基于MOF的SERS技术检测牛奶中硫氰酸钠的方法

本发明涉及基于mof的sers技术检测牛奶中硫氰酸钠的方法，属于分析检测领域。

背景技术：

硫氰酸钠是一种广泛应用于医药、化学、印刷等领域的化工原料，同时由于其具有良好的天然抗菌作用和低廉的价格，被用作食品工业的常见防腐剂。近年来有的不法商贩为了降低牛奶灭菌成本、掩盖牛奶的劣质，选择向牛奶中添加过量硫氰酸钠，然而研究表明，过量的硫氰酸钠会阻碍人体对碘的吸收，影响甲状腺激素的产生和碘的代谢，易引发甲状腺肿，对人体健康产生危害。

目前，检测牛奶中硫氰酸钠的主要方法有：分光光度法、离子色谱法、高效液相色谱法等。尽管这些方法较成熟、准确度高，但其检测步骤大多耗时且涉及复杂的样品处理过程，或是需要专业技术人员和昂贵的成本。因此，对于牛奶中的硫氰酸钠进行简单快捷的定量检测具有重要的意义。

拉曼光谱作为常用的分子振动光谱，其检测分析法具有无损、快速、准确可靠的优点。而表面增强拉曼散射光谱(sers)技术在拉曼分析法基础上利用基底对待测物质拉曼信号的增强，极大地提高了检测的灵敏度，且检测具有非接触、低检测限等优点，目前sers技术已广泛地应用于环境、化学、医药食品等领域，也有一些学者提出使用sers技术对牛奶中硫氰酸钠进行检测，但有关的研究报道很少，且与传统检测方法相比，仍需要复杂的实验过程以制备基底及预处理且检测限不够低，导致优势不足。

金属有机骨架(mof)是一类以无机金属离子或金属簇为中心、有机配体为连接体，经过自组装而成的有机-无机杂化材料。目前mofs材料主要被广泛应用于化工、生物等领域，但由于其具有大的孔体积、高表面积、优异的吸附性能以及较高的化学稳定性的优点，也逐渐被尝试用作sers基底的构建方面，然而有关实际的sers检测应用方向的报道较少。

技术实现要素：

[技术问题]

目前检测牛奶中硫氰酸钠的主要方法有：分光光度法、离子色谱法、高效液相色谱法等。尽管这些方法较成熟、准确度高，但其检测步骤大多耗时且涉及复杂的样品处理过程，或是需要专业技术人员和昂贵的成本；而利用sers技术检测牛奶中硫氰酸钠的研究报道很少，且仍需要复杂的实验过程以制备基底及进行预处理，检测限不够低。

[技术方案]

为了解决上述至少一个问题，本发明采用在mof材料之一的mil-101(fe)表面生长的纳米银作为拉曼增强基底，在使用乙醇进行牛奶预处理的条件下，可以实现简单、快速、灵敏地定量检测牛奶中的硫氰酸钠。本发明的方法检测线性范围为0.1-2.5mg/l，检测限低至96.3μg/l，回收率为97.03％-106.46％。

本发明的第一个目的是提供一种基于表面增强拉曼技术检测牛奶中硫氰酸钠的方法，包括如下步骤：

(1)在mil-101(fe)材料表面生长纳米银，得到在mil-101(fe)材料表面生长的纳米银sers基底；

(2)将待测牛奶经过无水乙醇预处理之后离心得到上清液，之后将上清液和步骤(1)得到的sers基底混合均匀，进行拉曼检测，得到拉曼光谱；

(3)将步骤(3)得到的拉曼光谱在2110cm^-1±5cm^-1处的硫氰酸钠特征峰强度代入硫氰酸钠特征峰强度和硫氰酸钠浓度的线性模型中，得到待测牛奶中硫氰酸钠的浓度。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的mil-101(fe)材料的合成方法为：

