骨肉瘤早期筛查与检测方法、血清蛋白标志物、试剂盒与流程

1.本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种骨肉瘤早期筛查与检测方法、血清蛋白标志物、试剂盒。


背景技术：

2.目前，骨肉瘤(osteosarcoma，os)，恶性成骨细胞产生的骨样组织，是由原始骨形成间充质细胞产生的最常见的高度恶性的原发性骨肿瘤。并且由于初始症状不具有特异性且发病隐匿，组织损伤或创伤不明显，通常会被忽视而误诊，造成致命的结果。手术切除和化学药物治疗等治疗方式是骨肉瘤的治疗手段，但是疾病最初的症状往往特异性很不显著，且起病隐匿，患者通常对此不会太在意。大多数os都是在疾病处于相对较晚期时才被诊断出来，此时疾病的恶性特征会非常明显。临床症状、影像学表现和组织样本活检是很多医师进行os诊断时的检查方式。os早期症状不明显，且影像学检查往往会被忽略，而组织样本活检具有创伤性，且对患者而言有一定的经济负担，诊断的准确性因样本取材的不同和观察者的不同而有差别，从而造成临床预测价值不明确。此外，活检取材的操作不当是造成误诊、截肢和局部复发的常见原因，并且也会降低生存率。而现今os的生物学标志物在诊断早期恶性肿瘤、指导个体化治疗的干预和预测疾病结局方面的应用和临床证据方面仍然不充分。国内外研究者们在骨肉瘤肿瘤标志物层面进行了大量研究，致力于为骨肉瘤的分子诊断以及术后个体化治疗方案的制定等提供重要的理论依据。
3.近年来，在人类肿瘤学的研究领域内，许多研究已经发现肿瘤患者血清中含有一组独特的诱发自身抗体反应的细胞蛋白，被称为肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，taa)，其诱导产生的抗体称为抗taa-自身抗体(autoantibody)。诱导这些自身抗体反应的细胞蛋白的类型多种多样。很多靶向抗原均为细胞蛋白，如p53，其异常调节或过度表达均会导致肿瘤。对于mrna结合蛋白p62而言，其被称为成人组织中缺失的甲胎蛋白，在肿瘤细胞中免疫原性会导致p62的异常表达。某些肿瘤患者的免疫系统具有感知这些自身抗原异常的能力，并相应产生自身抗体。研究表明，使用多种taas组合可以大大提高自身抗体的检测效率。譬如，由14种全长的重组蛋白组成的微阵列，是由cdnas编码，包括survivin、caperα、rala、p62、koc、mdm2、cyclin b1、p53、14-3-3ζ、p90、imp1、c-myc、npm1和p16，并且专门用于检测hcc。这14种自身抗体的频率存在波动，在hcc其波动范围是5.6％-21.1％。然而，随着不断累加自身抗体的个数，最后当数量达到了14个时在hcc阳性抗体反应率逐步增加到了69.7％。事实上，对任何单个抗原的自身抗体，如抗-p53、抗-p62或者抗-c-myc的灵敏度水平尚不能用于肿瘤的常规诊断。这些数据说明多个taas组合后可能会使肿瘤的血清学诊断的灵敏度更高。另一方面，这些数据也说明了在选择不同的taa-抗体系统时，有些taas或许会对某些特定类型的肿瘤更具特异性。使用特制的taa组合可以识别鉴定出特定的自体抗体图谱，从而对不同类型的肿瘤进行鉴别诊断，这是一种有应用潜力的肿瘤筛查方法。
4.十余年来的研究学者一直试图寻找诊断骨肉瘤更加敏感特异的抗taa自身抗体，
优化诊断骨肉瘤的组合。寻找有价值的taa自身抗体，常用的方法有两种：一是重组cdna表达文库血清学筛选(serological analysis of recombinant cdna expression libraries，serex)；另一种是蛋白质组学技术。与serex相比，蛋白组学技术能够对多个肿瘤血清进行筛选，并且能够筛选出具有翻译后修饰的taa。随着蛋白质组学技术的发展进步，使得骨肉瘤领域步入了采用蛋白质组学技术来对血清生物标志物进行识别鉴定，由此做到肿瘤早期无创诊断和监测肿瘤进展的时代。
5.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
6.(1)目前临床上应用的诊断骨肉瘤的技术如病理学检查和影像学检查等具有侵入性和创伤性。
