一种高线性人血清淀粉样蛋白试剂盒、制备方法及应用与流程

1.本发明属于医学生物检测技术领域，具体涉及一种高线性人血清淀粉样蛋白试剂盒、制备方法及应用。


背景技术：

2.血清淀粉样蛋白a(serumamyloida,saa)是由活化的单核/巨噬细胞释放的细胞因子合成的载脂蛋白家族，为组织淀粉样蛋白a的前体物质，属急性时相反应蛋白。炎症、感染性和非感染性疾病期间，在血液中的浓度能在数小时内急剧升高。尤其是当病毒感染、心血管疾病、移植排斥反应时，saa的敏感性可高于crp，对临床诊断有更好的参考价值。
3.目前市面上saa的检测方法主要为生化免疫比浊的方法，其优点在于通量大，测试快，精准。然而saa抗原过剩(安全区)和线性范围是saa免疫比浊试剂盒最重要的性能指标之一。抗原过剩是免疫比浊试剂实现定量检测的前提和范围，即在抗原过剩范围内才可以定量报告结果，是线性范围的前提。抗原过剩范围是指高因hook效应，样本测定结果不低于线性范围上限的最高浓度值。重要的炎症标志物血清淀粉样蛋白a，线性范围上限一般要达到320mg/l或是更高，抗原过剩范围不低于1000mg/l。增加抗体使用量在一定范围内可以提高线性和抗原过剩范围，但在其他条件不变情况下，该方案即提高了试剂成本，又只能在较小幅度使用。同时由于增加抗体量带来的微球表面抗体密度提高，会导致试剂灵敏度提升。在检测系统检测范围有限的情况下，灵敏度和线性范围互相制约，当灵敏度高到一定程度后，就算降低增敏剂用量至零，仍然会因为生化仪吸光度检测范围有限，生化仪无法区分高浓度样本的信号差异，限制了线性范围和抗原过剩范围。样本量减少，在仪器技术无重大突破情况下，也是有限度的，而且减少样本量，试剂灵敏度将大幅度降低。本发明的目的是解决上述问题，提供一种高线性人血清淀粉样蛋白试剂盒、制备方法及应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种高线性人血清淀粉样蛋白试剂盒、制备方法及应用，在不增加原料成本，适用范围广，有效减少了宽线性高saa抗原过剩的难度。提高胶乳免疫比浊试剂性能，降低试剂成本。
5.本发明提供了如下的技术方案：一种高线性人血清淀粉样蛋白试剂盒，包括试剂r1、试剂r2和saa校准品，其中，所述试剂r2内包括由收敛聚合的聚苯乙烯胶乳微球构成的收敛聚合聚苯乙烯微球；
6.所述收敛聚合聚苯乙烯微球的制备方法包括如下步骤：
7.步骤1、将500ml胶乳溶液中加入去离子水进行错流过滤，再通过50kd截留孔径超滤膜包加入离子水进行错流过滤，完成5～20倍换液，去除残留的苯乙烯以及羧基单体；
8.步骤2、将置换蒸馏水后的胶乳溶液加入到反应釜中，加入0.5～2.3g氯化铯和0.1～1.6g十二烷基苯磺酸钠并搅拌混匀，反应釜放在恒温水浴锅中，保持50℃的恒温，300rpm机械搅拌20min；
9.步骤3、然后通入氩气去除氧气10min，加入0.1～0.5g过硫酸钾，二次引发微球内部的收敛聚合反应。
10.进一步的，所述试剂r1包括如下组分：磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、peg6000、吐温～20和曲拉通101；可选地，试剂r1包括下述浓度的组分：1.01～6.44g/l的磷酸氢二钠、0.24～5.24g/l的磷酸二氢钾、1.0～30.0g/l的氯化钠、0.2～5.5g/l的氯化钾、3～25g/l的peg600、0.5～4.0g/l的吐温～20和0～4.0g/l曲拉通101；
