一种蜡样芽孢杆菌免疫胶体金快速检测试纸条及其制备方法

1.本发明涉及微生物检测的技术领域，特别涉及一种蜡样芽孢杆菌免疫胶体金快速检测试纸条。


背景技术：

2.蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)是一种革兰氏阳性菌，可引起人和动物患病。据国家食源性疾病监测网的数据分析，我国每年发生数十起蜡样芽孢杆菌食物中毒事件，约占细菌性食物中毒事件总数的11.4％，造成数百人发病，而这个数字可能远低于实际发生中毒的人数。蜡样芽孢杆菌感染可引起恶心、呕吐、腹痛、腹泻等，严重者可引起电解质紊乱、出血性腹泻。该致病菌主要存在于米制品、肉制品、乳制品等成品及其半成品中。在食物的生产、加工和运输中，由于交叉感染，易导致蜡样芽孢杆菌感染事件的大规模爆发。因此，蜡样芽孢杆菌的检测至关重要。
3.目前，蜡样芽孢杆菌检测主要依赖于国标规定的传统培养法及生化鉴定，其被视为蜡样芽孢杆菌检测的金标准，但是，检测周期长、操作繁琐，不适合大量样品的检测。此外，实验室常用的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)进行蜡样芽孢杆菌的检测，其灵敏度高，但是依赖专业的设备和操作人员且操作时间较长。免疫学检测由于其检测周期短、操作简便、灵敏度较高，近年来成为发展迅速的检测手段。但是，我国目前尚未拥有可以用于蜡样芽孢杆菌快速检测的产品。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的不足之处，本发明的目的是提供一种蜡样芽孢杆菌免疫胶体金快速检测试纸条，可用于检测蜡样芽孢杆菌的免疫原，检测的灵敏度高。为了实现根据本发明的上述目的和其他优点，提供了一种蜡样芽孢杆菌免疫胶体金快速检测试纸条，包括：
5.pvc底板、设置于所述pvc底板上的样品垫、与所述样品垫相邻设置的结合垫及与所述结合垫相邻设置的吸水垫；
6.所述金标垫与衬垫之间设置有硝酸纤维素膜层；
7.所述结合垫上设置有检测线与质控线。
8.优选的，所述检测线及质控线设置于所述硝酸纤维素膜层上，且检测线靠近样品垫，质控线靠近吸水垫。
9.优选的，所述检测线和结合垫上胶体金标记的单克隆体抗体，其单克隆抗体由保藏号为2b9的杂交瘤细胞株分泌产生，所述质控线由羊抗鼠抗体构成。
10.优选的，所述与胶体金偶联的单克隆体抗体中的制备的胶体金粒径为30
‑
40nm，胶体金与单抗的质量体积比为36μg/ml，胶体金偶联抗体和构成检测线的抗体为同一单克隆抗体。
11.一种蜡样芽孢杆菌免疫胶体金快速检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
12.s1、进行胶体金的制备；
13.s2、确定胶体金标记抗体最优ph；
14.s3、确定胶体金偶联抗体的最佳结合量；
15.s4、对抗体进行胶体金标记；
16.优选的，所述步骤s1包括：
17.s11、取氯金酸粉末加入灭过菌的双蒸水，配成氯金酸溶液；
18.s12、取二合水柠檬酸三钠，溶解到，双蒸水中配成柠檬酸三钠溶液，现配现用；
19.s13、双蒸水的烧瓶中，调节磁力搅拌器温度到150℃，搅拌速率为500rpm，加热至沸腾，立即加入氯金酸，沸腾15s，充分搅拌同时迅速加入1％的柠檬酸三钠，停止加热，冷却至室温，分装后避光保存。
20.本发明与现有技术相比，其有益效果是：本发明提供的蜡样芽孢杆菌免疫胶体金试纸条，由于采用了新筛选的配对单克隆抗体分别设置于检测线和金标垫，结果表明可以检测蜡样芽孢杆菌的免疫原，且检测的灵敏度较高。
附图说明
21.图1为根据本发明的蜡样芽孢杆菌免疫胶体金快速检测试纸条的三维结构示意图；
22.图2为根据本发明的蜡样芽孢杆菌免疫胶体金快速检测试纸条的胶体金的紫外吸收光谱图；
23.图3为根据本发明的蜡样芽孢杆菌免疫胶体金快速检测试纸条的单克隆抗体偶联胶体金的ph结果；
24.图4为根据本发明的蜡样芽孢杆菌免疫胶体金快速检测试纸条的单克隆抗体与胶体金偶联结合量结果；
25.图5为根据本发明的蜡样芽孢杆菌免疫胶体金快速检测试纸条的检测免疫原蜡样芽孢杆菌的灵敏度结果图；
26.图6为根据本发明的蜡样芽孢杆菌免疫胶体金快速检测试纸条的检测其他18株食源性致病菌(非蜡样芽孢杆菌)的交叉反应结果图。
具体实施方式