7.(2)目前缺乏有效诊断早期骨肉瘤的血清学检测技术。
8.(3)目前临床上采用的诊断骨肉瘤的血清学生物标志物的灵敏度和特异度都不尽如人意，鉴定准确率低。
9.解决以上问题及缺陷的难度为：
10.为了获得准确的诊断，临床检测过程中必不可少的会对人体造成一定程度的损伤，为了辅助临床筛查，血清学检查更为方便快捷且创伤小，而且必须兼顾灵敏度和特异度，这样才能提高诊断骨肉瘤的准确率。
11.解决以上问题及缺陷的意义为：
12.(1)为骨肉瘤的早期诊断提供了一种新的临床辅助血清学检测方法。
13.(2)这种血清学检测方法对早期诊断骨肉瘤具有灵敏度高、特异性强、成本低等特点。
14.(3)这种血清学检测方法操作简单、快捷、成本低等优点。


技术实现要素：

15.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种骨肉瘤早期筛查与检测方法、血清蛋白标志物、试剂盒。
16.本发明是这样实现的，一种用于骨肉瘤早期筛查和诊断的联合检测血清蛋白标志物，由eno1、gapdh和tpi1共3种蛋白(可经过市场渠道购买相应蛋白)组成。
17.本发明的另一目的在于提供一种包含所述用于骨肉瘤早期筛查和诊断的联合检测血清蛋白标志物的骨肉瘤早期筛查和诊断试剂盒，所述骨肉瘤早期筛查和诊断试剂盒设置有：
18.包被于固相载体上的用于骨肉瘤早期筛查和诊断的联合检测血清蛋白标志物。
19.进一步，所述固相载体材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种。
20.进一步，所述固相载体可以为凹孔平板、试管、球粒的其中一种。
21.进一步，所述骨肉瘤早期筛查和诊断试剂盒还包括：
22.对照血清、阴性对照血清、封闭液、样本稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。
23.本发明的另一目的在于提供一种基于所述骨肉瘤早期筛查和诊断试剂盒的骨肉瘤早期筛查与检测方法，所述骨肉瘤早期筛查与检测方法包括：
24.步骤一，对用于骨肉瘤早期筛查和诊断的联合检测血清蛋白标志物进行包被，封闭后清洗；
25.步骤二，与待检测血清进行一抗孵育，清洗，再进行二抗孵育，再清洗；待显色系统显色后终止反应，测定吸光度值；
26.步骤三，以od
405
为相对od值，去除空白对照，基于各个指标的吸光度值计算预测概率p值大小；
27.步骤四，基于计算的预测概率p值大小得到骨肉瘤早期筛查与检测结果。
28.进一步，步骤二中，所述二抗孵育中使用的二抗为hrp标记的羊抗人igg。
29.进一步，步骤三中，所述预测概率p值大小计算公式如下：
30.pre(p＝os，3taas)＝1/(1+exp(-(-6.679+9.686
×
od
eno1
+17.286
×
od
gapdh
+11.178
×
od
tpi1
)))；
31.其中，od
eno1
、od
gapdh
、od
tpi1
分别表示各个指标的相对od值减去空白对照后的吸光度值。
32.进一步，步骤四中，所述基于计算的预测概率p值大小得到骨肉瘤早期筛查与检测结果包括：
33.当p值≥0.5时，则初步判定为疑似骨肉瘤样品；当p值＜0.5时，初步判定为正常样品。
34.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明基于血清蛋白质组学(serpa)技术，将蛋白质组学技术与血清学研究相结合，可以全面、动态地分析患者血清样品中蛋白质种类及数量的改变，尤其是与肿瘤相关的低丰度的蛋白质，从而发现大量有诊断价值的标志蛋白。通过serpa初步筛选出骨肉瘤的早期检测血清蛋白标志物，再经过elisa实验进行验证，最终筛选出可用于骨肉瘤早期筛查和诊断的一组骨肉瘤联合检测血清蛋白标志物，其包括eno1、gapdh和tpi1共3种蛋白，可辅助骨肉瘤的临床诊断，具有灵敏度高、特异性强、操作简便、成本低等优点。
