本发明属于生物技术领域，具体涉及一种口蹄疫病毒液相阻断bsa-elisa抗体检测试剂盒及应用。
背景技术：
口蹄疫(footandmouthdisease,fmd)是由口蹄疫病毒(footandmouthdiseasevirus,fmdv)引起的猪、牛、羊等偶蹄动物易感的一种急性、热性、高度接触性传染病,被感染动物多以在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水泡性疹为主要临床特征，该病传播途径多、速度快，每次爆发均会给当地的畜牧养殖业造成巨大经济损失。世界动物卫生组织(oie)将其列为必须申报的传染病，我国也将其列在一类动物传染病的首位。口蹄疫病毒在全世界主要有七个血清型:o、a、亚洲1、c型及南非1、2、3型，疫苗免疫不能使各型之间交叉保护。现阶段我国主要针对o、a和亚洲1型口蹄疫病毒进行疫苗接种。
液相阻断elisa方法检测口蹄疫病毒抗体是世界动物卫生组织(oie)和国际贸易中指定的参考方法，也是我国用于口蹄疫病毒疫苗免疫效果评价及流行病学调查的推荐方法，兰州兽医研究所已获得“口蹄疫病毒o型液相阻断elisa抗体检测试剂盒”和“口蹄疫病毒亚洲1型液相阻断elisa抗体检测试剂盒”两个产品的新兽药证书。
世界口蹄疫参考实验室(pirbrightlaboratory)及国内兰州兽医研究所口蹄疫参考实验室研制的口蹄疫病毒液相阻断elisa抗体检测试剂盒，新兽药证推荐的操作指导书都存在试验操作繁琐、用时长、不易保存等问题，极大的影响了操作人员的愉悦感，给产品的推广及使用都带来了不便，尤其是在缺乏专业技术人员的企业中的推广阻力较大，操作过程容易出错，抗原保存不稳定导致试剂盒的保存稳定性差。
如何对口蹄疫病毒液相阻断elisa抗体检测方法的操作进行优化及生产工艺进行创新，是解决以上问题的关键。新操作流程及试剂盒生产工艺的改进应该在保证经典方法原有的敏感性、特异性的情况下，提高试剂盒操作的便捷性和试剂盒保存的稳定性及检测的可重复性。
技术实现要素：
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的一在于提供口蹄疫病毒液相阻断bsa-elisa抗体检测试剂盒，目的二在于提供所述试剂盒在疫苗抗体检测以及制备用于检测口蹄疫病毒抗体的产品中的应用。所述bsa-elisa抗体检测试剂盒实现将液相阻断elisa方法操作缩短在半个工作日内轻松完成，解决原有操作的繁琐、用时过长、操作疲劳、不稳定、易出错等问题。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
口蹄疫病毒液相阻断bsa-elisa抗体检测试剂盒，包括96孔兔抗包被板、fmdv抗原、阴性对照血清、阳性对照血清、豚抗-生物素、hrp-sa、25×pbst、tmb底物溶液和终止液；
所述fmdv抗原为血清型特异的口蹄疫病毒抗原，通过peg浓缩离心技术对口蹄疫病毒抗原进行浓缩并测试调配至统一的抗原量，加入5％海藻糖和0.01％proclin300防腐剂，分装，冻干；
所述阴性对照血清、阳性对照血清、豚抗-生物素和hrp-sa中分别加入不同的颜色指示剂。
所述口蹄疫病毒抗原是将口蹄疫病毒灭活得到的或是经口蹄疫灭活疫苗破乳后得到的。
所述96孔兔抗包被板的包被过程具体为：采用酶标板洗封一体机操作，用ph值9.6的0.05m碳酸盐缓冲液将血清型特异的兔抗fmdv血清稀释并包被elisa板，100μl/孔，室温过夜；不洗拍干加入酶标板稳定剂，150μl/孔，室温孵育1小时；不洗拍干，37℃干燥2个小时至孔底干燥无水气，真空包装，4℃保存。
所述阴性对照血清呈绿色，所述阳性对照血清呈红色，所述豚抗-生物素呈橙色，所述hrp-sa呈蓝色。
所述peg浓缩离心技术的具体做法为：将口蹄疫病毒灭活疫苗加入8％peg6000和4％nacl，4℃搅拌4小时后4～8℃静置过夜，500ml离心管6000rmp离心60分钟弃去上清，最后用pbs悬浮离心管内的抗原沉淀，定容至原抗原体积的1/50，加入对等体积冷的三氯乙烯进行乳化并离心脱脂，吸取抗原层液体；确定抗原的最佳使用浓度，根据测定的抗原浓度经pbs稀释至便于1:100稀释使用的抗原浓度，加入5％海藻糖和0.01％proclin300防腐剂，以1.0ml/管分装1.5ml规格的离心管，冻干，管内抗原物质为团松状，贴签，4℃用保存。
本发明还请求保护所述bsa-elisa抗体检测试剂盒在口蹄疫病毒抗体检测中的应用，所述抗体是指经口蹄疫病毒疫苗免疫后的抗体；采用所述试剂盒进行抗体检测的检测方法，包括以下步骤：
a、包被elisa板，形成96孔兔抗包被板；
b、血清稀释及抗原反应：将fmdv抗原冻干品用无菌去离子水复原后备用，4℃保存1个月内用完，临用时稀释至工作浓度；将25×pbst用去离子水稀释至1倍pbst备用；
在u型载体板上预先加入pbst后将阴性对照血清、阳性对照血清及被检血清加入相应孔内按要求以60ul体系进行相应起始倍数的2倍连续梯度稀释后紧接着用加入60ul稀释至工作浓度的fmdv抗原，每块板均设置至少4孔病毒抗原对照，板内均为120μl/孔，封板，震荡，37℃孵育90分钟；
c、移板：将作用充分后的抗原抗体混合物以100ul/孔平行转移至包被有兔抗口蹄疫病毒抗血清的elisa板内，37℃孵育30分钟；