27.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.参照图1
‑
6，一种蜡样芽孢杆菌免疫胶体金快速检测试纸条10，包括：衬垫、设置于所述衬垫上的样品垫14、与所述样品垫14相邻设置的金标垫13及与所述金标垫13相邻设置的吸水垫11；
29.所述金标垫13与衬垫之间设置有硝酸纤维素膜层12；
30.所述结合垫上设置有检测线16与质控线15。
31.进一步的，所述检测线16及质控线15设置于所述硝酸纤维素膜层12上，且检测线
16靠近样品垫14，质控线15靠近吸水垫11。
32.进一步的，所述检测线和结合垫13上的胶体金偶联的单克隆抗体，其单克隆抗体由保藏号为2b9的杂交瘤细胞株分泌产生，所述质控线15由羊抗鼠抗体构成。
33.进一步的，所述与胶体金偶联的单克隆体抗体中的制备的胶体金粒径为30
‑
40nm，胶体金与单抗的质量体积比为36μg/ml，胶体金偶联抗体和构成检测线16的抗体为同一单克隆抗体。
34.检测原理为：当样品滴加到样品垫上时，随着层析作用，样品沿着样品垫、金标垫、硝化纤维素膜、吸水纸的方向层析。若样品中含有目标细菌，目标菌与金标垫上的胶体金偶联的单克隆抗体结合，形成胶体金偶联抗体—细菌复合物，此复合物流经检测线时，被检测线的单克隆抗体所捕获，形成胶体金偶联单克隆抗体—细菌—捕获抗体的三元复合物，使检测线出现可视化的颜色；随着继续层析，此三元复合物被质控线上的羊抗鼠抗体捕获，质控线呈现可视化的颜色。若样品不含目标细菌，当样品流经金标垫时，胶体金偶联的单克隆抗体随样品层析，最终到达质控线，被质控线的羊抗鼠抗体捕获，质控线呈现可视化的颜色。结果判读为：阳性样品既显示检测线又显示质控线，阴性样品只显示质控线。
35.本发明人的研究表明，以蜡样芽孢杆菌免疫balb/c小鼠，经杂交瘤融合、杂交瘤筛选得到保藏号为2g10f6g6b9的杂交瘤细胞株，记作2b9，此杂交瘤细胞株可经小鼠腹腔培养，并提取得到单克隆抗体。
36.一种蜡样芽孢杆菌免疫胶体金快速检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
37.s1、进行胶体金的制备；
38.s2、确定胶体金标记抗体最优ph；
39.s3、确定胶体金偶联抗体的最佳结合量；
40.s4、对抗体进行胶体金标记；
41.进一步的，所述步骤s1包括：
42.s11、取氯金酸粉末加入灭过菌的双蒸水，配成氯金酸溶液；
43.s12、取二合水柠檬酸三钠，溶解到，双蒸水中配成柠檬酸三钠溶液，现配现用；
44.s13、双蒸水的烧瓶中，调节磁力搅拌器温度到150℃，搅拌速率为500rpm，加热至沸腾，立即加入氯金酸，沸腾15s，充分搅拌同时迅速加入1％的柠檬酸三钠，停止加热，冷却至室温，分装后避光保存。
45.使用的蜡样芽孢杆菌菌株如表1所示。
46.表1本发明所用蜡样芽孢杆菌菌株
[0047][0048]
使用的其它食源性致病菌(非蜡样芽孢杆菌)菌株如表2所示。
[0049]
表2本发明所用其它食源性致病菌
[0050][0051][0052]
主要试剂：
[0053]
bsa、peg、tween
‑
20来自sigma；氯金酸来自上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜(nc膜)135smillipore；羊抗鼠、hrp
‑
羊抗鼠生工生物工程股份有限公司。
[0054]
主要仪器：
[0055]
酶标仪spectramaxm2购自molecular devices；nanodrop 2000c购自thermo scientific；点样仪ad6010购自bio
‑
dot；扫描仪phantomv9购自microtek；恒温培养摇床sph
‑
100b购自上海世平；单人净化工作台sw
‑
sj
‑
2d型购自苏州净化。
[0056]
实施例1蜡样芽孢杆菌单克隆抗体的制备
[0057]
1.免疫原的准备
[0058]
蜡样芽孢杆菌在lb肉汤中培养18
‑
24h，随后进行pcr鉴定，用灭菌的pbs洗涤菌液三次，并调节其浓度使od
600nm
为0.6。
[0059]
2.单克隆抗体的制备过程
[0060]
1)实验动物：选3只6
‑
8周龄、体重25g左右、雌性balb/c小鼠为实验动物。
[0061]
