一种基于单原子纳米酶的多重免疫比色病毒检测方法

技术领域：

本发明公开一种基于单原子纳米酶多重免疫比色病毒检测的新方法。具体涉及一种具有类过氧化物酶催化活性纳米酶的制备以及一种基于单原子纳米酶的多重免疫比色病毒检测新技术的开发。

背景技术：
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新冠病毒由感染至症状浮现之间的病毒潜伏期一般情况下由1至14天不等。现阶段，新冠病毒的检测以核酸检测为主，作为目前新型冠状病毒检测的“金标准”，核酸检测具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点，但操作复杂且成本高，成为应对现阶段新冠病毒疫情发展过程中的挑战。如何发展操作便捷、检测迅速、更易于基层实验室展开筛查工作的新型病毒检测技术具有十分现实的应用意义。

纳米酶作为一种低成本、高稳定性、性质可调的新型诊疗制剂，因具备纳米材料独特性质与天然酶活性备受关注。单原子纳米酶是一种将单原子技术与纳米酶类酶活性的活性位点相结合的新型纳米酶。原子级分散的金属中心最大限度地提高了原子利用率以及活性位点密度。更重要的是，清晰的配位结构为类酶活性机理的研究提供了极大的便利。研究表明，单原子纳米酶活性中心的种类以及空间构型极大影响其催化活性，杂化不同种类的金属原子中心，可以对单原子纳米酶的活性以及选择性进行定向设计，或可实现协同的催化效果。因此，近年来单原子纳米酶在生物医学领域快速发展。与传统纳米酶相比更高的催化活性，使单原子纳米酶有望为开发快速、高效的病毒检测技术提供新手段。

前期研究中对以金属zn为活性中心的单原子纳米酶pmcs构效关系的深入剖析，首次利用密度泛函理论(densityfunctionaltheory,dft)计算揭示了该单原子纳米酶的配位不饱和锌位点及其催化机理。并证明缺陷位点的增多以及单原子分散级zn的增加都会大大提升其类酶活性。然而，决定单原子纳米酶催化活性的关键因素是金属中心种类。

金属元素fe相比于其他金属元素价格低廉易得，且铁元素是许多蛋白的活性中心，以单原子fe为催化活性中心的纳米酶能更好地模拟天然酶的催化过程更靠近天然酶催化活性，且制备得到的铁单原子纳米酶具有高比表面积、大孔径和易官能化等特点，可实现抗covid-19igm和lgy特异性蛋白的高效吸附和负载；单原子纳米酶表现出，利用单原子纳米酶优良的类过氧化物酶活性放大酶催化反应，通过对酶底物的显色反应，不仅可以实现新冠病毒的快速检测，还可通过酶底物的显色程度实现lgm和lgg的动态变化监测，从而对患者病毒发展阶段进行追踪。

技术实现要素：

针对以上思考我们利用金属有机框架材料zif-8作为前驱体，制备得到具有明确活性中心的铁单原子纳米酶，提升铁单原子占比，进而提升催化性能。利用所制备的单原子纳米酶开发基于单原子纳米酶的多重免疫比色病毒检测新技术。

1.一种基于单原子纳米酶的多重免疫比色病毒检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

i单原子纳米酶的合成

以表面包覆二氧化硅的沸石咪唑类骨架材料(zif-8)为碳载体，在其表面嵌入单原子铁，制备出具有过氧化物酶活性的单原子纳米酶；

ii单原子纳米酶检测试纸条制备

单原子纳米酶通过吸附负载抗covid-19igm和lgy特异性蛋白

iii单原子纳米酶多重免疫比色病毒检测

利用纳米酶对底物tmb的显色反应快速检测新冠病毒。

2.进一步，步骤i中涉及

(1)zif-8制备

将浓度为0.05～0.2mol/l的六水合硝酸锌溶液以及0.1～0.5mol/l的2-甲基咪唑溶液以溶质摩尔比为1:4～5混合，搅拌1～4h，离心洗涤；其中，六水合硝酸锌以及2-甲基咪唑溶剂为无水甲醇或无水乙醇；

(2)zif-8@msio2的制备

将步骤(1)中样品重分散于体积分数为20％的甲醇水溶液中，加入十六烷基三甲基溴化铵ctab溶液，室温搅拌0.5～4h，然后加入正硅酸乙酯teos，继续反应0.5～4h；反应结束后先后用甲醇以及水洗涤，制得zif-8@msio2，烘干备用；其中体积分数为20％的甲醇水溶液ph预先用碱调至8～13，ctab溶液浓度为0.001～0.006mol/l，teos加入后终浓度为0.01～0.04mol/l；

(3)碳载体zn-mcn的制备

将步骤(2)中制得的zif-8@msio2在氮气氛围下，高温900～1200℃碳化0.5～5h，用碱去硅，水洗至ph为6.5～7.5，制得碳载体zn-mcn；其中，碱浓度为0.1～10m；

(4)nc-fe-glu的制备

取步骤(3)中碳载体zn-mcn30～90mg，加入0.1～1mmol的铁盐，1～10mmol的葡萄糖，超声搅拌30min，离心洗涤后，干燥；

(5)fe-n-c的制备

将干燥后的nc-fe-glu与三聚氰胺按1:1～10质量比混合，在700～1000℃下煅烧0.5～5h，即得fe-n-c型单原子纳米酶。

3.进一步，步骤ii中涉及

(1)单原子纳米酶分别与抗covid-19igm和lgy特异性蛋白的结合

取步骤i中单原子纳米酶，用去离子水洗涤离心弃上清，重悬于ph为5～6的缓冲溶液中，并加入nhs与edc室温孵育，洗涤去除多余nhs与edc；将活化后的单原子纳米酶分别与抗covid-19igm和lgy特异性蛋白混合，在4℃条件下孵育；最后通过离心洗涤得到分别偶联抗covid-19igm和lgy特异性蛋白的单原子纳米酶；