d、豚抗-生物素结合物，即豚鼠igg抗型特异fmdv-生物素标记物：将经步骤c反应的elisa板用pbst洗板3～5次，甩干，加入豚抗-生物素结合物，100μl/孔，封板，37℃孵育30分钟；
e、hrp-sa：将经步骤d反应的elisa板用pbst洗板3～5次，甩干，加入hrp-sa结合物，100μl/孔，封板，37℃孵育10分钟；
f、tmb底物及终止反应：洗板3～5次，加入单组分tmb底物溶液，50μl/孔，37℃孵育10-15分钟后再每孔加入50μl的1.25mh2so4终止反应，酶标仪450nm波长下读取吸光值；
g、结果判定：以病毒抗原对照4孔od值平均值的50％作为病毒抗原被抑制50％的临界值，将阴阳性对照血清和被检血清相应孔的od值与临界值相比较，某份血清抗体效价即为该份血清稀释孔od值略高于临界值与略低于临界值孔的相邻两孔对应的抗体滴度的平均值。
本发明还请求保护所述试剂盒在制备用于检测口蹄疫病毒抗体的产品中的应用。
有益效果：
本发明在国内外率先突破了液相阻断elisa试剂盒常规酶促反应原理的限制，克服了液相阻断elisa方法原操作繁琐、费时、容易造成人为试验失败等方面的不足，保持了经典方法固有的敏感性与特异性，提高了产品的稳定性，使得口蹄疫病毒液相阻断bsa-elisa试剂盒操作及生产工艺更为理想、使用更为简便，有利于延长经典方法的使用周期，有利于提高产品质量、提高经济效益。
本发明通过口蹄疫病毒灭活抗原的浓缩冻干工艺处理，浓缩提高抗原含量实现抗原配制冻干复溶后用于试剂盒不同批次间的工作浓度相同，实现运输和抗原冷藏保存的稳定性；通过对抗口蹄疫豚鼠血清纯化igg标记生物素(豚抗igg-生物素)技术与hrp标记链霉亲和素(hrp-sa)相结合建立新的酶联免疫吸附试验方法，改变了原有的需要制备兔抗豚鼠抗血清再行标记hrp技术路线，提高了酶促反应的效率，保证了方法的原有敏感性的同时提高了方法的特异性；将试剂盒原操作指导的被检血清与抗原混合100ul体系在载体板中需要4℃作用过夜后取50ul抗原抗体混合物移置elisa兔抗口蹄疫包被板上37℃再孵育60分钟，优化为被检血清与抗原混合120ul体系在载体板中37℃孵育90分钟后取100ul抗原抗体混合物移置elisa兔抗口蹄疫包被板上37℃再孵育30分钟；洗板后加入豚抗igg-生物素工作液置37℃孵育30分钟；洗板后加入hrp-sa工作液置37℃孵育10分钟；洗板后加入单组分tmb底物溶液37℃孵育10-15分钟后加入终止液终止反应，于od450nm读取吸光值。实现将液相阻断elisa方法操作缩短在半个工作日内轻松完成，解决原有操作的繁琐、用时过长、操作疲劳、不稳定、易出错等问题。
利用生物素标记抗体与hrp-sa反应迅速、标记原料稳定、检测背景值等优点实现了将液相阻断elisa试剂盒操作时间需要2天时间缩短为3小时内即半个工作日内即可完成，解决了猪血清中检测容易发生的倒置现象，避免了对试验结果抗体效价的误判。通过酶标板洗封一体机的使用实现了兔抗包被elisa板的批量化生产，解决了手工包被只能小批量生产及由此造成批内差异过大问题。通过对阴阳性对照血清配制后分别加入绿色、红色指示剂，豚抗igg-生物素工作液配制后加入橙色指示剂及酶标抗体工作液配制后加入蓝色指示剂，实现了试剂组分的眼观可区分。通过tmb单组分底物替代临苯二胺(opd)底物的使用解决opd只能现配现用容易失效问题，实现了底物保存的稳定性并提高了显色敏感性。
本发明创造性的解决了口蹄疫病毒液相阻断elisa抗体检测试剂盒的操作繁琐、步骤多、用时长、稳定性差、易出错、猪血清样品容易发生倒置现象，生产批量小等难题。基于生物素标记抗体技术与hrp-sa相结合建立的新型酶联免疫吸附试验方法(bsa-elisa)，使得试剂盒操作的便捷化、时间缩减化、生产的批量化，保持了经典方法的敏感性、特异性，提高了运输及保存的稳定性、延长了试剂盒的有效期(12个月)，有利于延长经典方法的使用周期，有利于提高产品质量、提高经济效益，减轻了试剂盒操作人员工作负担，增加了使用者的愉悦感，有利于扩大口蹄疫病毒液相阻断bsa-elisa试剂盒推广应用。为该方法用于口蹄疫免疫抗体监测、疫苗免疫效果评估、流行病学调查、免疫指导等持续提供技术支持。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1口蹄疫病毒o型液相阻断bsa-elisa试剂盒研制及应用
1材料和方法
1.1口蹄疫病毒抗原、抗血清制备
1.1.1试剂盒所需fmdv抗原浓缩及冻干：将适量体积的口蹄疫病毒灭活疫苗(o/mya98株)加入8％peg6000、4％nacl，4℃搅拌4小时后4～8℃静置过夜，500ml离心管6000rmp离心60分钟弃去上清，继续加入未离心抗原进行离心，抗原量大时重复以上操作，最后用ph7.6的0.01molpbs悬浮离心管内的抗原沉淀，定容至原抗原体积的1/50,加入对等体积冷的三氯乙烯进行乳化并离心脱脂，吸取抗原层液体，用液相阻断elisa试剂盒确定抗原的最佳使用浓度(＞100)，根据测定的抗原浓度经ph7.6的0.01molpbs进行稀释至便于1:100稀释使用的抗原浓度，加入5％海藻糖，0.01％proclin300防腐剂，以1.0ml/管分装1.5ml规格的离心管，冻干，管内抗原物质为团松状为宜，贴签，4℃用保存。