2)免疫方法：每只小鼠腹腔注射0.4ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一次。
[0062]
3)采血：3次免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。
[0063]
4)细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞以5：1的比例在50％peg作用下常规融合，随后铺于于96孔酶标板，置于37℃、5％co2培养箱培养。
[0064]
5)杂交瘤细胞筛选:采用hat进行杂交瘤细胞的筛选，采用有限梯度稀释法进行杂交瘤细胞亚克隆，亚克隆2次后改为ht培养基进行筛选，采用间接非竞争酶联免疫法测定，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞，经过3～4次亚克隆，直至阳性率达到100％。将最终的阳性杂交瘤细胞扩大培养后冻存于液氮中，即得到了杂交瘤细胞株。
[0065]
6)抗体制备：将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的balb/c小鼠腹腔，每只2
×
106个杂交瘤细胞，8～10天小鼠腹部隆起，收集腹水，用辛酸—硫酸铵法从小鼠腹水中制备抗体。
[0066]
筛选出1株稳定分泌蜡样芽孢杆菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2g10f6g6b9(简称2b9)，分别进行亚型鉴定、浓度和效价测定。
[0067]
3.单克隆抗体的亚型鉴定
[0068]
通过单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测定抗体亚型，结果表明抗体2b9的亚型为igg1。
[0069]
4.单克隆抗体的纯度及效价测定
[0070]
腹水经辛酸
‑
硫酸铵法制备得到单克隆抗体，通过nanodrop 2000c测得浓度为2.0mg/ml。
[0071]
单克隆抗体效价测定的步骤如下：
[0072]
1)将饱和培养细菌抗原连同培养基在对应的孔中加入100μl，4℃过夜或37℃、2h。
[0073]
2)倒空液体并拍干残留液体，用200μl洗涤液清洗3次。
[0074]
3)每个孔中加200μl3％的脱脂奶粉，37℃封闭2h。
[0075]
4)倒空液体并拍干残留液体，用200μl洗涤液清洗3次。
[0076]
5)每个孔中加100μl的抗体，37℃孵育1h。
[0077]
6)倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加200μl洗涤液洗涤3次。
[0078]
7)每个孔中10μl的hrp标记的二抗(sigma)，37℃孵育1h。
[0079]
8)倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加200μl洗涤液洗涤3次。
[0080]
9)每个孔中加100μl底物，显色30min，加终止液50μl并立即在od
450nm
读数。
[0081]
测定的抗体效价为1：32000。
[0082]
实施例2蜡样芽孢杆菌免疫胶体金试纸条的制备
[0083]
1.胶体金的制备过程
[0084]
1)1％氯金酸的配制：取1g氯金酸粉末，加入100ml灭过菌的双蒸水，配成1％氯金酸溶液，放4℃备用。
[0085]
2)1％柠檬酸三钠配制：取0.5679g二合水柠檬酸三钠，溶解到50ml双蒸水中，配成1％柠檬酸三钠溶液，现配现用。
[0086]
3)采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，198ml双蒸水的烧瓶中，调节磁力搅拌器温度到150℃，搅拌速率为500rpm，加热至沸腾(约100℃)，立即加入1％氯金酸2ml，沸腾15s，充分搅拌同时迅速加入3ml1％的柠檬酸三钠，计时10min，停止加热，冷却至室温，分装后4℃避光保存。
[0087]
2.胶体金试纸条抗体最优ph的确定
[0088]
分别取100μl胶体金溶液于96孔板8个孔中，加入0.2mol/l碳酸钾调整溶液ph，加入量分别为0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1μl，每孔加入5μl浓度为2.0mg/ml的单克隆抗体。反应10min，各孔加入10μl10％nacl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，重复三次。