将六水合三氯化铁和对苯二甲酸加入二甲基甲酰胺中，混合均匀，得到混合溶液；之后将混合溶液转移至加热釜中，在150℃条件下加热反应6h，冷却、离心、洗涤、干燥得到mil-101(fe)材料，其中六水合三氯化铁、对苯二甲酸、二甲基甲酰胺的用量比为0.675g：0.206g：15ml。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的mil-101(fe)材料的合成方法中离心是在10000rpm速度下离心10min；洗涤是用二甲基甲酰胺和无水乙醇各洗涤三次；干燥是在70℃下干燥3h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述在mil-101(fe)材料表面生长的纳米银sers基底的制备方法为：将mil-101(fe)(粉末)分散在硝酸银溶液中，之后加入柠檬酸钠溶液，加热还原出纳米银。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述在mil-101(fe)材料表面生长的纳米银sers基底的制备方法中mil-101(fe)和硝酸银溶液的用量比以mg/ml计为10：20-30，进一步优选为10：25。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述在mil-101(fe)材料表面生长的纳米银sers基底的制备方法中硝酸银溶液的浓度为0.5-2mm，进一步优选为1mm。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述在mil-101(fe)材料表面生长的纳米银sers基底的制备方法中硝酸银溶液和柠檬酸钠溶液的体积比为25：0.4-0.6，柠檬酸钠溶液的质量浓度为0.5-1.5％；进一步优选为硝酸银溶液和柠檬酸钠溶液的体积比为25：0.5，柠檬酸钠溶液的质量浓度为1％；。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述在mil-101(fe)材料表面生长的纳米银sers基底的制备方法中加热还原的条件为：100℃下反应1h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的待测牛奶样品和乙醇的体积比为1：1-3，进一步优选为1：1。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的上清液和sers基底的体积比为1-9：1-9，进一步优选为1-4：1-4，更进一步优选为1：1。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的无水乙醇预处理是将待测牛奶和无水乙醇混合均匀之后静置4-12min，进一步优选为4min。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的拉曼检测的条件为：利用拉曼光谱仪进行拉曼检测，拉曼光谱仪的激光功率12.5mw(100％)，激发光源波长为532nm，曝光时间为20s。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述硫氰酸钠特征峰强度和硫氰酸钠浓度的线性模型的构建方法为：

配制不同浓度的硫氰酸钠标准溶液；

将不同浓度的硫氰酸钠标准溶液和牛奶按照体积比1：9混合均匀，形成不同硫氰酸钠浓度的牛奶样品液；

按照牛奶样品液和无水乙醇按照体积比1：1混合均匀，离心得到不同硫氰酸钠浓度的上清液；

将上清液和在mil-101(fe)材料表面生长的纳米银sers基底按照体积比1：1混合均匀，静置4min，进行拉曼检测，得到不同硫氰酸钠浓度的牛奶样品液的拉曼光谱图；

根据不同硫氰酸钠浓度的牛奶样品液的拉曼光谱图中2110cm^-1±5cm^-1处的硫氰酸钠特征峰强度和硫氰酸钠浓度之间关系构建线性模型。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述硫氰酸钠特征峰强度和硫氰酸钠浓度的线性模型的构建方法中所述的标准溶液是先配置1g/l浓度的硫氰酸钠母液，之后分别取母液稀释到1、2、3、4、5、6、8、10、12.5、15、20、25、30、40、50mg/l的硫氰酸钠标准溶液。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述硫氰酸钠特征峰强度和硫氰酸钠浓度的线性模型的线性范围为0.1-2.5mg/l，标准曲线方程为y＝1349.019x+541.853，相关系数r²＝0.988，检测限低至96.3μg/l，回收率为97.03％-106.46％。

本发明的第二个目的是本发明所述的方法在食品检测领域中的应用。

[有益效果]

(1)本发明采用mil-101(fe)材料表面生长的纳米银作为拉曼增强基底，mil-101(fe)材料具有吸附特性，提高了对于硫氰酸钠分子的捕获能力，从而实现检测功能。