1.1.2免疫用fmdv146s抗原制备：将口蹄疫灭活抗原(o/mya98株)，取100ml抗原液，45000rmp,4℃超速离心1h，将离心管底壁的沉淀用ph值7.6pbs重悬至2ml，经蔗糖密度梯度(45％、35％、25％、15％)35000rpm离心2.5小时，按0.5ml取样并合并同一级峰，并经260nm紫外分光光度仪检测，收集含口蹄疫完整病毒粒子146s抗原的吸收峰(第二峰)合并。
1.1.3o型兔抗口蹄疫病毒血清：选取健康2.0kg左右的健康兔子，将纯化的146s抗原与等量的完全弗氏佐剂乳化后免疫兔子，于第30天颈部动脉放血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.4o型豚鼠抗口蹄疫病毒血清：以与兔抗血清同源的fmdv纯化的146s抗原免疫豚鼠，第30天心脏采血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.5o型豚鼠抗口蹄疫病毒血清igg纯化及生物素化标记：免疫制备的o型豚鼠抗口蹄疫病毒血清经亲和层析纯化获得豚鼠血清igg，将豚抗igg用0.1mol/l碳酸氢钠缓冲液(ph8.0)稀释至1mg/ml，每次标记量为1-2.5ml，在透析袋内互作，将待生物素化的豚抗igg加入透析袋(mwco8000)置于0.1mol/l碳酸氢钠缓冲液(ph8.0)充分透析；每毫克蛋白加入120ul浓度为1mg/ml的nhsb(n-羟基琥珀酰亚胺生物素)溶液(即用1mldmso溶解1mgnhsb)，室温下搅拌2-4小时，加入9.6μl1mol/lnh4cl(每25μgnhsb加1μl)，在室温下搅拌10分钟。用ph值7.2的0.01mol/l缓冲体系除去游离的生物素，吸取袋内标记物，加入50％甘油，0.01％proclin300,分装，-70℃冻存。
1.1.6hrp-sa辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，商品化试剂，购买获得。
1.1.7o型口蹄疫抗体阳性血清：由与兔抗血清同源的口蹄疫灭活疫苗免疫牛制备的高免血清，首次免疫后第30天加强免疫一次，二免后2周采血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.8口蹄疫抗体阴性血清：为购买口蹄疫抗体阴性的新生牛血清。
1.2方法
2.1o型口蹄疫抗体阳性血清效价测定
用口蹄疫o型抗体液相阻断elisa检测试剂盒(兰州兽医研究所)测定。
2.2抗血清工作浓度的确定
兔抗口蹄疫病毒血清、hrp-豚鼠抗口蹄疫病毒血清igg，以阳性血清抗体效价为参照，依次确定各试剂的工作浓度。
2.3冻干抗原复原后工作浓度(1:100)
冻干抗原复原后工作浓度1:100，按照液相阻断elisa操作进行试验，设置o型阳性血清对照、a型及亚洲1型高免血清对照。
2.4操作步骤优化
2.4.1血清稀释及抗原反应
在u型孔底的载体反应板上，按每孔60μl量加入ph值7.4的1倍pbst，将阴性、阳性对照血清及被检血清按要求进行2倍连续稀释，紧接着所有孔内加入60μl量稀释至工作浓度(1:100)的o型口蹄疫病毒抗原，每块反应板均设置至少4孔病毒抗原对照(预先加入60μl的pbst)，最终elisa反应板内液体量均为120μl/孔，封板膜封板，震荡，37℃孵育90分钟。
2.4.2移板
取100ul作用充分后的抗原抗体混合物移置elisa兔抗口蹄疫包被板上，37℃孵育30分钟。
2.4.3加豚抗igg-生物素
将上步反应的elisa板用pbst洗板3～5次，甩干，加入豚抗igg-生物素抗体工作液，100μl/孔，封板，37℃孵育30分钟。
2.4.4加酶标链霉亲和素(hrp-sa)
将上步反应的elisa板用pbst洗板3～5次，甩干，加入酶标链霉亲和素(hrp-sa)工作液，100μl/孔，封板，37℃孵育10分钟。
2.4.5tmb底物及终止反应酶标抗体(hrp-豚鼠抗口蹄疫病毒血清igg)
同上洗板3～5次，加入单组分tmb底物溶液，50μl/孔，37℃孵育10-15分钟后再每孔加入50μl的1.25％h2so4终止反应，酶标仪450nm波长下读取吸光值。
2.4.6结果判定
以病毒抗原对照4孔od值平均值的50％作为病毒抗原被阻断50％的临界值，将阴、阳性对照血清和被检血清相应孔的od值与临界值相比较，某份血清抗体效价即为该份血清稀释孔od值略高于临界值与略低于临界值孔(相邻两孔)对应的抗体滴度的平均值。
2.5与液相阻断elisa试剂盒原操作方法的符合性(敏感性和特异性)
o型口蹄疫灭活疫苗免疫动物血清60份(牛20份，羊20份，猪20份)，亚洲1型口蹄疫灭活疫苗免疫牛血清1份，a型口蹄疫灭活疫苗免疫牛血清1份，口蹄疫抗体阴性动物30份(牛15份，猪15份)。与液相阻断elisa试剂盒原操作方法作平行检测。
2.6重复性
30份口蹄疫o型灭活疫苗免疫动物血清利用抑制elisa方法重复测定3次。
3结果
3.1o型口蹄疫阳性血清抗体效价测定结果
o型口蹄疫阳性血清经液相阻断elisa方法检测确定为720(512～1024)，作为抑制elisa的阳性对照血清，其抗体效价同样控制在720(512～1024)。
3.2抗血清工作浓度测定结果
经液相阻断elisa方法测定，o型兔抗血清的工作浓度为1：1000，生物素化标记o型豚鼠抗血清igg的工作浓度为1：1000，hrp-sa的工作浓度为1:1000；o型兔抗血清以工作浓度包被elisa板，4℃保存；生物素标记o型豚鼠抗血清igg以工作浓度为1:1000稀释配制工作液，4℃保存；hrp-sa以工作浓度为1:10000稀释配制工作液，4℃保存。