11.和/或，所述试剂r2包括如下组分：收敛聚合聚苯乙烯微球、saa单克隆抗体081和saa单克隆抗体082、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾和bsa，可选地，所述试剂r2包括下述浓度的组分：0.15％～0.35％的收敛聚合聚苯乙烯微球、40～80mg/lsaa单克隆抗体081、40～80mg/lsaa单克隆抗体082、1.01～6.44g/l的磷酸氢二钠、0.24～5.24g/l的磷酸二氢钾、1.0～20.0g/l的氯化钠、0.2～5.5g/l的氯化钾和5～30g/l的bsa；
12.和/或，所述校准品包括如下组分：血清淀粉样蛋白a抗原。
13.更优选地，所述试剂r1包括下述浓度的组分：1.24～6.44g/l的磷酸氢二钠、0.24～3.9g/l的磷酸二氢钾、1.0～30.0g/l的氯化钠、1.01～2.8g/l的氯化钾、3～15g/l的peg6000、0.5～4.0g/l的吐温～20和0.5～4.0g/l曲拉通101。
14.更优选地，所述试剂r2包括下述浓度的组分：0.15％～0.35％的收敛聚合聚苯乙烯微球、40～80mg/l的saa单克隆抗体081、40～80mg/l的saa单克隆抗体082、0.06～0.3g/l1.01～6.44g/l的磷酸氢二钠、1.01～5.24g/l的磷酸二氢钾、1.0～20.0g/l的氯化钠、1.21～3.2g/l的氯化钾、和5～30g/l的bsa。
15.本发明还提出了一种血清淀粉样蛋白a测定方法的应用，使用高线性人血清淀粉样蛋白试剂盒采用免疫比浊法对血清淀粉样蛋白a测定的应用。
16.进一步的，应用免疫比浊法的血清淀粉样蛋白a的测定方法，具体包括如下：
17.(1)、设置生化分析仪的参数，并加入样本s和试剂r1，然后混匀，置37℃孵育300秒，之后加入试剂r2并混匀，置37℃孵育15～35秒，测定波长下的吸光度值a1，反应255～305秒，测定波长下的吸光度值a2；
18.(2)、分别计算校准品的吸光度变化值δa，并绘制校准曲线，校准曲线使用多点非线性spline拟合；
19.(3)、将样本测定的吸光度变化值按拟合的公式进行计算，即可得出样本中血清淀粉样蛋白a的浓度δa，
20.δa＝a2
‑
a1，
21.其中，a1和a2分别为加入试剂r1与样品的吸光度a1和当加入r2后的吸光度值a2。
22.更优先地，所述应用胶乳免疫比浊法的血清淀粉样蛋白a的测定方法的优选参数为：样本s为2～4μl、试剂r1为200μl、试剂r2为50μl。
23.更优选地，所述应用胶乳免疫比浊法的血清淀粉样蛋白a的测定方法的反应方法为spline终点法，反应方向为向上，主波长为546/600nm。
24.本发明的有益效果是：本发明所提供的一种高线性范围血清淀粉样蛋白试剂盒，从胶乳颗粒层面入手，通过相对简单的可放大工艺，直接对胶乳颗粒进行了二次收敛聚合改进，并涉及抗体亲和力改进，不增加原料成本，适用范围广，有效减少了宽线性高saa抗原过剩的难度。而且该技术可以结合以往其他技术使用，提高胶乳免疫比浊试剂性能，降低试
剂成本。
附图说明
25.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
26.图1是本发明中实施例1、实施例2、实施例3关于校准品不同浓度下对应的δa值；
27.图2是本发明中实施例1的标准曲线图；
28.图3是本发明中实施例2的标准曲线图；
29.图4是本发明中实施例3的标准曲线图；
30.图5是本发明中实施例1关于不同的稀释浓度样本下的线性范围测试图表；
31.图6是本发明中实施例2关于不同的稀释浓度样本下的线性范围测试图表；
32.图7是本发明中实施例3关于不同的稀释浓度样本下的线性范围测试图表；
33.图8是本发明中关于实施例1、实施例2、实施例3的hook图；
具体实施方式
