Phe Thr Leu Gln Gln Leu Asn Ala Tyr Asn Arg Thr Arg Tyr

165 170 175

Glu Leu Arg Glu Phe Leu Glu Asp Thr Cys Val Gln Tyr Val Gln Lys

180 185 190

His Ile Ser Ala Glu Asn Thr Lys Gly Ser Gln Thr Ser Arg Ser Tyr

195 200 205

Thr Ser Leu Val Leu Gly Val Leu Val Gly Ser Phe Ile Ile Ala Gly

210 215 220

Val Ala Val Gly Ile Phe Leu Cys Thr Gly Gly Arg Arg Cys

225 230 235

<210> 2

<211> 717

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

atgttgacaa cattgctgcc gatactgctg ctgtctggct gggccttttg tagccaagac 60

gcctcagatg gcctccaaag acttcatatg ctccagatct cctacttccg cgacccctat 120

cacgtgtggt accagggcaa cgcgtcgctg gggggacacc taacgcacgt gctggaaggc 180

ccagacacca acaccacgat cattcagctg cagcccttgc aggagcccga gagctgggcg 240

cgcacgcaga gtggcctgca gtcctacctg ctccagttcc acggcctcgt gcgcctggtg 300

caccaggagc ggaccttggc ctttcctctg accatccgct gcttcctggg ctgtgagctg 360

cctcccgagg gctctagagc ccatgtcttc ttcgaagtgg ctgtgaatgg gagctccttt 420

gtgagtttcc ggccggagag agccttgtgg caggcagaca cccaggtcac ctccggagtg 480

gtcaccttca ccctgcagca gctcaatgcc tacaaccgca ctcggtatga actgcgggaa 540

ttcctggagg acacctgtgt gcagtatgtg cagaaacata tttccgcgga aaacacgaaa 600

gggagccaaa caagccgctc ctacacttcg ctggtcctgg gcgtcctggt gggcagtttc 660

atcattgctg gtgtggctgt aggcatcttc ctgtgcacag gtggacggcg atgttaa 717