3.3冻干抗原复原后工作浓度(1:100)测定结果
冻干抗原复原后工作浓度1:100，与液相阻断elisa原操作进行平行比对试验，设置o型阳性血清对照、a型及亚洲1型高免血清对照。阳性对照抗体效价与已知相符合，测定a型和亚洲1型高免血清抗体效价均不大于64，4孔病毒抗原od值均在1.0-2.0范围内。
3.4操作步骤的优化结果
以保持液相阻断经典方法的敏感性、特异性一致为原则进行试剂盒操作及生产工艺的优化，优化后的试剂盒操作为被检血清与抗原混合120ul体系在载体板中37℃孵育90分钟后取100ul抗原抗体混合物移置elisa兔抗口蹄疫包被板上37℃再孵育30分钟，洗板后加入豚抗igg-生物素工作液置37℃孵育30分钟；洗板后加入hrp-sa工作液置37℃孵育10分钟；洗板后加入单组分tmb底物溶液37℃孵育10-15分钟后加入终止液终止反应，于od450nm读取吸光值。仍然以病毒抗原对照4孔od值平均值的50％作为病毒抗原被阻断50％的临界值进行被检血清效价的计算。
3.5与液相阻断elisa试剂盒原操作方法的符合结果(敏感性和特异性)
兰州兽医研究所生产的口蹄疫o型液相阻断elisa方法抗体检测试剂盒，牛、羊血清抗体效价≥128判为o型口蹄疫抗体阳性，猪血清抗体效价≥64判为o型口蹄疫抗体阳性；优化后的液相阻断elisa方法，仍然保持牛、羊血清抗体效价≥128判为o型口蹄疫抗体阳性，猪血清抗体效价≥64判为o型口蹄疫抗体阳性。30份口蹄疫抗体阴性动物和60份o型口蹄疫灭活疫苗免疫动物的血清抗体效价测定：本发明研制的液相阻断bsa-elisa方法与液相阻断elisa试剂盒原操作方法测定的抗体效价的差异均在1个滴度以内，敏感性符合率为100％；1份a型灭活疫苗免疫动物(a型抗体效价均＞1024)和1份亚洲1型灭活疫苗免疫动物(亚洲1型抗体效价均＞1024)，优化后液相阻断elisa方法检测o型抗体效均小于64，与液相阻断elisa试剂盒原操作效价检测结果一致。
3.6重复性
对30份o型口蹄疫灭活疫苗经抑制elisa方法重复检测3次，抗体效价完全一致的为24份，相差一个滴度内的为4份，相差超过1个滴度为2份，说明本方法重复性良好。
4结论
4.1本发明建立的液相阻断bsa-elisa试剂盒检测新方法与液相阻断elisa原操作敏感性、特异性保持一致。
4.2液相阻断bsa-elisa试剂盒新方法是通过抗口蹄疫豚鼠血清纯化igg生物素化标记(豚抗igg-生物素)技术与hrp标记链霉亲和素(hrp-sa)相结合建立新的酶联免疫吸附试验方法，改变了原有的需要制备兔抗豚鼠抗血清再行标记hrp技术路线，提高了酶促反应的效率，省去了原操作中抗口蹄疫病毒豚鼠抗血清反应后需要加入hrp-兔抗豚鼠血清再反应中的hrp-兔抗豚鼠血清的反应步骤，解决了猪血清效价检测容易发生的倒置现象，避免了效价的误判现象，试剂盒新操作用时在3个小时内完成，与液相阻断elisa试剂盒原操作方法抗原、抗体反应需要过夜，整个操作需要在2天时间完成，极大节省了时间。
4.3液相阻断bsa-elisa方法与液相阻断elisa试剂盒相比，抗原配制以冻干品形式提供，同时工作浓度统一(1:100)，便于运输和抗原冷藏保存的稳定性，提高了产品质量，减少了操作失误。
4.4液相阻断bsa-elisa试剂盒新方法与原来的液相阻断elisa试剂盒相比，阴阳性对照血清、豚抗-生物素及hrp-sa通过颜色指示剂的加入使得试剂盒各组分便于眼观可区分，减少了操作失误的发生。
4.5本研究为口蹄疫病毒o型液相阻断elisa抗体检测试剂盒的优化更新换代提供了可靠的工艺创新技术支持。
5.口蹄疫病毒o型液相阻断bsa-elisa抗体检测试剂盒说明书
5.1试剂盒名称：口蹄疫病毒o型液相阻断bsa-elisa抗体检测试剂盒
5.2用途：用于猪、牛、羊等口蹄疫病毒易感动物中口蹄疫o型抗体。
5.2规格：5×96孔/盒，可检测50～100份样品；10×96孔/盒，可检测100～200份样品。
5.3保存：2～8℃，有效期：12个月。
5.2试剂盒组分
5.3操作步骤
5.3.1实试验前准备
用去离子水或超纯水将25×洗涤液(pbst)稀释至1×洗涤液，用于血清稀释及反应板洗涤；将fmdvo型抗原冻干品用无菌去离子水复溶至1ml备用，4℃保存1个月内用完，使用浓度1:100；试验开始前将试剂盒至室温30分钟以上以使各组分恢复至室温。
5.3.2按样品布局(以10份样品为例)，在96孔“u”型板上，a1、a2...a10孔加入待检血清，每孔30μl血清和30μlpbst,其他样品稀释孔内加入60μlpbst，2倍连续稀释，起始为1∶4，每孔加入60μl病毒抗原，加入抗原后血清的起始稀释度为1∶8；a11孔加入阳性对照血清60μl，2倍连续稀释至h11，起始为1∶8，每孔加入60μl病毒抗原，加入抗原后血清的起始稀释度为1∶16；a12孔加入阴性对照血清60μl，2倍稀释至b12，起始为1∶2，每孔加入60μl病毒抗原，加入抗原后血清的起始稀释度为1∶4；e12、f12、g12和h12每孔加入60μl病毒抗原(预先加入60μlpbst)，作为4个病毒抗原对照孔。轻微振荡反应板，用封板膜封板，置3℃孵育90分钟。