[0089]
图2中从左到右的孔中碳酸钾依次为0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1μl。由图2得知，当碳酸钾为0.6μl/100μl胶体金时，离心管中胶体金颜色最红，即此添加量是单抗2b9偶联胶体金的最佳ph。
[0090]
3.胶体金偶联抗体的最佳结合量的确定
[0091]
调节胶体金溶液ph至上述中得到的各抗体偶联的最佳ph值，各取100μl于96孔板中，按表3加入各抗体，反应5min，各孔加入10μl10％nacl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，重复三次，取颜色最红且抗体用量最少的为最小结合量xμg/ml，为保证胶体金完全与抗体结合，则以x+x
×
20％为最佳结合量。
[0092]
表3抗体与胶体金偶联最佳结合量
[0093][0094]
图3中从左到右的孔中添加的抗体质量/金溶液体积依次为0、3、7.5、15、30、45、60、75ul，当抗体质量/金溶液体积由7.5μg/ml增加至15μg/ml时，胶体金颜色变红变深，抗体添加量≥30μg/ml时，颜色保持红色基本不变，即2b9最小结合量为30μg/ml，则其最佳结合量为36μg/ml。
[0095]
4.抗体的胶体金标记
[0096]
胶体金ph调节至最佳ph值，按步骤(2)中确定的最佳结合量吸取抗体以40μl/min的速度滴加到胶体金溶液中，同时在磁力搅拌器上搅拌，待抗体加完后继续搅拌1h，加入金溶液1/10体积的含10％bsa的pb溶液，搅拌1h，移入离心管1000rpm离心10min，小心吸取上清至新离心管，将上清12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用重悬液以原胶体金溶液1/10体积的量重悬，混合均匀后4℃保存备用。以原胶体金溶液1/10体积的量重悬，混合均匀后4℃保存备用，如需保存较长时间，可加入0.3％叠氮化钠。
[0097]
将步骤4中制备好的金标抗体分别喷涂于检测试纸条的金标垫上，记为2b9
‑
aunp
‑
pad将浓度为2.0mg/ml的抗体2b9包被于硝酸纤维素膜12上作为test line，即检测线，也称t线。包被方法采用常规实验方法。以羊抗鼠抗体作为金标单抗试纸条的control line，即质控线线，也称c线。然后，组装试纸条。
[0098]
6.蜡样芽孢杆菌免疫胶体金试纸条灵敏度实验
[0099]
将培养好的蜡样芽孢杆菌菌液用lb肉汤培养基依次稀释至107、106、105、104cfu/ml，不同浓度菌液均以100μl滴加至试纸条的样品垫上，进行检测，并重复三次。
[0100]
挑取蜡样芽孢杆菌单菌落于培养基中，置于37℃摇床培养12h，平板菌落计数算得纯菌液浓度为1.1
×
107cfu/ml，由图5可知，滴加浓度为107、106、105、104cfu/ml菌液后，试纸条t线显色，滴加104cfu/ml菌液t线无显色，说明试纸条检测灵敏度可达105cfu/ml，三次重复结果均为105cfu/ml，灵敏度稳定性较好。
[0101]
7.蜡样芽孢杆菌免疫胶体金试纸条交叉反应实验
[0102]
用制备好的试纸条检测18株培养至108cfu/ml的其它食源性致病菌(非蜡样芽孢杆菌)并观察结果。
[0103]
图6是本发明实例中蜡样芽孢杆菌免疫胶体金检测18株其它食源性致病菌(非蜡样芽孢杆菌)的交叉反应结果。
[0104]
由图6可知，100μl浓度为108cfu/ml的18株其他食源性致病菌(非蜡样芽孢杆菌)的菌液滴加到样品垫后，t线均未显色。结果表明，该试纸条与其他食源性致病菌无交叉反
应
[0105]
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的，对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
[0106]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。