35.本发明采用elisa的方法操作方便快捷，成本低。本发明基于血清蛋白质组学，用以筛选潜在的可用于诊断或其他表征肿瘤的标志物。本发明先通过血清蛋白质组学初步筛选出骨肉瘤的早期检测血清蛋白标志物，再经过elisa实验进行验证，最终筛选出可用于骨肉瘤早期筛查和诊断的一组骨肉瘤联合检测血清蛋白标志物，其包括eno1、gapdh和tpi1共3种蛋白，可辅助骨肉瘤的临床诊断，具有较好的参考价值。
36.本发明中包含上述3种血清蛋白标志物的试剂盒可用于骨肉瘤的早期筛查和诊断，其检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低等特点，且操作简单、快捷，可为骨肉瘤的早期筛查提供依据。
附图说明
37.为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对本技术实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
38.图1是本发明实施例提供的骨肉瘤早期筛查与检测方法流程图。
39.图2是本发明实施例提供的serpa流程图。
40.图3是本发明实施例提供的elisa原理图。
41.图4是本发明实施例提供的单个指标的roc曲线图。
42.图5是本发明实施例提供的单个指标的od值散点图。
43.图6是本发明实施例提供的三种自身抗体联合对骨肉瘤的诊断价值示意图。
具体实施方式
44.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
45.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于骨肉瘤早期筛查和诊断的联合检测血清蛋白标志物、试剂盒，下面结合附图对本发明作详细的描述。.本发明实施例提供的用于骨肉瘤早期筛查和诊断的联合检测血清蛋白标志物由eno1、gapdh和tpi1共3种蛋白组成。
46.本发明实施例提供的骨肉瘤早期筛查和诊断试剂盒设置有：
47.包被于固相载体上的用于骨肉瘤早期筛查和诊断的联合检测血清蛋白标志物。
48.本发明实施例提供的固相载体材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种。
49.本发明实施例提供的固相载体可以为凹孔平板、试管、球粒的其中一种。
50.本发明实施例提供的骨肉瘤早期筛查和诊断试剂盒还包括：
51.对照血清、阴性对照血清、封闭液、样本稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合
52.如图1所示，本发明实施例提供的骨肉瘤早期筛查与检测方法包括以下步骤：
53.s101，对用于骨肉瘤早期筛查和诊断的联合检测血清蛋白标志物进行包被，封闭后清洗；
54.s102，与待检测血清进行一抗孵育，清洗，再进行二抗孵育，再清洗；待显色系统显色后终止反应，测定吸光度值；
55.s103，以od
405
为相对od值，去除空白对照，基于各个指标的吸光度值计算预测概率p值大小；
56.s104，基于计算的预测概率p值大小得到骨肉瘤早期筛查与检测结果。
57.步骤s102中，本发明实施例提供的二抗孵育中使用的二抗为hrp标记的羊抗人igg。
58.步骤s103中，本发明实施例提供的预测概率p值大小计算公式如下：
59.pre(p＝os，3taas)＝1/(1+exp(-(-6.679+9.686
×
od
eno1
+17.286
×
od
gapdh
+11.178
×
od
tpi1
)))；
60.其中，od
eno1
、od
gapdh
、od
tpi1
分别表示各个指标的相对od值减去空白对照后的吸光度值。
61.步骤s104中，本发明实施例提供的基于计算的预测概率p值大小得到骨肉瘤早期筛查与检测结果包括：
62.当p值≥0.5时，则初步判定为疑似骨肉瘤样品；当p值＜0.5时，初步判定为正常样品。
63.下面结合具体实施例对本发明的技术效果作进一步描述。
64.实施例1：
65.1血清样本的准备
66.1.1用于进行serpa的血清样本
67.收集在河南省洛阳正骨医院原发性骨肉瘤患者(骨肉瘤经病理诊断)，患者同意以及机构审查委员会和医院伦理委员会批准。所有标本均用红头采血管采集研究对象全血5～10ml，在室温放置2小时后，1000g离心15分钟，取上清液，每个样本分装若干份贴好标签于-80℃低温冰箱保存，避免反复冻融。