5.3.3用洗涤液连续清洗包被酶标板3～5次，在吸水纸上拍干。将血清/病毒抗原反应板上的血清/病毒抗原混合液和病毒抗原对照液转移到酶标板上的对应孔内，100μl/孔，用封板膜封板，置37℃孵育30分钟。
5.3.4用洗涤液将酶标板连续洗板3～5次，在吸水纸上拍干。加入豚抗-生物素工作液100μl/孔，用封板膜封板，置37℃孵育30分钟。
5.3.5用洗涤液将酶标板连续洗板3～5次，在吸水纸上拍干。加入hrp-sa工作液100μl/孔，用封板膜封板，置37℃孵育10分钟。
5.3.6洗板3～5次，在吸水纸上拍干，加入tmb底物溶液，每孔50μl，置37℃孵育10～15分钟。
5.3.7每孔加入终止液50μl，终止反应。
5.3.8在酶标仪上读取od450nm值。
5.4结果判定
5.4.1试验成立条件
口蹄疫o型病毒抗原对照至少2个孔的od492nm值在1.0～2.0范围内；口蹄疫o型阴性对照血清抗体效价应小于1∶8；口蹄疫o型阳性对照血清抗体效价应在1∶512～1∶2048之间。
5.4.2血清抗体效价
抗体效价是以50％终点稀释度表示，以抗原对照孔平均od450nm值的50％为临界值。待检血清孔od450nm值大于临界值的为阴性孔，小于、等于临界值的为阳性孔。待检血清阳性孔的最高稀释度，为该份血清的抗体效价，血清最终稀释度用karber法计算(下表)。
karber法计算公式：㏒x＝n﹣d(s﹣0.5)x表示血清抗体效价；n＝全为阳性孔的最高稀释度的对数值(从出现阴性孔的上一稀释度开始计算)；d＝稀释倍数的对数值；s＝各稀释度阳性孔比率总和(从出现阴性孔的上一稀释度开始计算)。
5.4.3判定
牛、羊血清抗体效价≥1∶128，判为口蹄疫o型抗体阳性；猪血清抗体效价≥1∶64，判为口蹄疫o型抗体阳性。
实施例2口蹄疫病毒a型液相阻断bsa-elisa试剂盒研制及应用
1材料和方法
1.1口蹄疫病毒抗原、抗血清制备
1.1.1试剂盒所需fmdv抗原浓缩及冻干：将适量体积的口蹄疫病毒灭活疫苗(af72株)加入8％peg6000、4％nacl，4℃搅拌4小时后4～8℃静置过夜，500ml离心管6000rmp离心60分钟弃去上清，继续加入未离心抗原进行离心，抗原量大时重复以上操作，最后用ph7.6的0.01molpbs悬浮离心管内的抗原沉淀，定容至原抗原体积的1/50,加入对等体积冷的三氯乙烯进行乳化并离心脱脂，吸取抗原层液体，用液相阻断elisa试剂盒确定抗原的最佳使用浓度(＞100)，根据测定的抗原浓度经ph7.6的0.01molpbs进行稀释至便于1:100稀释使用的抗原浓度，加入5％海藻糖，0.01％proclin300防腐剂，以1.0ml/管分装1.5ml规格的离心管，冻干，管内抗原物质为团松状为宜，贴签，4℃用保存。
1.1.2免疫用fmdv146s抗原制备：将口蹄疫灭活抗原(af72株)，取100ml抗原液，45000rmp,4℃超速离心1h，将离心管底壁的沉淀用ph值7.6pbs重悬至2ml，经蔗糖密度梯度(45％、35％、25％、15％)35000rpm离心2.5小时，按0.5ml取样并合并同一级峰，并经260nm紫外分光光度仪检测，收集含口蹄疫完整病毒粒子146s抗原的吸收峰(第二峰)合并。
1.1.3a型兔抗口蹄疫病毒血清：选取健康2.0kg左右的健康兔子，将纯化的146s抗原与等量的完全弗氏佐剂乳化后免疫兔子，于第30天颈部动脉放血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.4a型豚鼠抗口蹄疫病毒血清：以与兔抗血清同源的fmdv纯化的146s抗原免疫豚鼠，第30天心脏采血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.5a型豚鼠抗口蹄疫病毒血清igg纯化及生物素化标记：免疫制备的a型豚鼠抗口蹄疫病毒血清经亲和层析纯化获得豚鼠血清igg，将豚抗igg用0.1mol/l碳酸氢钠缓冲液(ph8.0)稀释至1mg/ml，每次标记量为1-2.5ml，在透析袋内互作，将待生物素化的豚抗igg加入透析袋(mwco8000)置于0.1mol/l碳酸氢钠缓冲液(ph8.0)充分透析；每毫克蛋白加入120ul浓度为1mg/ml的nhsb(n-羟基琥珀酰亚胺生物素)溶液(即用1mldmso溶解1mgnhsb)，室温下搅拌2-4小时，加入9.6μl1mol/lnh4cl(每25μgnhsb加1μl)，在室温下搅拌10分钟。用ph值7.2的0.01mol/l缓冲体系除去游离的生物素，吸取袋内标记物，加入50％甘油，0.01％proclin300,分装，-70℃冻存。
1.1.6hrp-sa辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，商品化试剂，购买获得。
1.1.7a型口蹄疫抗体阳性血清：由与兔抗血清同源的口蹄疫灭活疫苗免疫牛制备的高免血清，首次免疫后第30天加强免疫一次，二免后2周采血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.8口蹄疫抗体阴性血清：为购买口蹄疫抗体阴性的新生牛血清。
1.2方法
2.1a型口蹄疫抗体阳性血清效价测定
用口蹄疫a型抗体液相阻断elisa检测试剂盒(兰州兽医研究所)测定。
2.2抗血清工作浓度的确定
兔抗口蹄疫病毒血清、hrp-豚鼠抗口蹄疫病毒血清igg，以阳性血清抗体效价为参照，依次确定各试剂的工作浓度。