(2)本发明中生成的纳米银集中聚集在mil-101(fe)材料表面，产生更多热点区域，提高了纳米银的表面等离子体共振性能，从而增强了拉曼信号。

(3)本发明方法首次使用在mil-101(fe)材料表面生长的纳米银拉曼增强基底实现了对牛奶这类复杂体系中硫氰酸钠的定量检测，本方法检测简单快捷，对牛奶样品的预处理方法和检测操作简单，检测时间在10min内。

(4)本发明构建的线性模型线性范围为0.1-2.5mg/l，标准曲线方程为y＝1349.019x+541.853，相关系数r²＝0.988，检测限计算低至96.3μg/l，方法得到的回收率为97.03％-106.46％。具有好的检测准确性，对于监督牛奶中硫氰酸钠的非法添加具有重要意义。

附图说明

图1为实施例1中2110cm^-1处的硫氰酸钠特征峰强度和牛奶样品中硫氰酸钠浓度的关系点线图。

图2为实施例1中2110cm^-1处的硫氰酸钠特征峰强度和牛奶样品中硫氰酸钠浓度的线性拟合图。

图3为硫氰酸钠固体粉末和10g/l浓度的硫氰酸钠水溶液的拉曼光谱图。

图4为基于表面增强拉曼技术定量检测牛奶中硫氰酸钠的流程图。

图5为实施例3中硫氰酸钠浓度为0.5、1、1.5mg/l的牛奶的sers光谱图。

图6为实施例4中不同牛奶和无水乙醇比例的三组样品的sers光谱。

图7为实施例5中不同样品-基底混合体积比下的各组样的sers光谱。

图8为实施例6中不同硝酸银浓度的基底上测得的硫氰酸钠水溶液sers光谱。

图9为实施例7中硫氰酸钠的特征峰强度随与基底的混合时间变化的曲线图。

图10为实施例8中在mil-101(fe)材料表面生长的纳米银拉曼增强基底对三组浓度的结晶紫溶液测量得到的sers光谱图。

图11为对照例1中合成的基底对三组浓度的结晶紫溶液测量得到的sers光谱图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。实施例中提及的拉曼检测的条件为：利用拉曼光谱仪进行拉曼检测，拉曼光谱仪的激光功率12.5mw(100％)，激发光源波长为532nm，曝光时间为20s。

实施例1基底的制备

在mil-101(fe)材料表面生长的纳米银sers基底的制备方法，包括如下步骤：

(1)mil-101(fe)材料的合成：

称取0.675g六水合三氯化铁和0.206g对苯二甲酸，加入15ml二甲基甲酰胺中，搅拌溶解，得到混合溶液；之后将混合溶液转移至四氟乙烯内衬的加热釜中，置入马弗炉中，150℃条件下加热反应6h，冷却到室温得到橘黄色产物；将产物在10000rpm速度下离心10min取沉淀，并对得到的橘黄色固体沉淀分别用二甲基甲酰胺和无水乙醇各洗涤三次，在70℃下干燥3h得到橘黄色固体粉末，即mil-101(fe)材料粉末；

(2)配制浓度为1mm的硝酸银水溶液；

(3)配制浓度为1％的柠檬酸钠水溶液；

(4)在mil-101(fe)材料表面生长纳米银：

称取10mgmil-101(fe)材料粉末，加入到25ml浓度1mm的硝酸银水溶液中，搅拌分散，加热至沸腾，加入0.5ml浓度1％的柠檬酸钠水溶液，持续加热1h，得到最终混合溶液，即mil-101(fe)材料表面生长的纳米银拉曼增强基底。

实施例2模型的构建

硫氰酸钠特征峰强度和硫氰酸钠浓度的线性模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)配置1g/l浓度的硫氰酸钠母液，之后分别取母液稀释到1、2、3、4、5、6、8、10、12.5、15、20、25、30、40、50mg/l的硫氰酸钠标准溶液；

(2)不同浓度的硫氰酸钠标准溶液和牛奶按照体积比1：9混合均匀，形成不同硫氰酸钠浓度的牛奶样品液；

(3)按照牛奶样品液和乙醇按照体积比1：1混合均匀，离心得到不同硫氰酸钠浓度的上清液；

(4)将上清液和实施例1制备得到的在mil-101(fe)材料表面生长的纳米银sers基底按照体积比1：1混合均匀，静置4min，进行拉曼检测，得到不同硫氰酸钠浓度的牛奶样品液的拉曼光谱图；