68.根据流行病学分析，从最终收集的51例原发性骨肉瘤以及同时期体检的51例正常对照血清进行初步芯片筛选。51例原发性骨肉瘤患者中，共有男性33(64.7％)例，女性18(35.3％)例，平均年龄为24.9
±
14.3岁，年龄范围为4-64岁；51例正常血清中，有男性33(64.7％)例，女性18(35.3％)例，平均年龄为26.4
±
13.4，年龄范围为5-59岁。所有骨肉瘤患者血清都是在患者最初诊断为骨肉瘤尚未接受任何放化疗及手术治疗时收集的。正常人血清来自参加年度健康体检，无任何恶性肿瘤症状的体检人群。
69.经1-d western blot检测从上述样本中筛选11例具有代表性的未经任何治疗且具有很强免疫活性的骨肉瘤患者血清，并以5个正常对照的混合血清作为对照进行serpa实验分析。
70.1.2用于进行elisa实验验证的血清样本(同上)
71.收集在河南省洛阳正骨医院原发性骨肉瘤患者(骨肉瘤经病理诊断)，患者同意以及机构审查委员会和医院伦理委员会批准。所有标本均用红头采血管采集研究对象全血5～10ml，在室温放置2小时后，1000g离心15分钟，取上清液，每个样本分装若干份贴好标签于-80℃低温冰箱保存，避免反复冻融。
72.根据流行病学分析，最终收集52例原发性骨肉瘤、28例骨软骨瘤以及同时期体检的51例正常对照血清进行初步芯片筛选。52例原发性骨肉瘤患者中，共有男性33(64.7％)例，女性18(35.3％)例，平均年龄为24.9
±
14.3岁，年龄范围为4-64岁；28例骨软骨瘤中，有男性19(67.9％)例，女性9(32.1％)例，平均年龄为17.2
±
12.0，年龄范围为4-52岁；51例正常血清中，有男性33(64.7％)例，女性18(35.3％)例，平均年龄为26.4
±
13.4，年龄范围为5-59岁。所有骨肉瘤及骨软骨瘤患者血清都是在患者最初诊断为骨肉瘤或骨软骨瘤尚未接受任何放化疗及手术治疗时收集的。正常人血清来自参加年度健康体检，无任何恶性肿瘤症状的体检人群。
73.2 serpa用于筛选骨肉瘤诊断标志物
74.实验原理参见图2。
75.2.1实验所需试剂：
76.1)1m tris-hcl(ph 8.0、ph 6.8)(1l)
77.称量121.1g tris-base于1l的烧杯中，加入800ml去离子水，使用盐酸调ph，定容至1l，4度冰箱保存。
78.2)30％丙烯酰胺
79.称取290g丙烯酰胺和10g n，n
’‑
亚甲双丙烯酰胺，加去离子水定容至1l。
80.3)10％sds(10ml)
81.称取sds 1g，加去离子水定容至10ml，溶解后室温保存。
82.4)10％过硫酸铵(aps)(10ml)
83.称取1g过硫酸铵，加去离子水定容至10ml，溶解后4度保存，现用现配。
84.5)4
×
loading sample buffer(lsb，50ml)
85.量取12ml 60mm tris-hcl(ph＝6.8)，20ml甘油，10mlβ-巯基乙醇，4g sds，0.04g溴酚蓝，充分溶解混匀。
86.6)5
×
tris-甘氨酸电泳缓冲液(1l)
87.称取tris-base 15.1g，甘氨酸94g，sds 5g，溶解于1l去离子水中，室温保存备用。稀释至1
×
tris-甘氨酸电泳缓冲液用于电泳实验。
88.7)转膜缓冲液(1l)
89.称取tris-base 3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，加水定容至1l，4度保存。
90.8)丽春红s(1l)
91.称取丽春红s固体1g，冰醋酸50ml，加水定容至1l，室温保存。
92.9)10
×
pbst(1l)
93.称量28.8g na2hpo4·
12h2o，81.8g nacl，3.1g nah2po4·
2h2o，量取5ml tween-20，加去离子水定容至1l，室温保存。
94.10)封闭液
95.称取5g脱脂奶粉，加入到1
×
pbst 100ml，溶解后4度保存。
96.11)2de washing buffer(100ml)