2.3冻干抗原复原后工作浓度(1:100)
冻干抗原复原后工作浓度1:100，按照液相阻断elisa操作进行试验，设置a型阳性血清对照、o型及亚洲1型高免血清对照。
2.4操作步骤优化
2.4.1血清稀释及抗原反应
在u型孔底的载体反应板上，按每孔60μl量加入ph值7.4的1倍pbst，将阴性、阳性对照血清及被检血清按要求进行2倍连续稀释，紧接着所有孔内加入60μl量稀释至工作浓度(1:100)的a型口蹄疫病毒抗原，每块反应板均设置至少4孔病毒抗原对照(预先加入60μl的pbst)，最终elisa反应板内液体量均为120μl/孔，封板膜封板，震荡，37℃孵育90分钟。
2.4.2移板
取100ul作用充分后的抗原抗体混合物移置elisa兔抗口蹄疫包被板上，37℃孵育30分钟。
2.4.3加豚抗igg-生物素
将上步反应的elisa板用pbst洗板3～5次，甩干，加入豚抗igg-生物素抗体工作液，100μl/孔，封板，37℃孵育30分钟。
2.4.4加酶标链霉亲和素(hrp-sa)
将上步反应的elisa板用pbst洗板3～5次，甩干，加入酶标链霉亲和素(hrp-sa)工作液，100μl/孔，封板，37℃孵育10分钟。
2.4.5tmb底物及终止反应酶标抗体(hrp-豚鼠抗口蹄疫病毒血清igg)
同上洗板3～5次，加入单组分tmb底物溶液，50μl/孔，37℃孵育10-15分钟后再每孔加入50μl的1.25％h2so4终止反应，酶标仪450nm波长下读取吸光值。
2.4.6结果判定
以病毒抗原对照4孔od值平均值的50％作为病毒抗原被阻断50％的临界值，将阴、阳性对照血清和被检血清相应孔的od值与临界值相比较，某份血清抗体效价即为该份血清稀释孔od值略高于临界值与略低于临界值孔(相邻两孔)对应的抗体滴度的平均值。
2.5与液相阻断elisa试剂盒原操作方法的符合性(敏感性和特异性)
a型口蹄疫灭活疫苗免疫动物血清60份(牛20份，羊20份，猪20份)，亚洲1型口蹄疫灭活疫苗免疫牛血清1份，o型口蹄疫灭活疫苗免疫牛血清1份，口蹄疫抗体阴性动物30份(牛15份，猪15份)。与液相阻断elisa试剂盒原操作方法作平行检测。
2.6重复性
30份口蹄疫a型灭活疫苗免疫动物血清利用抑制elisa方法重复测定3次。
3结果
3.1a型口蹄疫阳性血清抗体效价测定结果
a型口蹄疫阳性血清经液相阻断elisa方法检测确定为720(512～1024)，作为抑制elisa的阳性对照血清，其抗体效价同样控制在720(512～1024)。
3.2抗血清工作浓度测定结果
经液相阻断elisa方法测定，a型兔抗血清的工作浓度为1：1000，生物素化标记a型豚鼠抗血清igg的工作浓度为1：1000，hrp-sa的工作浓度为1:1000；a型兔抗血清以工作浓度包被elisa板，4℃保存；生物素标记a型豚鼠抗血清igg以工作浓度为1:1000稀释配制工作液，4℃保存；hrp-sa以工作浓度为1:10000稀释配制工作液，4℃保存。
3.3冻干抗原复原后工作浓度(1:100)测定结果
冻干抗原复原后工作浓度1:100，与液相阻断elisa原操作进行平行比对试验，设置a型阳性血清对照、a型及亚洲1型高免血清对照。阳性对照抗体效价与已知相符合，测定a型和亚洲1型高免血清抗体效价均不大于64，4孔病毒抗原od值均在1.0-2.0范围内。
3.4操作步骤的优化结果
以保持液相阻断经典方法的敏感性、特异性一致为原则进行试剂盒操作及生产工艺的优化，优化后的试剂盒操作为被检血清与抗原混合120ul体系在载体板中37℃孵育90分钟后取100ul抗原抗体混合物移置elisa兔抗口蹄疫包被板上37℃再孵育30分钟，洗板后加入豚抗igg-生物素工作液置37℃孵育30分钟；洗板后加入hrp-sa工作液置37℃孵育10分钟；洗板后加入单组分tmb底物溶液37℃孵育10-15分钟后加入终止液终止反应，于od450nm读取吸光值。仍然以病毒抗原对照4孔od值平均值的50％作为病毒抗原被阻断50％的临界值进行被检血清效价的计算。
3.5与液相阻断elisa试剂盒原操作方法的符合结果(敏感性和特异性)
兰州兽医研究所生产的口蹄疫a型液相阻断elisa方法抗体检测试剂盒，牛、羊血清抗体效价≥128判为a型口蹄疫抗体阳性，猪血清抗体效价≥64判为a型口蹄疫抗体阳性；优化后的液相阻断elisa方法，仍然保持牛、羊血清抗体效价≥128判为a型口蹄疫抗体阳性，猪血清抗体效价≥64判为a型口蹄疫抗体阳性。30份口蹄疫抗体阴性动物和60份a型口蹄疫灭活疫苗免疫动物的血清抗体效价测定：本发明研制的液相阻断bsa-elisa方法与液相阻断elisa试剂盒原操作方法测定的抗体效价的差异均在1个滴度以内，敏感性符合率为100％；1份o型灭活疫苗免疫动物(o型抗体效价均＞1024)和1份亚洲1型灭活疫苗免疫动物(亚洲1型抗体效价均＞1024)，优化后液相阻断elisa方法检测a型抗体效均小于64，与液相阻断elisa试剂盒原操作效价检测结果一致。
3.6重复性
对30份a型口蹄疫灭活疫苗经抑制elisa方法重复检测3次，抗体效价完全一致的为24份，相差一个滴度内的为4份，相差超过1个滴度为2份，说明本方法重复性良好。
4结论
4.1本发明建立的液相阻断bsa-elisa试剂盒检测新方法与液相阻断elisa原操作敏感性、特异性保持一致。