(5)根据不同硫氰酸钠浓度的牛奶样品液的拉曼光谱图中2110cm^-1±5cm^-1处的硫氰酸钠特征峰强度和硫氰酸钠浓度之间关系构建线性模型。

构建的线性模型如图1和图2，从图1可以看出：随着牛奶样品中硫氰酸钠浓度的增大，硫氰酸钠特征峰强度逐渐增大，并趋向于饱和。在0.1-2.5mg/l浓度范围内线性度较好，故选择该浓度区间进行线性拟合；从图2可以看出：拟合得到的标准曲线方程为y＝1349.019x+541.853，y为2110cm^-1处的硫氰酸钠特征峰强度，x为牛奶样品中硫氰酸钠的浓度，单位为mg/l，线性区间为0.1-2.5mg/l，相关系数r²＝0.988，检测限计算低至96.3μg/l。

分别对硫氰酸钠固体粉末和10g/l浓度的硫氰酸钠水溶液测量其拉曼光谱如图3，从硫氰酸钠固体粉末的拉曼光谱图可以看出：硫氰酸钠只有两处较为明显的特征峰，分别位于753cm^-1和2069cm^-1处，而即使在浓度高达10g/l的硫氰酸钠水溶液中，753cm^-1处的特征峰强度也极弱，远远低于2069cm^-1处的特征峰强度。当硫氰酸钠被基底吸附捕获时，硫氰酸根离子吸附在纳米银agnps表面时，由于溶液中离子的吸附方式不同，特征峰峰位会由2069cm^-1偏移至2110cm^-1处。而且光谱在1800cm^-1到2500cm^-1没有其他的杂峰干扰2110cm^-1处的特征峰信号，故选取2110cm^-1处的特征峰来进行线性模型的构建。

实施例3

一种基于表面增强拉曼技术检测牛奶中硫氰酸钠的方法(如图4)，包括如下步骤：

(1)将硫氰酸钠浓度为0.5、1、1.5mg/l的牛奶分别和无水乙醇按照体积比1：1混合均匀，离心，得到上清液；

(2)将上清液和实施例1制备得到的在mil-101(fe)材料表面生长的纳米银sers基底按照体积比1：1混合均匀，静置4min，进行拉曼检测，得到牛奶的拉曼光谱图(如图5)；

(3)将步骤(2)得到的拉曼光谱在2110cm^-1±5cm^-1处的硫氰酸钠特征峰强度代入实施例2的硫氰酸钠特征峰强度和硫氰酸钠浓度的线性模型中，得到待测牛奶中硫氰酸钠的浓度。

根据上述方法，对硫氰酸钠浓度为0.5mg/l的待测牛奶样品进行检测，待测牛奶样品在特征峰2110cm^-1处的强度值为1259.9753，根据线性模型计算得到待测牛奶样品中的硫氰酸钠浓度为0.5323mg/l，回收率为106.46％；

对硫氰酸钠浓度为1mg/l的待测牛奶样品进行检测，待测牛奶样品在特征峰2110cm^-1处的强度值为1850.8361，根据线性模型计算得到待测牛奶样品中的硫氰酸钠浓度为0.9703mg/l，回收率为97.03％；

对硫氰酸钠浓度为1.5mg/l的待测牛奶样品进行检测，待测牛奶样品在特征峰2110cm^-1处的强度值为2533.9086，根据线性模型计算得到待测牛奶样品中的硫氰酸钠浓度为1.4767mg/l，回收率为98.45％；