34.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明所要求保护范围的限定。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
35.实施例1
36.一种高线性人血清淀粉样蛋白试剂盒，包括：试剂r1、试剂r2和校准品；
37.该试剂盒采用胶乳免疫比浊法，血清淀粉样蛋白a单克隆抗体吸附在乳胶颗粒上，可与样本中的血清淀粉样蛋白a产生凝集反应，形成抗原抗体复合物，其浊度的变化通过测定特定波长，在本实施例中为546nm的吸光度值，即可计算出样本中血清淀粉样蛋白a的浓度。
38.其中，试剂r1包括1.01g/l的磷酸氢二钠、1.51g/l的磷酸二氢钾、1.0g/l的氯化钠、1.01g/l的氯化钾、2g/l曲拉通101、5g/l的peg6000和1.1g/l的吐温
‑
20。
39.试剂r2包括0.15％的收敛聚合聚苯乙烯微球、40mg/lsaa单克隆抗体081、40mg/lsaa单克隆抗体082、1.01g/l的磷酸氢二钠、1.51g/l的磷酸二氢钾、1.0g/l的氯化钠、1.01g/l的氯化钾和5g/l的bsa。
40.收敛聚合聚苯乙烯微球的制备方法：将500ml胶乳溶液中加入去离子水进行错流过滤,通过50kd截留孔径超滤膜包加入离子水进行错流过滤，完成15倍换液，去除残留的苯乙烯以及羧基单体；将置换蒸馏水后的胶乳溶液加入到反应釜中，加入0.6g氯化铯和0.23g十二烷基苯磺酸钠并搅拌混匀,反应釜放在恒温水浴锅中，保持50℃的恒温，300rpm机械搅拌20min；然后通入氩气去除氧气10min，加入0.16g过硫酸钾，二次引发微球内部的收敛聚合反应。
41.实施例2
42.一种高线性人血清淀粉样蛋白试剂盒，包括：试剂r1、试剂r2和校准品；
43.该试剂盒采用胶乳免疫比浊法，血清淀粉样蛋白a单克隆抗体标记在聚苯乙烯微
球上，可与样本中的血清淀粉样蛋白a产生凝集反应，形成抗原抗体复合物，其浊度的变化通过测定特定波长，在本实施例中为600nm的吸光度值，即可计算出样本血清淀粉样蛋白a的浓度。
44.其中，试剂r1包括6.44g/l的磷酸氢二钠、5.24g/l的磷酸二氢钾、20.0g/l的氯化钠、5.5g/l的氯化钾、25g/l的peg6000和4.0g/l的吐温
‑
20。
45.试剂r2包括0.2％的收敛聚合的聚苯乙烯微球、60mg/lsaa单克隆抗体081、60mg/lsaa单克隆抗体082、6.44g/l的磷酸氢二钠、5.24g/l的磷酸二氢钾、20.0g/l的氯化钠、5.5g/l的氯化钾和20g/l的bsa。
46.收敛聚合聚苯乙烯微球的制备方法：将500ml胶乳溶液中加入去离子水进行错流过滤,通过50kd截留孔径超滤膜包加入离子水进行错流过滤，完成20倍换液，去除残留的苯乙烯以及羧基单体；将置换蒸馏水后的胶乳溶液加入到反应釜中，加入1.2g氯化铯和0.4g十二烷基苯磺酸钠并搅拌混匀,反应釜放在恒温水浴锅中，保持50℃的恒温，300rpm机械搅拌20min；然后通入氩气去除氧气10min，加入0.20g过硫酸钾，二次引发微球内部的收敛聚合反应。
47.实施例3
48.一种高线性人血清淀粉样蛋白试剂盒，包括：试剂r1、试剂r2和校准品；
49.该试剂盒采用胶乳免疫比浊法，血清淀粉样蛋白a单克隆抗体白标记在聚苯乙烯微球上，可与样本中的血清淀粉样蛋白a产生凝集反应，形成抗原抗体复合物，其浊度的变化通过测定特定波长，在本实施例中为600nm的吸光度值，即可计算出样本中血清淀粉样蛋白a的浓度。
50.其中，试剂r1包括1.44g/l的磷酸氢二钠、0.24g/l的磷酸二氢钾、8.0g/l的氯化钠、0.2g/l的氯化钾、4g/l曲拉通101、10g/l的peg6000、1g/l的吐温
‑
20组成。