4.2液相阻断bsa-elisa试剂盒新方法是通过抗口蹄疫豚鼠血清纯化igg生物素化标记(豚抗igg-生物素)技术与hrp标记链霉亲和素(hrp-sa)相结合建立新的酶联免疫吸附试验方法，改变了原有的需要制备兔抗豚鼠抗血清再行标记hrp技术路线，提高了酶促反应的效率，省去了原操作中抗口蹄疫病毒豚鼠抗血清反应后需要加入hrp-兔抗豚鼠血清再反应中的hrp-兔抗豚鼠血清的反应步骤，解决了猪血清效价检测容易发生的倒置现象，避免了效价的误判现象，试剂盒新操作用时在3个小时内完成，与液相阻断elisa试剂盒原操作方法抗原、抗体反应需要过夜，整个操作需要在2天时间完成，极大节省了时间。
4.3液相阻断bsa-elisa方法与液相阻断elisa试剂盒相比，抗原配制以冻干品形式提供，同时工作浓度统一(1:100)，便于运输和抗原冷藏保存的稳定性，提高了产品质量，减少了操作失误。
4.4液相阻断bsa-elisa试剂盒新方法与原来的液相阻断elisa试剂盒相比，阴阳性对照血清、豚抗-生物素及hrp-sa通过颜色指示剂的加入使得试剂盒各组分便于眼观可区分，减少了操作失误的发生。
4.5本研究为口蹄疫病毒a型液相阻断elisa抗体检测试剂盒的优化更新换代提供了可靠的工艺创新技术支持。
5.口蹄疫病毒a型液相阻断bsa-elisa抗体检测试剂盒说明书
5.1试剂盒名称：口蹄疫病毒a型液相阻断bsa-elisa抗体检测试剂盒
5.2用途：用于猪、牛、羊等口蹄疫病毒易感动物中口蹄疫o型抗体。
5.2规格：5×96孔/盒，可检测50～100份样品；10×96孔/盒，可检测100～200份样品。
5.3保存：2～8℃，有效期：12个月。
5.2试剂盒组分
5.3操作步骤
5.3.1实试验前准备
用去离子水或超纯水将25×洗涤液(pbst)稀释至1×洗涤液，用于血清稀释及反应板洗涤；将fmdva型抗原冻干品用无菌去离子水复溶至1ml备用，4℃保存1个月内用完，使用浓度1:100；试验开始前将试剂盒至室温30分钟以上以使各组分恢复至室温。
5.3.2按样品布局(以10份样品为例)，在96孔“u”型板上，a1、a2...a10孔加入待检血清，每孔30μl血清和30μlpbst,其他样品稀释孔内加入60μlpbst，2倍连续稀释，起始为1∶4，每孔加入60μl病毒抗原，加入抗原后血清的起始稀释度为1∶8；a11孔加入阳性对照血清60μl，2倍连续稀释至h11，起始为1∶8，每孔加入60μl病毒抗原，加入抗原后血清的起始稀释度为1∶16；a12孔加入阴性对照血清60μl，2倍稀释至b12，起始为1∶2，每孔加入60μl病毒抗原，加入抗原后血清的起始稀释度为1∶4；e12、f12、g12和h12每孔加入60μl病毒抗原(预先加入60μlpbst)，作为4个病毒抗原对照孔。轻微振荡反应板，用封板膜封板，置3℃孵育90分钟。
5.3.3用洗涤液连续清洗包被酶标板3～5次，在吸水纸上拍干。将血清/病毒抗原反应板上的血清/病毒抗原混合液和病毒抗原对照液转移到酶标板上的对应孔内，100μl/孔，用封板膜封板，置37℃孵育30分钟。
5.3.4用洗涤液将酶标板连续洗板3～5次，在吸水纸上拍干。加入豚抗-生物素工作液100μl/孔，用封板膜封板，置37℃孵育30分钟。
5.3.5用洗涤液将酶标板连续洗板3～5次，在吸水纸上拍干。加入hrp-sa工作液100μl/孔，用封板膜封板，置37℃孵育10分钟。
5.3.6洗板3～5次，在吸水纸上拍干，加入tmb底物溶液，每孔50μl，置37℃孵育10～15分钟。
5.3.7每孔加入终止液50μl，终止反应。
5.3.8在酶标仪上读取od450nm值。
5.4结果判定
5.4.1试验成立条件
口蹄疫a型病毒抗原对照至少2个孔的od492nm值在1.0～2.0范围内；口蹄疫a型阴性对照血清抗体效价应小于1∶8；口蹄疫a型阳性对照血清抗体效价应在1∶512～1∶2048之间。
5.4.2血清抗体效价
抗体效价是以50％终点稀释度表示，以抗原对照孔平均od450nm值的50％为临界值。待检血清孔od450nm值大于临界值的为阴性孔，小于、等于临界值的为阳性孔。待检血清阳性孔的最高稀释度，为该份血清的抗体效价，血清最终稀释度用karber法计算(下表)。
karber法计算公式：㏒x＝n﹣d(s﹣0.5)x表示血清抗体效价；n＝全为阳性孔的最高稀释度的对数值(从出现阴性孔的上一稀释度开始计算)；d＝稀释倍数的对数值；s＝各稀释度阳性孔比率总和(从出现阴性孔的上一稀释度开始计算)。
5.4.3判定
牛、羊血清抗体效价≥1∶128，判为口蹄疫a型抗体阳性；猪血清抗体效价≥1∶64，判为口蹄疫a型抗体阳性。
6.附2015版《兽药典》口蹄疫病毒亚洲1型抗体液相阻断elisa检测试剂盒说明书。
口蹄疫病毒亚洲1型抗体液相阻断elisa检测试剂盒说明书兽用非处方药。
【兽药名称】
通用名称：口蹄疫病毒亚洲1型抗体液相阻断elisa检测试剂盒
商品名称：无
英文名称：liquid-phaseblockingelisakitfordetectingfoodandmouthdiseasevirustypeasia1antibodies汉语拼音：koutiyibingduyazhouyixingkangtiyexiangzuduanelisajianceshijihe