97.量取1m tris-hcl 1ml，蔗糖8.55g，加去离子水约80ml，调ph至7.0，然后定容至100ml。
98.12)胶条平衡缓冲液母液(100ml)
99.量取25ml 1.5m tris-hcl(ph＝8.8)，20ml甘油，称量360g尿素，2g sds，加去离子水定容至100ml。
100.13)胶条平衡缓冲液i(10ml)
101.量取10ml胶条平衡缓冲液母液，0.2g dtt，混匀后备用。现用现配。
102.14)胶条平衡缓冲液ii(10ml)
103.量取10ml胶条平衡缓冲液母液，0.25g iaa，混匀后备用。现用现配。
104.15)考马斯亮蓝r250染色液(1l)
105.称量1g考马斯亮蓝r250，异丙醇250ml，冰乙酸100ml，加去离子水定容至1l。
106.16)脱色液(1l)
107.量取300ml甲醇，100ml冰乙酸，加去离子水定容至1l。
108.2.2 serpa具体实验步骤
109.2.2.1.筛选阳性血清，具体步骤如下：
110.1)培养u2-os和saos-2细胞，收集的细胞用pbs洗三遍，加入1*lsb进行裂解，将样品用恒温金属浴100℃加热10min以变性蛋白。
111.2)准备sds-page胶，插入带有一个小孔和一个大孔的梳子。大孔中加入处理好的
细胞样品，每孔200μl，小孔中加入蛋白marker，每孔3μl。放入电泳槽内，加入电泳缓冲液。
112.4)对获得的sds-page凝胶，使用半干转的方法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，条件设为70v，2小时。将电转后的硝酸纤维素膜使用丽春红s染色，观察转膜效果。
113.3)将所有研究对象的血清使用含3％脱脂奶粉的pbst溶液以1∶200的比例稀释，并转移到多通道一抗孵育盒中。将封闭好的硝酸纤维素膜裁剪成约3mm宽的小条，标记后放入各血清槽中进行一抗孵育，在侧摆摇床上4℃过夜孵育。
114.4)pbst洗膜五次，1∶10000稀释的hrp标记山羊抗人igg室温孵育1小时后，pbst洗膜五次。
115.6)发光、显影、洗片后观察记录阳性反应条带和血清。
116.2.2.2.培养u2-os和saos-2细胞，提取总蛋白，具体步骤如下：
117.1)收集的细胞用pbs洗三遍，弃上清，冰上放置。
118.2)应用1ml的2dewashingbuffer重悬细胞，标记1.5ml离心管并称重，将重悬液转移至该离心管中，6000g离心4min。弃上清，加入1ml2dewashingbuffer重悬，再次6000g离心4min。
119.3)弃上清，将管子倒扣在纸上扣几下，并用无纸屑的纸吸取残余液体。或者晾干几分钟，但是必须保持细胞的湿润。称离心管的重量，计算细胞群的净重。
120.4)计算2-d裂解液的用量(ud＝净重g*8*1000，取适量的2-d裂解液重悬细胞，室温放置于振荡器上剧烈震荡90min，震荡速度280rpm。
121.5)对1.5ml的离心管内的细胞于冰上进行超声破碎，超声功率为120w，每次超声2s，间隔8s，共计超声五次。
122.6)超声过的样品以16000g转速4度离心20min。
123.7)吸取上清，测定蛋白浓度，放入-20度备用。
124.2.2.3.一向等电聚焦电泳
125.1)ipg胶条的水化：用2drehydrationbuffer稀释蛋白，每个胶条最大蛋白载量为150μg，125μl体积。因此需要计算蛋白上样量，150/蛋白浓度(微克每微升)+2-drehydrationbuffer＝125μl，用移液器吸取125μl加入到水化槽，从槽的一边(从距离最左边1厘米处开始)均匀缓慢的加入液体，避免产生气泡。从-20度取出胶条，胶面向下，从左边缓慢的放入水化槽内，室温放置1小时。然后加入矿物油1ml，室温水化16h。
126.3)水化结束后，准备好电泳槽，用镊子取出两片专用的滤纸浸入2d水中，放入电泳槽两端，压在金属丝上。用镊子将ipg胶条从水化槽内取出，空掉矿物油。胶条朝下，正极对应正极，负极对应负极，每个胶条加入1ml矿物油，胶条所在永道的旁侧泳道也加入1ml的矿物油，盖上电泳槽的盖子，放到等电聚焦的电泳仪上，正电极对应正极，负电极对应负极。