根据结果可以看出：本发明的方法具有好的检测准确性。

实施例4牛奶和无水乙醇的比例优化

调整实施例3中牛奶和无水乙醇的体积比为3：1、2：1、1：1、1：2、1：3，硫氰酸钠的浓度为2.5mg/l，其他和实施例3保持一致。

从检测结果来看，在牛奶和无水乙醇比例为3：1和2：1时，经过充分混合以及离心的预处理操作后，无法有效地去除牛奶中的蛋白质大分子以得到上清液，说明该比例下难以对牛奶进行有效的预处理。牛奶和无水乙醇比例为1：1、1：2和1：3的三组样品，经过混合离心取上清液后，用拉曼光谱仪测量各组的sers光谱，如图6，可以看到三组sers光谱中牛奶和无水乙醇比例为1：1的组在2110cm^-1处的特征峰强度最强，峰形也较清晰，故选取1：1比例作为牛奶预处理中牛奶和无水乙醇的优化比例。

实施例5上清液和基底的比例优化

调整实施例3中上清液和在mil-101(fe)材料表面生长的纳米银sers基底的体积比例为9：1、4：1、1：1、1：4、1：9，硫氰酸钠浓度的浓度为0.5mg/l，其他和实施例3保持一致。

检测结果如图7，测量了不同样品-基底混合体积比的各组的sers光谱，对五组谱线进行对比，可以看到在比例1：1时，所测量的到的sers光谱中硫氰酸钠2110cm^-1处特征峰强度最强，说明该混合比例较适合作为检测中的优化混合比例。

实施例6硝酸银浓度比例优化

调整实施例1中硝酸银的浓度为0.5mm、1mm、2mm，分别进行合成实验，得到三组不同的mil-101(fe)材料表面生长的纳米银拉曼增强基底。

之后将三组基底用于实施例3，硫氰酸钠浓度的浓度为0.5mg/l，其他和实施例3保持一致。

以三组基底分别对0.5mg/l的硫氰酸钠水溶液进行sers光谱的测量，如图8，对比三组基底对同浓度硫氰酸钠水溶液的增强效果来看，可以看出1mm浓度的硝酸银溶液所合成的基底对0.5mg/l的硫氰酸钠水溶液的拉曼特征峰强度增强效果最好，峰形最清晰，故将基底合成实验中硝酸银溶液的浓度优选为1mm。

实施例7样品和基底混合时间的优化

鉴于牛奶是复杂体系，样品的信号信噪比比水中要差，本身存在信号的波动，影响对时间的优化探究，故选用硫氰酸钠水溶液来代替探究与基底混合随时间的变化关系，调整硫氰酸钠水溶液和基底的混合后静置时间为0-12min，硫氰酸钠溶液的浓度为2mg/l，进行拉曼检测。

检测结果如图9，分别测量了混合不同时间条件下硫氰酸钠溶液的sers光谱，记录不同混合时间对应的sers光谱2110cm^-1处的特征峰强度，绘制特征峰强度随混合时间变化的曲线图。可以看出，在前4min内，测量得到的硫氰酸钠的特征峰强度有波动，而在混合4min之后，硫氰酸钠的特征峰信号相对较为稳定，这说明基底吸附硫氰酸钠至稳定状态需要一定时间，以达到稳定的增强效果，所以进一步地将实际检测中样品和基底混合时间优选为4min。

实施例8

将实施例1得到的mil-101(fe)材料表面生长的纳米银拉曼增强基底和浓度为10^-5、10^-6、10^-7m三组浓度的结晶紫溶液按照体积比1：1混合均匀，得到样品液；之后将得到的样品液进行拉曼检测，检测结果如下：

如图10是是10^-5、10^-6、10^-7m三组浓度的结晶紫溶液在mil-101(fe)材料表面生长的纳米银拉曼增强基底上测量得到的sers光谱。通过与基底自身的谱线对比可以看出，mil-101(fe)材料表面生长的纳米银拉曼增强基底对三组浓度的结晶紫溶液的拉曼信号都有明显的增强效果，即使结晶紫在10^-7m浓度时拉曼信号强度仍然较高，说明制备合成的基底增强效果较好，适合应用于检测。