【主要成分与含量】elisa板(1块，已包被口蹄疫亚洲1型兔抗血清)；口蹄疫亚洲1型病毒抗原(2瓶，6ml/瓶，工作浓度1:6)；口蹄疫亚洲1型豚鼠抗血清(1管，70μl/管，工作浓度1:1000)；兔抗豚鼠igg-辣根过氧化物酶结合物(1管，70μl/管，工作浓度1:1000)；3％双氧水(1管，1ml/管)；口蹄疫亚洲1型阳性对照血清(1管，已稀释浓度1:8，1ml/管)；口蹄疫亚洲1型阴性对照血清(1管，1ml/管)；96孔血清/病毒抗原反应板(2块)；底物缓冲液(1瓶，50ml/瓶)；25倍浓缩洗涤液(25×pbst，3瓶，60ml/瓶)；豚鼠抗血清稀释液(1瓶，50ml/瓶)；终止液(1瓶，50ml/瓶)；邻苯二胺片剂(opd，1片，20mg/片)；封板膜(10张)；移液槽(5个)；使用说明书(1份)。
【性状】密封完好、无破损、无渗漏。包被elisa板、口蹄疫亚洲1型病毒抗原、口蹄疫亚洲1型豚鼠抗血清、兔抗豚鼠igg-辣根过氧化物酶结合物、3％双氧水、口蹄疫亚洲1型阳性对照血清、口蹄疫亚洲1型阴性对照血清、25倍浓缩洗涤液、豚鼠抗血清稀释液、终止液、底物缓冲液、邻苯二胺片剂等组分齐全。
【作用与用途】用于检测牛、羊和猪等偶蹄动物血清中口蹄疫亚洲1型病毒抗体，适用于动物疫苗免疫抗体检测。
【用法与判定】
1试剂配制(临用前配制)
1.1洗涤液取25倍浓缩洗涤液(pbst)1份，加去离子水或蒸馏水24份混合，即为工作浓度洗涤液。
1.2包被缓冲液(0.05mol/lna2co3/nahco3，ph9.6)取碳酸盐缓冲液胶囊1粒，溶于100ml去离子水中，充分溶解。贴标签，置2～8℃保存，30天内使用完。
1.3底物溶液先将试剂盒的底物缓冲液片溶于100ml去离子水中，然后，取该溶液50ml，加入邻苯二胺(opd)1片。充分溶解，定量(5.0ml/瓶)分装，-20℃以下避光保存。使用时的配比为每1.0ml溶液加入试剂盒内3％双氧水(h2o2)10μl。
1.4其他试剂口蹄疫亚洲1型病毒抗原、豚鼠抗血清和兔抗豚鼠igg-辣根过氧化物酶结合物，均按标签注明的工作浓度，分别用洗涤液、豚鼠抗血清稀释液和洗涤液，稀释即成。
1.5待检血清样品稀释将待检血清和洗涤液按体积比(1∶1)混合。1.6口蹄疫亚洲1型阳性对照血清稀释将口蹄疫亚洲1型阳性血清和洗涤液按体积比(1∶3)混合。
2操作步骤
2.1用包被缓冲液将口蹄疫亚洲1型兔抗血清稀释至工作浓度，加入酶标板(96孔/板)，50μl/孔，用封板膜封板，室温过夜。
2.2按样品布局(以10份样品为例)，在96孔“u”型板上，a1、a2...a10孔加入待检血清，每孔50μl，每份血清作2个重复，2倍连续稀释，起始为1∶4，每孔加入50μl病毒抗原，加入抗原后血清的起始稀释度为1∶8；a11孔加入阳性对照血清50μl，2倍连续稀释至h11，起始为1∶8，每孔加入50μl病毒抗原，加入抗原后血清的起始稀释度为1∶16；a12孔加入阴性对照血清50μl，2倍稀释至b12，起始为1∶2，每孔加入50μl病毒抗原，加入抗原后血清的起始稀释度为1∶4；e12、f12、g12和h12每孔加入100μl病毒抗原，作为4个病毒抗原对照孔。轻微振荡反应板，用封板膜封板，置2～8℃过夜。
2.3用洗涤液连续清洗包被酶标板5次，在吸水纸上拍干。将血清/病毒抗原反应板上的血清/病毒抗原混合液和病毒抗原对照液转移到酶标板上的对应孔内，50μl/孔，用封板膜封板，置37℃孵育60分钟。
2.4用洗涤液将酶标板连续洗板5次，在吸水纸上拍干。加入稀释好的工作浓度的口蹄疫亚洲1型豚鼠抗血清，每孔50μl，用封板膜封板，置37℃孵育60分钟。
2.5洗板5次，在吸水纸上拍干，加入稀释好的工作浓度的兔抗豚鼠igg-辣根过氧化物酶结合物，每孔50μl，用封板膜封板，置37℃孵育60分钟。
2.6洗板5次，在吸水纸上拍干，加入底物溶液，每孔50μl，置37℃孵育15分钟。
2.7每孔加入终止液50μl，终止反应。
2.8在酶标仪上读取各孔的od492nm值。
3结果判定
3.1试验成立条件口蹄疫亚洲1型病毒抗原对照至少2个孔的od492nm值在1.0～2.0范围内；口蹄疫亚洲1型阴性对照血清抗体效价应小于1∶8；口蹄疫亚洲1型阳性对照血清抗体效价应在1∶512～1∶2048之间。
3.2血清抗体效价抗体效价是以50％终点稀释度表示，以抗原对照孔平均od492nm值的50％为临界值。待检血清孔od492nm值大于临界值的为阴性孔，小于、等于临界值的为阳性孔。待检血清阳性孔的最高稀释度，为该份血清的抗体效价，血清最终稀释度用karber法计算(下表)。
karber法计算公式：㏒x＝n﹣d(s﹣0.5)x表示血清抗体效价；n＝全为阳性孔的最高稀释度的对数值(从出现阴性孔的上一稀释度开始计算)；d＝稀释倍数的对数值；s＝各稀释度阳性孔比率总和(从出现阴性孔的上一稀释度开始计算)。
3.3判定
3.3.1若血清抗体效价不低于1∶128，判为口蹄疫亚洲1型抗体阳性。
3.3.2若血清抗体效价接近1∶128，判为可疑。可重检1次。
【注意事项】
(1)试剂盒应2～8℃冷藏运输。
(2)解冻的opd溶液加入双氧水后要1次用完，剩余不能重复使用。
(3)病毒抗原冻融次数不能超过3次。
【规格】10个96孔板/盒
【贮藏与有效期】口蹄疫亚洲1型病毒抗原在–20℃以下保存，试剂盒其余组分在2～8℃保存，有效期均为6个月。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。