(2)试纸条的制备

在硝酸纤维素膜的质控区中，检测线m分别用山羊抗鸡的igy抗体以及抗人igm单克隆抗体划线，检测线g用山羊抗鸡的igy抗体以及igg单克隆抗体划线，置于恒温箱中室温干燥；将步骤ii(1)中制备的偶联抗covid-19igm和lgy特异性蛋白的单原子纳米酶等量混合喷涂于结合垫上，并置于恒温箱中室温干燥；将硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫、检测线、质控线和吸收垫组装并切割为试纸条，置于塑料卡槽内，盖上盖子，干燥保存。

4.进一步，步骤iii中，在试纸条中加入含有过氧化氢的显色溶液tmb。

5.进一步，所述的fe-n-c型单原子纳米酶表现出类过氧化物酶活性，在与显色底物tmb接触后表现出肉眼可见的蓝色信号。

6.进一步，所述的碱为naoh、koh、ba(oh)2、csoh中的一种或多种。

7.进一步，所述的铁盐为硝酸铁、氯化铁、硫酸铁中的任意一种。

8.进一步，质检线c显示蓝色为有效，反则无效，需重新检测；在质检线显色情况下，检测线m、检测线g分别或同时显色，则表示阳性，检测线m以及检测线g均不显色，则表示阴性。

试纸条主要成分为硝酸纤维素膜，试纸条检测区域由样品垫(滴加待测样品)、结合垫(附有单原子纳米酶探针)、检测线(m或g)(包括有抗人igm或igg单克隆抗体)、质控线(包括有山羊抗鸡的igy抗体)和吸收垫六部分组成。待测样本滴加至样品垫上，待测样本由毛细层析作用向检测线移动，样本中有对应的抗covid-19抗体时，会与单原子纳米酶结合，经层析作用会在对应的m线或g线截留聚集。之后在试剂条上滴加酶显色底物tmb，根据显色强弱强度，判断m线和g线截留单原子纳米酶的量，进而判断阴阳性结果(有截留，材料多，其显色就更深，说明为阳性；反之亦然)。与此同时，无论igm或igg是否存在于待测样品中，一条蓝色条带都会出现在质控线区。该蓝色条带的有无为判断本次测试是否有效的条件。

附图说明

图1是制备的单原子纳米酶透射电子显微镜图

图2是单原子纳米酶试纸条检测病毒示意图

具体实施方式：

以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不仅限于下述实施方式。

实施例一(单原子纳米酶的制备)

称取3.8g的六水合硝酸锌分散于200ml无水甲醇中，5.5g的2-甲基咪唑分散于300ml无水甲醇中充分溶解。将两者混合，常温搅拌2h，离心洗涤，无水甲醇洗2遍，重分散于200ml体积分数为20％的甲醇水溶液中，用naoh调节ph至10，加入0.24g的ctab溶液，搅拌30min。逐滴滴加1ml的teos，继续反应30min。反应结束后甲醇-水-甲醇逐次洗一遍。60℃烘干。将烘干产品n2保护下，高温1000度碳化2h，用4mnaoh除去硅，水洗至中性。取碳载体60mg，加入0.25mmol的硝酸铁，4.7mmol的葡萄糖，超声搅拌30min，离心洗涤后，干燥，然后与三聚氰胺按1:4质量混合，在1000度下煅烧2h，即得。

实施例二(单原子纳米酶探针的制备)

取制备的单原子纳米酶，用ph为5.5的磷酸盐缓冲溶液配置1mg/ml的单原子纳米酶1ml，超声振荡2min，分别加入100μl20mg/ml的nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)和100μl20mg/mledc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)，混合均匀，室温条件下孵育30min，利用去离子水洗涤后出去多余的nhs和edc。将活化后的单原子纳米酶分别与100μg抗covid-19igm和lgy特异性蛋白混合，在4℃条件下孵育2h,之后加入1mltris-hcl溶液封闭活化的羧基，最后通过离心洗涤得到分别偶联抗covid-19igm和lgy特异性蛋白的单原子纳米酶，即得到单原子纳米酶探针。

实施例三(单原子纳米酶试纸检测)

在硝酸纤维素膜的质控区、检测线(m或g)分别用山羊抗鸡的igy抗体以及抗人igm或igg单克隆抗体划线，置于恒温箱中室温干燥。以浓度为1mg/ml的山羊抗鸡igy抗体在硝酸纤维素膜上划线，作为质控线；以浓度为1mg/ml的抗人igm或igg单克隆抗体分别在硝酸纤维素膜上划线，作为检测线(m或g)；将制备得到的单原子纳米酶探针喷涂于结合垫上，并置于恒温箱中室温干燥。将样品垫、结合垫、检测线(m或g)、质控线和吸收垫六部分组装，并切割为宽5mm试纸条，置于塑料卡槽内，盖上盖子，干燥保存。

实施例四(单原子纳米酶试纸检测)

如图2所示，将待测样本滴加到样品垫上，待测样品通过毛细层析作用向检测线移动。当待测样品中存在抗covid-19抗体时，样品会与带有新冠状病毒抗原的单原子纳米酶结合，经层析作用会截留在m线或g线。经过10min反应，在试纸条中滴加酶显色底物tmb，根据显色情况可判断阴性或阳性结果。同时，质控区所出现的蓝色条带是判断检测有效性的依据。