51.试剂r2包括0.2％的收敛聚合聚苯乙烯微球、80mg/lsaa单克隆抗体081、80mg/lsaa单克隆抗体082、1.44g/l的磷酸氢二钠、0.24g/l的磷酸二氢钾、8.0g/l的氯化钠、0.2g/l的氯化钾、10g/l的bsa组成。
52.收敛聚合聚苯乙烯微球的制备方法：将500ml胶乳溶液中加入去离子水进行错流过滤,通过50kd截留孔径超滤膜包加入离子水进行错流过滤，完成20倍换液，去除残留的苯乙烯以及羧基单体；将置换蒸馏水后的胶乳溶液加入到反应釜中，加入1.2g氯化铯和0.4g十二烷基苯磺酸钠并搅拌混匀,反应釜放在恒温水浴锅中，保持50℃的恒温，300rpm机械搅拌20min；然后通入氩气去除氧气10min，加入0.20g过硫酸钾，二次引发微球内部的收敛聚合反应。
53.以上案例中的校准品都是由重组血清淀粉样蛋白a配置而成。
54.本发明还提出了一种血清淀粉样蛋白a测定方法的应用，使用高线性人血清淀粉样蛋白试剂盒采用免疫比浊法对血清淀粉样蛋白a测定的应用。
55.测定前需要准备材料
56.选用日立7180型生化分析仪、湘仪h1650台式高速离心机、10
‑
100μl、100
‑
1000μl移液器、加样枪头、ep管、生化杯、一次性塑胶手套、试管架。
57.应用免疫比浊法的血清淀粉样蛋白a的测定方法，具体包括如下：
58.(1)、在日立7180型生化分析仪上设置参数，2ul样本s、200μl试剂r1、50μl试剂r2，
试剂r1、样本s的孵育时间为300秒，试剂r1、样本s和试剂r2的孵育时间为35秒，试剂r1、样本s和试剂r2反应时间为305秒，反应方法为spline终点法，反应方向为向上，反应温度为37℃，主波长为546/600nm。并将试剂r1和试剂r2放入试剂盘中相应位置。校准使用spline方法拟合。
59.(2)、吸取校准品1
‑
6各100μl于生化杯中，将装有校准品的生化杯放入日立7180型生化分析仪的校准盘中，选中并开始校准。仪器将会自动开始校准程序并输出校准曲线。
60.(3)、校准完成后，吸取待测样本各100μl于生化杯中，将装有待测样本的生化杯放入日立7180型生化分析仪的样本盘中，点击开始，仪器将会自动测定样本在546nm下的吸光度，并根据校准曲线自动输出结果，即样本对应的浓度值δa(参见图1)，根据浓度值δa在绘制出标准曲线图(参见图2
‑
4所示)。
61.本领域技术人员可以根据自行调整上述参数，以适应后续标记反应需要。
62.完成收敛聚合反应后胶乳溶液中胶乳的粒径d2＝0.78d，d为收敛聚合反应前胶乳溶液中胶乳的粒径。所得胶乳相对同粒径未通过收敛聚合反应处理的胶乳，有效减缓了测定高浓度样本时，胶乳免疫比浊反应中抗原抗体反应速度，降低了试剂高浓度区域灵敏度，这种方式低端灵敏度降低不明显，非常有效的提升了胶乳免疫比浊试剂的线性范围。
63.用低值样本0.37mg/l(l)与高值样本320/640mg/l(h)分别制成(5l,4l+1h,3l+2h,2l+3h,l+4h,5h)共6个不同的稀释浓度样本。使用实施例1、实施例2和实施例3中制备的试剂分别对这些样本进行测试，每个稀释浓度测试3次，求出每个稀释浓度检测结果的均值。测量结果(参见图5
‑
7所示)，并根据测量结果绘制出hook图(参见图8所示)。实施案例2的线性范围上线可达到640mg/l。
64.本发明的一种高线性人血清淀粉样蛋白(saa)试剂盒，从胶乳颗粒层面入手，通过相对简单的可放大工艺，直接对胶乳颗粒进行了二次收敛聚合改进，并涉及抗体亲和力改进，不增加原料成本，适用范围广，有效减少了宽线性高saa抗原过剩的难度。而且该技术可以结合以往其他技术使用，提高胶乳免疫比浊试剂性能，降低试剂成本。
65.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。