127.4)打开等电聚焦电泳仪的开关，按照下述程序设置：
128.step1250v，30min，线性
129.step24000v，1.5h，线性
130.step34000v，25000v-hr，快速
131.step4500v，任意时间，快速
132.设置所放置胶条数为3，每根胶条的极限电流50μa/根，等电聚焦时的温度为20℃。
133.5)一向等电聚焦(ief)后的胶条接着用于二向电泳。亦可将胶条取出，控干油，放
入新的水化槽内，盖上盖子，放入-80度即可。制备双向sds-page胶。
134.2.2.4.二向sds-page凝胶电泳
135.1)从-80度取出ipg胶条，室温溶解15min。
136.2)将1ml的平衡缓冲液i加入到胶条槽内，盖上盖子，水平摇床10min，倒掉平衡缓冲液，再加1ml的平衡缓冲液i到胶条槽内，水平摇床10min，倒掉平衡缓冲液，1ml的平衡缓冲液ii加入到胶条槽内，盖上盖子，水平摇床10min，倒掉平衡缓冲液，再加1ml的平衡缓冲液ii到胶条槽内，水平摇床10min。
137.准备1*sds running buffer，用量筒量取sds-page胶1*sds running buffer(用于漂洗胶条)，镊子，剪刀，手术用的夹子，加了溴酚蓝的琼脂糖凝胶。
138.3)准备sds-page胶，拔掉梳子，向凝胶孔中加入水。平衡后的胶条，用1*sds缓冲液漂洗。用镊子夹住胶条和梳子的大孔进行比对，找准固定剪切位点，一般为胶两端鼓起部分的外侧端。用手术夹子夹住胶条的一端，剪刀剪切固定位点，将胶条贴着玻璃板缓慢放入到胶大孔中，用镊子适当压住胶条防止产生气泡，并用折叠胶片压住胶条，倒出凝胶孔中的水，将凝胶玻璃板装入跑胶架子上，并卡住，放入电泳槽内，加入电泳缓冲液。
139.4)拔掉折叠胶片，从4度冰箱取出琼脂糖凝胶，用微波炉加热30秒(注意避免冒出瓶子，一旦煮沸，停止加热)，用100μl移液器缓慢将琼脂糖凝胶加入到sds胶大孔中，加入3μl蛋白marker，盖上盖子，对准正负极，打开电泳仪，200v 30min，当溴酚蓝跑到底部时，关闭电泳仪。
140.2.2.5.血清学孵育筛选差异表达蛋白点
141.1)对于获得的三张sds-page凝胶，一张胶卸到考马斯亮蓝溶液中，煮沸15秒，保鲜膜封口，摇床摇15min，然后换脱色液，煮沸15秒，摇床室温过夜。
142.2)另外两张凝胶，使用半干转的方法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，条件设为70v，2小时。
143.3)从前期筛选出的骨肉瘤血清中选取11个代表性的血清，并以5个正常对照混合血清作为对照，将病例血清各取10μl混合，并使用含3％脱脂奶粉的pbst溶液5ml稀释后混合，作为病例样本；同时，挑选5个正常对照血清，各取1oμl，使用含3％脱脂奶粉的pbst溶液进行稀释后混合，作为对照样本。
144.4)将病例样本和对照样本分别与上述两块nc膜进行孵育，孵育条件为4℃过夜。
145.5)pbst洗膜五次，1∶10000稀释的hrp标记山羊抗人igg室温孵育1小时后，pbst洗膜五次。
146.6)发光、显影、洗片后观察记录结果。
147.2.2.6.质谱分析鉴定候选骨肉瘤相关抗原
148.将上述的结果与考马斯亮蓝染色的凝胶结果进行比对，找出骨肉瘤血清中有而对照血清中没有的阳性反应点，将在sds-page凝胶中对应的阳性蛋白点，用200μl吸头取出，转移至ep管中，作好标记后，送交上海中科新生命生物科技有限公司进行maldi-tof ms(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)的分析，以鉴定所筛选出来的候选肿瘤相关抗原。
149.2.2.7.根据质谱的结果，从经过serpa实验结果中筛选出8种血清蛋白标志物：