对照例1

制备mil-101(fe)材料包覆的纳米金，形成au/mil-101(fe)型基底，主要的制备合成步骤为：

将100ml质量浓度0.01％的氯金酸溶液加热至沸腾，滴加1ml浓度1mm的植酸钠溶液和700μl的质量浓度1％的柠檬酸钠溶液，保持混合液沸腾并持续搅拌75min，直至溶液变为红色，冷却至室温后在12000rpm转速下离心10min收集沉淀产物，分散在8ml二甲基甲酰胺(dmf)中；在8ml中选取2ml作为前体液，和8ml浓度15mm的六水合三氯化铁的dmf溶液混合，超声10min，所得混合液在12000rpm下离心10min，取沉淀并重分散在2mldmf中，和8ml浓度15mm的对苯二甲酸的dmf溶液混合，超声10min，12000rpm下离心10min，取沉淀并重分散在10ml超纯水中，得到au/mil-101(fe)型基底。

之后将au/mil-101(fe)型基底和浓度为10^-5、10^-6、10^-7m三组浓度的结晶紫溶液按照体积比1：1混合均匀，得到样品液；之后将得到的样品液进行拉曼检测，检测结果如下：

如图11是10^-5、10^-6、10^-7m三组浓度的结晶紫测量得到的sers光谱，但从sers光谱对比来看，所合成的au/mil-101(fe)型基底只能在10^-5m浓度时能够观察得到结晶紫的拉曼信号，且相较于10^-5m浓度结晶紫溶液的常规拉曼光谱信号强度增强很小，说明此方法制备的基底增强效果不佳，不适合用于检测。

对照例2

替换实施例3中的牛奶预处理试剂无水乙醇为乙腈和三氯乙酸，其他和实施例3保持一致。

对硫氰酸钠牛奶样品的实际测试结果表现为：检测不到硫氰酸钠在2110cm^-1处的特征峰信号。乙腈的拉曼信号较强，会盖过硫氰酸钠的拉曼信号，而三氯乙酸酸性较强会破坏mil-101(fe)材料的构型进而破坏基底，最终导致硫氰酸钠的检测效果差，故实际检测中采用无水乙醇作为牛奶的预处理试剂较为合适。

对照例3

文献(zhangzy,liuj,wanghy.microchip-basedsurfaceenhancedramanspectroscopyforthedeterminationofsodiumthiocyanateinmilk[j].analyticalletters,2015,48(12):1930-1940.)公开了一种由琼脂糖微芯片支撑的sers基底对牛奶中的硫氰酸钠进行检测。

方法具体为：

(1)将0.6g琼脂糖粉末和30ml水混合，加热至沸腾，得到热溶液；并将热溶液浇铸在聚二甲基硅氧烷(pdms)模具上，冷却至室温后以去离子水冲洗，制成的微芯片有16个宽度为4毫米、深度为4毫米的均匀孔；

(2)将1ml质量浓度6％硝酸银溶液与2ml去离子水混合，并添加质量浓度3.2％的氢氧化钾溶液，直到形成细小的棕色沉淀；之后逐滴添加氢氧化铵，直到沉淀物完全溶解，再添加质量浓度6％的硝酸银溶液，直到溶液变成浅棕色/黄色；然后加入一滴氢氧化铵溶液，溶液再次变透明；该溶液与1ml质量浓度35％的葡萄糖溶液和0.5ml甲醇混合，得到混合溶液；

(3)将30μl步骤(2)得到的混合溶液添加到步骤(1)得到的琼脂糖微芯片的孔中，并使其在35℃下反应1小时，得到改性后的微芯片；

(4)将步骤(3)得到的改性后的微芯片用去离子水冲洗作为sers基底使用。sers测量时，将10μl经三氯乙酸预处理的硫氰酸钠加标牛奶样品添加到基于琼脂糖微芯片的sers基底的孔中。液体蒸发后，用拉曼光谱仪测量基底孔的sers光谱。拉曼光谱仪激光功率450mw，激发波长785nm，曝光时间10s。

选取2100cm^-1处的拉曼特征峰进行硫氰酸钠的定量检测，得到检测限为5×10^-7g/ml，线性区间为5×10^-7-2.5×10^-6g/ml。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。