eno1、gapdh、hsp27、hsp60、npm1、pdlim1、stmn1和tpi1蛋白(图4图中依次为eno1、gapdh、hsp27、hsp60、npm1、pdlim1、stmn1和tpi1编码的蛋白单独诊断骨肉瘤的roc曲线；图5为上述8个taa的od值散点图，图中nhs表示normal human sera，即健康正常血清，os表示osteosarcoma，即骨肉瘤病例，oc表示osteochondroma，即骨软骨瘤病例)。
150.3 elisa实验验证
151.实验原理参见图3。
152.3.1实验所需试剂：
153.1)被液(1l)：
154.分别称量1.50g na2co3、2.90g nahco3、0.10g thimerosal于1l的烧杯中，向烧杯中加入800ml去离子水，完全溶解后，用盐酸调节ph至9.6，加入proclin300 200μl后加去离子水定容至1l，存于4℃冰箱保存。
155.2)封闭液(100ml)：
156.称量2g bsa，加入1
×
pbst溶液定容至100ml，存于4℃冰箱。
157.3)血清、二抗稀释液(100ml)：
158.称量1g bsa，加入1
×
pbst溶液定容至100ml，存于4℃冰箱。
159.4)清洗液：1
×
pbst，存放于4℃冰箱。
160.5)显色液：abts显色试剂盒。
161.3.2 elisa的具体实验步骤：
162.a)包被：将taa按照1.0μg/ml的浓度进行包被100μl/孔，4℃过夜。
163.b)封闭：每孔加入200μl含2％bsa的pbst溶液，4℃过夜。
164.c)清洗：350μl/孔pbst清洗3次。
165.d)一抗孵育：血清与含1％bsa的pbst 1∶100稀释后，100μl/孔，37℃半水浴1h。
166.e)清洗：350μl/孔pbst清洗5次。
167.f)二抗孵育：hrp标记的羊抗人ig6(h+l)二抗与含1％bsa的pbst按1∶4000稀释后，100μl/孔，37℃半水浴1h。
168.g)清洗：350μl/孔pbst清洗5次。
169.h)显色：abts显色系统，按照反应液10ml+溶液a2.5μl配制显色液，显色液100μl/孔，室温避光，显色30min，达到预期颜色后加入终止液50μl/孔终止反应：
170.i)测吸光度：所有血清样品重复检测，以od405为相对od值，然后扣去空白对照，然后进行后续数据处理。
171.其中，上述经serpa技术筛选出的8个taa进行elisa实验验证时，elisa实验的96孔板排布表如下表1所示。表1中阳性质控为elisa实验od值较高的并经western blot实验验证为相应抗体阳性的血清，阴性质控为正常对照人群中elisa实验od值处于均值附近的且经western blot验证为阴性的血清，空白为血清稀释液。
172.表1 elisa实验的96孔板排布
[0173][0174]
实验结果：采用elisa方法对8个taa进行检测，结果见图4和图5。图4为elisa验证实验中8个taa单独诊断骨肉瘤的roc曲线分析图，图中依次为eno1、gapdh、hsp27、hsp60、npm1、pdlim1、stmn1和tpi1蛋白单独诊断骨肉瘤的roc曲线；图5为elisa验证实验中8个taa的od值散点分布图，图中n表示normal，即健康正常血清，oc表示osteochondroma，即骨软骨瘤病例，os表示osteosarcoma，即骨肉瘤病例。从图4可以看出，单个指标诊断骨肉瘤roc曲线下面积为0.501～0.716。其中eno1的曲线下面积最大，为0.716；gapdh的roc曲线下面积次之，为0.700；npm1的roc曲线下面积最小，为0.501。从图5可以看出，除npm1之外，健康对照与骨肉瘤病例之间差异均有统计学意义。
[0175]
4数据处理
[0176]
通过serpa筛选出差异表达蛋白，对经serpa筛选出的8种血清蛋白标志物进行elisa实验验证，共检测了51例原发性骨肉瘤、28例骨软骨瘤以及同时期体检的51例正常对照血清中各自身抗体的含量。除npm1之外，健康对照与骨肉瘤病例之间差异均有统计学意义。以od405为相对od值，然后扣去空白对照，针对其他7种taas的吸光度值构建患病预测模型：以骨肉瘤患者和正常对照血清中各抗-taas自身抗体的含量为自变量，以研究对象是否患有骨肉瘤为因变量，采用逐步向后(条件)logistic回归分析的方法来筛选出对诊断骨肉瘤具有价值的自身抗体指标，得到回归方程，计算预测概率，并计算该方程诊断骨肉瘤的灵敏度、特异度、约登指数、符合率以及roc曲线下面积等指标。
[0177]
构建的回归方程如下：pre(p＝os，3taas)＝1/(1+exp(-(-6.679+9.686
×
od
eno1
+17.286
×
od
gapdh
+11.178
×
od
tpi1
)))，式中od
eno1
、od
gapdh
、od
tpi1
分别为各个指标的相对od值减去空白对照后的吸光度值；当p值≥0.5时，初步判定为疑似骨肉瘤样品；当p值＜0.5时，初步判定为正常样品本研究应用spss21.0软件进行数据的处理分析，然后采用筛检试验的评价方法评价自身抗体检测骨肉瘤的诊断价值。
[0178]
对以上所构建的模型的诊断价值以及经济效益分析，含有3个指标(eno1、gapdh、tpi1)的模型，其联合诊断骨肉瘤roc曲线下面积达0.798，95％ci为0.709～0.887，灵敏度为70.59％，特异度为86.27％。
[0179]
实施例2：
[0180]
一种用于骨肉瘤早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，所述血清蛋白标志物为eno1蛋白、gapdh蛋白和tpi1蛋白三种的联合。
[0181]
一种试剂盒，其包括用于骨肉瘤早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，所述血清蛋
白标志物被包被于固相载体上，固相载体为由聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素其中的任意一种制成的的凹孔平板，还包括阳性对照血清、阴性对照血清、封闭液、样本稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液。
[0182]
阳性对照血清为elisa实验od值较高的且经western blot实验验证为相应抗体阳性的血清，阴性对照血清为正常对照人群中elisa实验od值处于均值附近的且经western blot验证为阴性的血清，封闭液为2％bsa的1
×
pbst溶液，血清稀释液和第二抗体稀释液均为含1％bsa的1
×
pbst溶液，第二抗体为hrp标记的羊抗人igg(h+l)，洗涤液为1
×
pbst溶液，显色液为abts显色试剂盒。
[0183]
使用用于骨肉瘤早期筛查和诊断的血清蛋白标志物的检测方法，包括以下步骤：
[0184]
1)将每种血清蛋白标志物按照1.0μg/ml的浓度进行包被，100μl/孔，4℃下过夜；然后进行封闭：采用封闭液200μl/孔，4℃过夜；350μl/孔洗涤液清洗3次；
[0185]
2)再与稀释后的待测血清(待测血清与血清稀释液以1∶100体积比例稀释)进行一抗孵育：100μl/孔，37℃半水浴1h；350μl/孔洗涤液清洗5次；再进行二抗孵育(第二抗体与第二抗体稀释液以1∶4000体积比例稀释)，100μl/孔，37℃半水浴1h；350μl/孔洗涤液清洗5次；
[0186]
3)显色：abts显色系统，按照反应液10ml+溶液a2.5μl配制显色液，显色液100μl/孔，室温避光，显色30min，达到预期颜色后加入终止液50μl/孔终止反应；
[0187]
4)以od
405
为相对od值，然后扣去空白对照，得到每种血清蛋白标志物的吸光度值，作8个taa的od值散点分布图，以及每个taa单独诊断骨肉瘤的roc曲线分析图。以骨肉瘤患者和正常对照血清中各抗-taas自身抗体的含量为自变量，以研究对象是否患有骨肉瘤为因变量，采用逐步向后(条件)logistic回归分析的方法来筛选出对诊断骨肉瘤具有价值的自身抗体指标，得到预测模型回归方程并计算预测概率p，当p值≥0.5时，初步判定为疑似骨肉瘤样品；当p值＜0.5时，初步判定为正常样品，计算预测模型的灵敏度、特异度、约登指数、符合率和roc曲线下面积等指标。
[0188]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。